CC BY
75
Химия растительного сырья. 2011. №1. С.45-48.
УДК 668.411:674.032.14:547.972
ФЕНОЛЬНЫЕ ПРИМЕСИ В АРАБИНОГАЛАКТАНЕ ИЗ ДРЕВЕСИНЫ ЛИСТВЕННИЦЫ
© Е.Н. Медведева , Л.А. Остроухова, Н.А. Неверова, Н.А. Онучина, В.А. Бабкин
Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033 (Россия) e-mail: woodemed@irioch.irk.ru
Методами УФ-спектроскопии, ТСХ и ВЭЖХ установлено, что арабиногалактан, выделяемый промышленным способом из древесины лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина, в качестве примесей содержит низкомолекулярные флавоноиды, в основном, дигидрокверцетин, а также полимер дигидрокверцетина и таннины. Предложена методика определения содержания таннинов в образцах арабиногалакгана.
Ключевые слова: арабиногалактан из древесины лиственницы, флавоноиды, полимер дигидрокверцетина, таннины, УФ-спектроскопия, тонкослойная хроматография, ВЭЖХ,
Введение
Водорастворимый полисахарид арабиногалактан (АГ) характеризуется комплексом уникальных свойств, обусловливающих его практическую значимость для медицины, пищевой и косметической промышленности, сельского хозяйства [1].
Разработанная лабораторией химии древесины ИрИХ СО РАН технология промышленного выделения арабиногалакгана из древесины лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина позволяет получать сухой продукт высокой степени чистоты (содержание основного вещества 95-97%) [2, 3]. Выделенный АГ представляет собой порошок кремового цвета, водные растворы его имеют коричневую окраску. Данные УФ-спектров свидетельствуют о наличии в промышленном образце полисахарида фенольных примесей, так как очищенный на полиамидном сорбенте АГ не поглощает в УФ и видимом спектральном диапазоне [4].
Для получения на основе АГ медицинских препаратов необходима дополнительная очистка продукта от этих примесей. Решение данной проблемы невозможно без определения природы сопутствующих веществ.
Цель настоящей работы - установление природы фенольных примесей в арабиногалактане, получаемом промышленным способом, и разработка методики их определения.
Экспериментальная часть
Для исследований использовали арабиногалактан (образец I), полученный на опытно-промышленной установке [5]. 100 г АГ (I) растворяли в 250 мл воды и экстрагировали этилацетатом (4 х 200 мл), экстракт выпаривали под ваккумом и высушивали при 105 °С. Выход полученного образца (II) от массы исходного продукта - 1,15%. Часть водного раствора АГ после экстракции этилацетатом сушили при 105 °С (образец III), из отставшегося раствора выделяли АГ высаживанием в пятикратный объем этанола (образец IV). Полученный продукт дополнительно очищали переосаждением (образец V).
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли с использованием пластинок Silicia gel 60 F254. Хроматограммы развивали в системе «хлороформ - метанол» (4 : 1). Обнаружение веществ на хроматограммах проводили реагентами, дающими с анализируемыми веществами окрашенные соединения либо флуоресценцию в УФ-свете: а) диазотированную сульфаниловую кислоту (ДСК, 0,1 г в 20 мл 10%-ного раствора NaHCO3), б) 5%-ный раствор AlCl3 в 50%-ном этиловом спирте.
Обращенно-фазная ТСХ выполнялась на пластинках Сорбтон-2 в системе «ацетонитрил - 2%-ный водный раствор уксусной кислоты» (2 : 3), проявитель - 5%-ный раствор AlCl3 в 50%-ном этаноле.
* Автор, с которым следует вести переписку,
Анализ методом ВЭЖХ проводили в следующих условиях: хроматографическая система: Agilent 1200 с УФ-детектором и с обращенно-фазной колонкой; колонка - Silasorb C18 5цш, 100*2.0 mm; подвижная фаза - ацетонитрил в 2%-ной уксусной кислоте (3 : 7, об.); скорость потока подвижной фазы - 0,1 мл/мин; петля - 20 ці.
Количественное содержание дигидрокверцетина (ДКВ) определяли ВЭЖ хроматографией в приведенных условиях методом внешнего стандарта с использованием в качестве образца сравнения Государственного стандартного образца ДКВ (ФС 42-3853-99).
УФ-спектры 0,002-0,1%-ных водных растворов образцов получены на спектрометре Perkin Elmer UV/VIS в области 200-700 нм (толщина слоя 10 мм). ИК-спектры регистрировали в таблетках с KBr на спектрофотометре Specord 75IR в интервале 500-4000 см-1.
Суммарное содержание флавоноидов определяли по интенсивности поглощения их комплексов с хлоридом алюминия [6] при 400 нм на спектрофотометре Юнико S2100.
