CC BY
116
4. Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., Гросс Г.Д. и др. 6. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и // Вестник аритмологии. 2002. № 28. С. 67-78. др. // Окислительный стресс. Прооксиданты и анти-
5. Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., Смагин Г.Н. // оксиданты. М.: Слово, 2006. 556 с.
Эксперим. и клинич. фармакология. 2002. №2. С. 70-75.
□ □□
УДК 615.451.16.001.8
П.Б. Цыдендамбаев, A.A. Дутов, Б.С. Хышиктуев, С.М. Николаев, A.B. Савин
ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ЭКСТРАКТАХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ МЕТОДОМ ВЭЖХ
Читинская государственная медицинская академия, г. Чита
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в настоящее время является чрезвычайно перспективным методом, позволяющим в достаточной степени надежно исследовать закономерности удерживания труднолетучих и термолабильных соединений. Такие исследования приобретают особое значение при анализе биологических объектов и биологически активных веществ. К последним относятся флавоноиды, содержащиеся в лекарственных растениях, такие как дигидрокверцетин (ДКВ) и дигид-рокемпферол (ДКФ). Эти соединения обладают широким спектром биологической активности, включая антиоксидантную, противоопухолевую, противоаллергическую, противовоспалительную, капилляроук-репляющую, гепатопротекторную [4,6,7,10-13] и др. Оценка содержания флавоноидов в экстрактах лекарственных растений позволяет получить ценную информацию относительно перспектив использования растительного сырья в Фарминдустрии.
Цель работы — оптимизация условий анализа флавоноидов ДКВ и ДКФ с помощью ВЭЖХ и количественная оценка их содержания в экстрактах лекарственных растений.
Материалы и методы
Объектами изучения служили экстракты лекарственных растений, входящих в прописи препаратов тибетской медицины [5]: пятилистника кустарникового (ПК) (Penthaphylloides fruticosa), бадана толстолистного (БТ) (Bergenia crassifolia), горечавника бородатого (ГБ) (Gentianopsis barbata), шлемника байкальского (ШБ) (Scutellaria baicalensis), зопника клубненосного (ЗК) (Phlomis tuberosa), девясила высокого (ДВ) (Inula helenium), шиповника даурского (ШД) (Rosa dahurica Pall), облепихи крушиновидной
Резюме
В работе предлагается методика одновременного количественного определения флавоноидов дигидрокверце-тина и дигидрокемпферола с помощью обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии в экстрактах лекарственных растений. Показано преимущество метода по сравнению с описанными в литературе.
Р.В. Tsydendambaev, А.А. Dutov, B.S. Khyshiktuev, S.M. Nikolaev, A.V. Savin
HPLC ANALYSIS OF THE FLAVONOIDS IN EXTRACTS OF MEDICINAL PLANTS
Chita State Medical Academy, Chita Summary
The objective of the paper is to show synchronous quantitative determination technique of dihydroquercetin and dihydrokempferol flavonoids in the extracts of medicinal plants with reversed-phase high-performance liquid chromatography. The advantages of this technique compared with all previously described ones are presented in the paper.
(ОК) (ШррорЬае rhanmoides) и подорожника большого (ПБ) (Plantago пгарпв).
Стандарт ДКВ (массовая доля не менее 99,0%, сопутствующего флавоноида дигидрокемпферола не более 5,7%) предоставлен ООО НЦПИ "Биотехпром", (г. Москва). Базовый раствор стандарта (10 мг/мл) готовили на 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,45), рабочий получали разбавлением базового до концентрации
Содержание ДКВ и ДКФ в экстрактах лекарственных трав, мкг/г (М±т)
Экстракты ДКВ ДКФ
ШБ 13537,0+14,6 420,1±4,9
ГБ 4943,7±7,13 19,2±0,7
ОК 2898,4±9,2 16,3±0,9
ПБ 2025,4±8,5 30,4±1,1
ШД 1103,6±6,9 6,68±0,3
БТ 1052,1 ±10,9 48,9±0,6
дв 792,2± 12,1 11,6±0,5
ЗК 248,5+8,7 5,76+0,2
ПК 159,7±7,3 11,1±0,5
100 мкг/мл. Для построения калибровочной кривой готовили растворы стандарта от 10 до 100 мкг/мл. Эти-лацетатные экстракты растений, полученные в лаборатории Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ), растворяли в том же буфере (10 мг/мл). Объем вводимого в петлю инжектора стандарта — 2 мкл, пробы — 10 мкл. Анализ проводили на хроматографе "Irica" (Япония), колонка 100 4 мм с диасфер С16 5 мкм, 5000 ТТ ("БиоХимМак", г. Москва) + предколонка с C(g 43 мм ("Phenomenex", USA), УФ-детекция при 290 нм, элюент ацетонитрил — 0,0025 М NaH2PC4 (рН 3,0) - изопропанол (30 : 69 : 1 v/v), скорость потока 600 мкл/мин, давление 40 бар. Параметры используемых фосфатного буфера и мобильной фазы (молярность, рН, соотношение) определены экспериментальным путем, при которых регистрировали максимальную точность и минимальное соотношение сигнал/шум, что позволило улучшить предел детекции определяемого вещества по сравнению с методами, описанными в литературе [2,9].
