CC BY
5
ПОЛУЧЕНИЕ 3D МОДЕЛИ КОЖИ ПУТЕМ СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ И КЕРАТИНОЦИТОВ
А.Ю. Полянская1, EP. Павлова1, 2, М.В. Волкова1 В.В. Бояринцев1, А.В. Трофименко1, Г.И. Фильков1, Д.В. Багров2, 3, Д.В. Клинов1 2, М.О. Дурыманов1
1 НИУ Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет), Долгопрудный, Россия
2 НИИ физико-химической медицины ФМБА ул. Малая Пироговская, Москва, Россия
3 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: polyanskaya.ayu@phystech.edu
Ключевые слова: 3D модель кожи, фибробласты, кератино-циты, дифференцировка клеток, эпидермис.
Разработка 3D моделей кожи и исследование их свойств является актуальной задачей, поскольку на данный момент во многих странах запрещено тестирование косметических средств на животных, а также импорт и продажа косметики, содержащей ингредиенты, протестированные на животных [1, 2]. Эквиваленты кожи, полученные путем совместного культивирования фибробластов и кератиноцитов могут быть использованы для этих целей, также для тестирования лекарственных препаратов, изучения механизмов биологических процессов в коже [3].
Целью данной работы является получение 3D модели кожи путем совместного культивирования фибробластов и кератиноцитов, а также изучение дифференцировки кератиноцитов методом иммуногистохимии криосрезов.
Для получения 3D модели использовали первичные фибробласты и кератиноциты, которые были выделены из кожи новорожденных мышей возрастом 1 день. Результаты по идентификации клеток путем иммуноги-стохимии и проточной цитометрии показали, что чистота популяций составила более 90%.
Результаты иммуногистохимии образцов 3D моделей, которые были получены на 5 и 10 день культивирования на границе среда/воздух свидетельствуют о наличии в эквивалентах кожи маркеров, характерных для фибробластов (виментин), базальных кератиноцитов (цитокератин 5),кератиноцитов на начальных стадиях дифференцировки (цитокератин 10), а также терминально дифференцированных клеток эпидермиса (лорикрин). Наличие рогового слоя установлено уже на 5й день культивирования, что говорит о том, что кератиноциты в составе полнослойного эквивалента кожи в течение этого срока уже достигают терминального уровня дифференцировки. Полученная 3D модель обладает анатомической организацией схожей с нативной кожей мыши. В образцах, которые культивировали 10 дней на границе среда/воздух, по сравнению с эквивалентами, полученными после 5 дней культивирования, наблюдали увеличение рогового слоя, а также увеличение числа кератиноцитов, экспрессирующих цитокератин 10.
Литература:
1. Roshangan L, Soleimani Rad J, Kheirjou R et al. Wounds 2019. V. 31. P. 308-315.
2. Vivchanenko V, Wojcik M, Pnzekona A. Cells. 2020. V. 9(5), P. 1185.
3. Niehues H, Bouwstna J.A, El Ghalbzouni A et al. Exp Dermatol. 2018. V. 27(5). P. 501-511.
ВЛИЯНИЕ LPA И Y-27632 НА СРЕДНЮЮ СКОРОСТЬ МИГРАЦИИ КЛЕТОК FETMSC, НАХОДЯЩИХСЯ НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ РЕПЛИКАТИВНОГО СТАРЕНИЯ
А.В. Полянская, А.С. Мусорина, Г.Г. Полянская, Д.Е. Бобков
Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: polyanskaya.nastya18@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, актино-вый цитоскелет, репликативное старение, малые ГТФазы Rho, клеточная подвижность.
Оценка подвижности мезенхимных стволовых клеток (МСК) в процессе долговременного культивирования, сопровождающегося репликативным старением (РС), является важным шагом для их эффективного применения в регенеративной медицине. Малая ГТФаза RhoA регулирует организацию актинового цитоскелета, а следовательно, определяет характер подвижности немышечных клеток. Нижестоящим эффектором RhoA является ROCKI-киназа, которая способствует формированию стресс-фибрилл.
Целью работы было исследование роли RhoA в регуляции подвижности МСК человека, находящихся на разных стадиях РС. Было изучено влияние активатора RhoA —лизофосфатидной кислоты (LPA) и ингибитора ROCK1-киназы (Y-27632) на подвижность клеток в культуре.