Определение таннинов в образцах арабиногалактана. Навеску 10 мг абсолютно сухого АГ растворяли в 10 мл дистиллированной воды. Содержание таннинов определяли, измеряя оптическую плотность поглощения полученного раствора на спектрофотометре Юнико S2100 при 440 нм относительно дистиллированной воды при толщине просвечивающего слоя 1 см. В качестве эталона использовали таннины, выделенные из коры лиственницы. Готовили 0,05%-ный раствор таннинов в 50%-ном водном этаноле, аликвоты этого раствора
0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,7 мл разбавляли дистиллированной водой до 10 мл. Для калибровки использовали значения оптической плотности поглощения эталонных растворов при 440 нм.
Обсуждениерезультатов
Исходный АГ (I) имеет характерный для фенольных соединений УФ-спектр: интенсивный максимум поглощения в области 200-203 нм, плечо в области 230 нм, максимум в области 280-290 нм. Спад поглощения в спектре наблюдается до 600 нм. Данные УФ-спектров исследованных образцов приведены в таблице 1. Наиболее интенсивное поглощение в указанных областях проявляется в спектре примесей, выделенных из промышленного АГ экстракцией этилацетатом (образец II). На ТС-хроматограммах этого образца хорошо определяются дигидрокверцетин и дигидрокемпферол (сравнение с аутентичными образцами). Однако значительная часть соединений остается на старте и не проявляется хлористым алюминием, что свидетельствует об их нефлавоноидной природе.
Для предварительного установления природы сопутствующих флавоноидам соединений применили ТСХ на пластинках с обращенной фазой. В изученных условиях на хроматограмме наблюдалось три пятна, имеющие большие, чем дигидрокверцетин и дигидрокемпферол, значения Rf, но также относящиеся к фенолам (желтые пятна при проявлении ДСК). Подвижность сопутствующих веществ в данной системе свидетельствует об их большей гидрофильности, чем индивидуальных флавоноидов, и, следовательно, о возможности их изучения методом ВЭЖХ на обращенной фазе.
На хроматограммах ВЭЖХ, регистрируемых при длине волны 280 нм, отчетливо видны пики дигидрокверцетина, дигидрокемпферола и эриодиктиола (рис. 1, пики 4-6).
Одновременно на хроматограмме наблюдается группа неразрешенных пиков, имеющих меньшее время удерживания. Так как экстинкция дигидрокверцетина при 280 нм значительно превышает удельное поглощение сопутствующих примесей, были записаны хроматограммы исследуемой смеси при длине волны 250 нм (Xmin для ДКВ). На хроматограмме (рис. 2, пики 1-3) хорошо видны пики трех близких по природе соединений, характеризующихся меньшим временем удерживания, а следовательно, большей растворимостью в воде и, вероятно, судя по их подвижности на обращенной фазе, большей молекулярной массой.
Таблица 1. Содержание примесей в промышленном образце АГ по данным УФ-спектров (концентрация растворов 0,1%, толщина слоя 1 см)
Образец Оптическая плотность, нм Содержание (%)
230 285 400 440 флавоноидов таннинов
Исходный АГ (I) Сухой остаток этилацетатного 1,34* 0,88* 1,32 0,33 0,75 25,6 2,70 13,08
экстракта (II) Сухой остаток раствора АГ после 0,66 0,39 0,08 0,05 0,17 2,07
экстракции этилацетатом (III) АГ, высаженный из раствора по- 0,33 0,16 0,02 0,04 0,09 0,65
сле экстракции этилацетатом (IV) Переосажденный образец IV (V) 0,28 0,13 0,02 0,01 0,07 0,69
Измерено при концентрации раствора 0,01% и толщине слоя 0,3 см
Определенное по данным ВЭЖХ содержание ДКВ в сухом экстракте (образец II) составляет 12,8%, а сопутствующих низкомолекулярных флавоноидов - 0,71%. В пересчете на исходный АГ (образец I) суммарное содержание этих соединений составляет 0,16%. Однако при определении содержания в этих образцах флавоноидов спектрофотометрическим методом получены более высокие значения (табл. 1).
Известно, что в процессе переработки древесины лиственницы по технологии [7], наряду с низкомолекулярными флавоноидами, выделяется значительное количество полимера дигидрокверцетина [8], который образует комплекс с хлоридом алюминия и поэтому определяется спектрофотометрическим методом, наряду с низкомолекулярными флавоноидами.
Полученные результаты позволяют предположить, что в качестве примеси в АГ, наряду с низкомолекулярными флавоноидами, присутствует полимер ДКВ.