Для регистрации хроматограмм использовался про-граммно-аппаратный комплекс "Multichrom for Windows" ("Амперсенд", Россия). Сопоставление времени удерживания пиков на хроматограмме испытуемых образцов с временем удерживания стандарта позволило идентифицировать в них искомые вещества. Регистрировали пики и рассчитывали концентрацию ДКВ и ДКФ в экстрактах по высоте пиков стандарта. Время удерживания пиков стандарта (200 нг): ДКВ — 3,39+0,2 мин, ДКФ - 5,12±0,2 мин; высота пика ДКВ - 19,7+0,9 мВ, ДКФ - 1,66+0,6 мВ. Время удерживания пика ДКВ проб - 3,43±0,2 мин, ДКФ - 5,25±0,2 мин. Высота пиков различная в зависимости от содержания флавоноидов в пробах. Ширина пиков искомых веществ стандарта и пробы составила 0,4+0,03 мин. Предел детекции — 10 нг/мл (сигнал/шум=3).
Измерение каждого образца проводили пятикратно. Анализ полученных данных проведен методом вариационной статистики.
Результаты и обсуждение
Ранее содержание флавоноидов исследовали различными методами [2, 9]. Способ И.В. Воскобойни-ковой исоавт. (1992) имеет следующие недостатки [2]:
1) недостаточно чувствителен за счет того, что в качестве одного из компонентов элюента используют водный раствор уксусной кислоты (70% по объему), который обладает высокой оптической плотностью и
увеличивает соотношение сигнал/шум, что вызывает снижение точности определения ДКВ;
2) длительность проведения анализа за счет того, что указанный компонент увеличивает вязкость элюента, что, в свою очередь, приводит к увеличению времени анализа, кроме того, снижается срок службы колонки за счет создания высокого давления данным компонентом элюента. Способ Е.П. Храмовой (2004) за счет необходимости экстрагирования ДКВ на концентрирующем патроне "Диапак С16" удлиняет время исследования [9]. Кроме этого, метод недостаточно чувствителен, так как в качестве элюента применяется 48% метанол, использование которого обусловливает широкие пики [8], что существенно затрудняет расчеты концентрации и снижает точность определения. В дополнение, при использовании подвижной фазы с большим содержанием метанола на колонке с диаметром 2 мм резко увеличивается давление, что неблагоприятно действует на колонку, уменьшая срок ее службы.
Предлагаемый способ отличается от вышеуказанных тем, что для анализа применяется этилацетатный экстракт растения, что позволяет получить экстракты особой чистоты и значительно продлить срок эксплуатации колонки. В нашем способе в качестве элюента использовался именно подобный раствор, так как: а) применение ацетонитрила позволяет получать высокие и узкие пики, что повышает чувствительность и точность способа, а метанол обусловливает широкие "размытые" пики; б) изопропанол применяется в качестве стабилизатора времени удерживания, так как чем стабильнее время удерживания, тем специфичнее идентификация вещества. Таким образом, предлагаемый способ является более точным, быстрым, нетрудоемким и обладает высокой воспроизводимостью.
Предложенным методом определена концентрация флавоноидов в изучаемых экстрактах (таблица). Результаты экспериментов показали, что значительным содержанием ДКВ отличаются экстракты ШБ и ГБ (13,5 и 4,94 мг/г соответственно). Меньше всего ДКВ обнаружено в экстрактах ПК и ЗК. По количеству ДКФ лидирующую позицию занимает шлемник байкальский — 420 мкг/г, а также бадан — почти 49 мкг/г экстракта. Минимальные значения этого показателя зарегистрированы у ШД и ЗК. Воспроизводимость способа оценивали по значению коэффициента вариации (V): К=(5/М) 100%,
где Б — среднеквадратическое отклонение, М — средняя арифметическая. Коэффициент вариации (V) способа составил 9,1%.