Использовали клеточную линию FetMSC, выделенную из костного мозга эмбриона человека. Линия была получена из ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ИНЦ РАН. Для измерения скорости клеток на пассажах 12, 16, 20 и 26 анализировали треки клеточных движений, записанные в течение 24 ч с помощью системы прижизненной конфокальной микроскопии. Результаты показали отсутствие достоверных отличий средней скорости контрольных клеток на изученных пассажах.
На 12 пассаже средние скорости клеток под действием модуляторов были ниже и достоверно отличались от контроля (23,1 ± 5,1 рм/ч), а также различались между собой — наименьшая скорость была у клеток, которые находились под действием Y-27632 (12,04 ± 2,6 рм/ч). На 1 6 пассаже средняя скорость клеток во всех трех группах статистически не отличалась. На 20 пассаже достоверно снизилась только средняя скорость клеток под действием LPA. На 26 пассаже средняя скорость клеток, относительно контроля (20,8 ± 6,8 рм/ч) достоверно снизилась: 17,1 ± 6,8 рм/ч — под действием LPA, 18,15 ± 5,2 рм/ч — под действием Y-27632.
Результаты демонстрируют, что репликативное старение FetMSC сопровождается изменением чувствительности клеток к действию LPA и Y-27632.
ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ, ЦИТОКИНО-ВОГО ПРОФИЛЯ И ГЕНОВ ПЛЮРИПОТЕНТ-НОСТИ В КЛЕТКАХ КОЛОНОСФЕР ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ОПУХОЛЕВЫМИ И СТВОЛОВЫМИ ВЕЗИКУЛАМИ
А.С. Пономарев, З.Е. Гилазиева, А.А. Ризванов, В.В. Соловьева
НИЛ «OpenLab Гэнные и клеточные технологии», Казань, Россия
e-mail: l.ponomarev2013@gmail.com
Ключевые слова: колоносферы, мембранные везикулы, опухолевые клетки, мезенхимные стромальные клетки.
Внеклеточные везикулы представляют собой мембранные структуры, играющие важную роль в межклеточных коммуникациях, поскольку они обладают способностью транспортировать липиды, факторы транскрипции, мРНК и белки. Имеются данные об особой роли везикул в прогрессировании рака. Поэтому изучение влияния везикул на опухолевые сфероиды имеет важное значение. Целью данной работы является изучение влияния мембранных везикул, индуцированных цитохалазином В (иМВ), на сфероиды колоректального рака in vitro.
В этом исследовании для создания опухолевых сфероидов использовали клеточную линию колоректального рака (HCT-15). Клеточная линия глиобластомы (SNB-19) и мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (МСК), были использованы для выделения МВ. Везикулы из SNB-19 (SNB-19 иМВ) и МСК (МСК иМВ) выделяли с использованием 10 мкг/мл цитохалазина В и серии последовательных центрифугирований. Добавление SNB-19 иМВ и иМВ МСК к сфероидам осуществляли в концентрациях 1, 2 и 5 мкг. Влияние SNB-19 иМВ и иМВ МСК анализировали с использованием проточной цитоме-трии, мультиплексного анализа и ПЦР в реальном времени.
После добавления МСК иМВ не было значительного изменения жизнеспособности клеток в сфероиде. Однако при добавлении иМВ SNB-19 в колоносферу наблюдалось дозозависимое повышение жизнеспособности клеток. Уровни мРНК OCT4 и Nanog повышались после добавления SNB-19 иМВ, но снижались после добавления иМВ МСК. Цитокиновый анализ показал значительные различия в 40 основных цитокинах в колонос-ферах с SNB-19 иМВ и МСК иМВ.
Таким образом, показано возможное влияние SNB-19 иМВ и МСК иМВ на опухолевые сфероиды. Необходимы дальнейшие исследования эффектов этого механизма. Данное исследование выполнено в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда 21-74-10021. Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.