Имеются данные о гепатопротекторной, мембра-ностабилизирующей и антиокислительной активности ШБ [1,3], основу которых, кроме прочих, может составлять высокое содержание флавоноидов.
Выводы
1. Разработан быстрый, достаточно воспроизводимый метод количественного определения ДКВ и ДКФ в этилацетатных экстрактах лекарственных растений, который может быть использован в целях стандартизации препаратов на основе данных флавоноидов.
2. Предложенным методом оценено содержание ДКВ и ДКФ в изучаемых образцах. Наиболее богаты
ими экстракты шлемника байкальского и горечавни-ка бородатого.
Литература
1. Ажунова Т. А. // Акт. пробл. фармакол. и поиска новых лекарств, препаратов. Томск, 1987. С. 70-72.
2. Воскобойникова И.В., Геодакян C.B., Тюкавки-на H.A. и др. // Фармация. 1992. №6. С. 74-75.
3. Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Литвиненко В. И. и др. Шлемник байкальский: фитохимия и фармакологические свойства. Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1994. 223 с.
4. Колхир В.К., Тюкавкина H.A., Быков В.А. и др. // Хим. фарм. журнал. 1995. №9. С. 61-64.
5. Мат-лы по изучению традиционной системы индо-тибетской медицины. Новосибирск: Наука, 1982.102 с.
6. Тарасова Е.А. // Практическая фитотерапия. 1999. №1. С. 37-41.
7. Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. // Вопросы питания. 1997. №6. С. 12-15.
8. Хефтман Э. Хроматография: практическое приложение метода / Пер. с англ. М.: Мир, 1986.
9. Храмова Е.П. // Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2004: Мат-лы VII конф. С. 154.
10. Вгоппег С., Landry Y. // Agents Actions. 1985. Vol. 16(3-4), P. 147-151.
11. Chu S.C., Hsieh Y.S., Lin J.Y. //J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55 (2), P. 179-183.
12. Kandaswami C., Perkins E., Drzewiecki G. et al. // Anticancer Drugs. 1992. Vol. 3 (5), P. 525- 530.
13. Schwarz A., Middleton E.Jr. // Immunopharmacology. 1984. Vol. 7(2). P. 115-126.
□ □□
УДК 612.397.811
Г.Н. Чернобельский, О.Н. Новокрещенный, O.A. Лебедько, E.H. Сазонова
СОЗДАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ С УСИЛЕННЫМИ АНТИОКСИДАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ
Дальневосточной государственного медицинский университет; ООО "ГРИГ Чернобельского", г. Хабаровск
Создание функциональных продуктов является важнейшим направлением нутрициологии, позволяющим решить проблему дисбалансов в рационе современного человека. Оздоравливающие продукты с заданными свойствами могут быть эффективными средствами популяционной профилактики наиболее социально значимых патологий [7,16].
Ранее мы сообщали о выпуске серии функциональных мясных продуктов с пониженным содержанием жира и холестерина для первичной и вторичной профилактики атеросклероза [9]. Существенным звеном многих патологических состояний человека, включая реакцию организма на неблагоприятные факторы внешней среды, является оксидативный стресс. В клинике широко используются лекарственные средства антиоксидантного действия. Вместе с тем, реальностью становится поступление в организм существенного количества свободных радикалов с продуктами длительного хранения. Известно, что длительное хранение замороженного мяса приводит к значительному повышению концентрации продуктов перекисно-го окисления липидов (ПОЛ) [13, 15]. Накопление
продуктов ПОЛ является основной причиной повышения жесткости белка при хранении [10]. Для снижения интенсивности процессов пероксидации мы включили в рецептуру новых разрабатываемых мясных продуктов биологически активную пищевую добавку селенит натрия, а также источник природных токоферолов — орех кедровый. Целью проводимого исследования было сопоставление антиоксидантных свойств новых продуктов в системе in vitro.
Материалы и методы
Осуществляли анализ процессов свободноради-кального окисления в исследуемых продуктах методом хемилюминесценции (ХМЛ). Регистрацию ХМЛ проводили на люминесцентном спектрометре LS 50В "PERKIN ELMER". Стандартизацию сигнала и математическую обработку кривых ХМЛ выполняли с помощью программы Finlab.
Спонтанную и индуцированную Fe2+ ХМЛ исследовали по методу Ю.А. Владимирова и соавт (1991). Определяли: светосумму за 1 мин спонтанной ХМЛ (S,), величина которой коррелирует с интенсивнос-