ТКАНЕВОЙ ЭКВИВАЛЕНТ ЭНДОКРИННОГО ОТДЕЛА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
А.С. Пономарева, Н.В. Баранова, А.О. Никольская, З.З. Гоникова, И.А. Милосердов, В.И. Севастьянов
ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: a.s.ponomareva@gmail.com
Ключевые слова: тканевой эквивалент поджелудочной железы, островки Лангерганса, тканеспецифический биома-трикс, децеллюляризация.
Одним из направлений технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины для лечения сахарного диабета 1 типа является создание тканевого эквивалента эндокринного отдела поджелудочной железы (ПЖ) на основе тканеспецифического биоматрикса (ДПЖ матрикса) из децеллюляризованной панкреатической ткани [1]. Сохранение в ДПЖ матриксе структурных, биохимических и биомеханических свойств нативного ВКМ при максимально полном удалении клеточного материала позволяет имитировать микроокружение, способствующее пролонгированной функции жизнеспособных островковых клеток in vitro и in vivo [2].
Цель работы: исследовать влияние ДПЖ матрикса на инсулинпродуцирующую функцию жизнеспособных островков Лангерганса (ОЛ) крысы и человека.
Материалы и методы. ДПЖ матрикс получали в результате децеллюляризации фрагментов ПЖ крысы (Vistar) и человека с применением поверхностно-активных веществ при различных режимах обработки панкреатической ткани. ОЛ крысы и человека выделяли, используя традиционную модифицированную методику с использованием коллагеназы, и культивировали в монокультуре (контрольные группы Ккр и Кч) и в присутствии ДПЖ матрикса (опытные группы Окр и Оч). Жизнеспособность ОЛ определяли методом флуоресцентного окрашивания витальным красителем, секреторную способность — методом иммуноферментного анализа (ИФА). Изменения концентраций инсулина в опытных группах оценивали относительно контрольных групп.
Результаты исследования. ОЛ, культивированные с ДПЖ матриксами, не проявляли признаков фрагментации и деградации, оставаясь жизнеспособными в течение всего срока наблюдения (7 суток) по сравнению с монокультурой ОЛ. Базальная концентрация инсулина в опытных группах Окр повышалась по сравнению с контрольной группой Ккр на 48,7%, 102,9% и 373,6% на первые, третьи и шестые сутки культивирования, соответственно. Базальная концентрация инсулина в опытных группах Оч на первые сутки культивирования возрастала на 39,5% по сравнению с контрольной группой Кч, а на четвертые и седьмые — на 55,3% и 68,1%, соответственно. Предварительные результаты экспериментов in vivo, полученные на малой выборке лабораторных животных, подтвердили функциональную эффективность тканевого эквивалента ПЖ на основе ДПЖ матрикса и ОЛ крысы при внутрибрюшинном введении.
Заключение. Выявлено позитивное влияние аллоген-ных тканеспецифических биоматриксов на жизнеспособность ОЛ. В экспериментах in vitro и in vivo показана принципиальная возможность создания тканевого эквивалента эндокринного отдела ПЖ.
Литература:
1. Damodaran R.G., Vermette P. et. al. J Tissue Eng Regen Med.
2018. V. 12 (5). Pp 1230-1237.
2. Sevastianov V.l., Baranova N.V., Kirsanova L.A. et. al. J Gene
Engg Bio Res. 2021. V. 3 (2). Pp 17-25.
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ И ФОРМИРОВАНИЕ МЕЗОТЕЛИЯ НА ПОВЕРХНОСТИ АЦЕЛЛЮЛЯРНОГО МАТРИКСА ПРИ ИМПЛАНТАЦИИ НА ДЕСЕРОЗИРОВАННУЮ СТЕНКУ ЖЕЛУДКА КРЫСЫ
Ю.В. Пономарева1, Н.Н. Сарбаева1,
В.И. Белоконев2, М.Н. Милякова1, М.В. Королев3
1 ООО «АРТБИО», Самара, Россия
2 ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, Самара, Россия
3 ЧУОО ВО Медицинский университет «Реавиз», Самара, Россия
e-mail: artbio_com@mail.ru
Ключевые слова: децеллюляризация, ацеллюлярный дер-мальный матрикс, мезотелий, спаечная болезнь брюшной полости.
Для снижения числа осложнений (спаечной болезни, свищей, инкапсуляции), связанных с имплантацией