Анализ УФ-спектров АГ после обработки этилацетатом (образец III) показал, что значительная часть фенольных примесей экстракцией не удаляется. Очистка полимера переосаждением из воды в этанол или ультрафильтрацией позволяет практически полностью удалить дигидрокверцетин и другие низкомолекулярные фенольные соединения [3, 9], однако при этом окрашивающие примеси остаются в продукте (табл. 1, образцы IV, V). Это может свидетельствовать как о высокомолекулярной природе этих примесей, так и о наличии химической связи их с макромолекулами полисахарида. Ранее [3] на основании анализа литературных данных [10] мы предполагали, что окраска АГ обусловлена в основном примесями лигнина, который связан с АГ в лигноуглеводный ком -плекс и поэтому не удаляется указанными методами. Однако в УФ-спектрах лигнина, взятого в качестве модельного соединения, поглощение в области 380-600 нм не наблюдается (табл. 2).
Анализ УФ-спектров аутентичных соединений (лигнина, поли-ДКВ, а также таннинов, выделенных из коры лиственницы; табл. 2) с использованием метода добавок свидетельствует о том, что поглощение в области 400 нм в УФ-спектрах анализируемых образцов АГ обусловлено в основном наличием примесей поли-ДКВ и таннинов, а в области 440-600 нм - только таннинов. Как и лигнин, таннины не образуют комплексов с А1С13. Поли-ДКВ не имеет окраски, следовательно, окрашивающие вещества в АГ можно отнести к танни-нам. Об этом также свидетельствуют положительные качественные реакции с желатином и солями железа (III), служащие для обнаружения таннинов. Исследование ВЭЖ-хроматограмм аутентичных образцов таннинов подтверждает эти выводы. Наличие на хроматограмме (рис. 2) нескольких пиков свидетельствует о сложном молекулярном составе таннинных примесей.
125 тУ 4
Рис. 1. ВЭЖ-хроматограмма фенольных примесей в арабиногалактане (280 нм)
Рис. 2. ВЭЖ-хроматограмма фенольных примесей в арабиногалактане (250 нм)
Таблица 2. Данные УФ-спектров растворов модельных соединений (концентрация растворов 0,02%; d = 1 см)
Образец Оптическая плотность, нм
285 400 440
дкв 1,20* нет нет
Полимер ДКВ 1,21* 0,6 0,01
Таннины 0,31* 0,34 0,40
Лигнин 0,20* нет Нет
*Измерено при концентрации раствора 0,002%.
Полученные результаты позволили усовершенствовать метод определения таннинов [11] применительно к арабиногалактану. По разработанной методике содержание таннинов в АГ определяется прямым фотоколориметрированием водных растворов анализируемых образцов при 440 нм. Для калибровки используются таннины, выделенные из коры лиственницы. Предложенная методика проста и может применяться в условиях заводской лабора -тории для контроля качества арабиногалактана. Результаты определения таннинов в образцах приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что ни экстракцией, ни переосаждением полностью удалить таннины из образцов АГ не удается. Основываясь на полученных ранее данных [12, 13], это можно объяснить способностью арабиногалактана к образованию прочных межмолекулярных комплексов.
Выводы
1. Методами УФ-спектроскопии, ТСХ, ВЭЖХ, а также качественными реакциями установлено, что основными примесями в промышленном арабиногалактане лиственницы являются низкомолекулярные и полимерные флавоноиды, а также таннины.
2. Предложена методика определения таннинов в арабиногалактане.
Авторы выражают благодарность Н.Н. Чипаниной и А.М. Шулуновой за помощь в работе.
Список литературы
1. Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Остроухова Л.А. Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы использования // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 27-37.
2. Патент №2256668 (РФ). Способ получения арабиногалактана / В.А. Бабкин, Л.Г. Колзунова, Е.Н. Медведева, Ю.А. Малков, Л.А. Остроухова / БИ. 2005. №20.
3. Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Макаренко О.А., Николаев С.М., Хобракова В.Б., Шулунова А.М., Федорова Т.Е., Еськова Л.А. Получение высокочистого арабиногалактана лиственницы и исследование его иммуномодулирующих свойств // Химия растительного сырья. 2004. №4. С. 17-23.
4. Антонова Г.Ф., Тюкавкина Н.А. Получение высокочистого арабиногалактана из древесины лиственницы // Химия древесины. 1976. №4. С. 60-62.
5. «ФиброларС» (Арабиногалактан). Сырье для изготовления биологически активных добавок к пище. ТУ 9363021-39094141-08. Сан.-эпид. закл. № 77.99.03.003.Т.001137.05.08 от 29.05.2008 г.
6. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The Systematic Identification of Flavonoides. Springer-Verlag, Berlin; Heidelberg; New York, 1970. 631 p.
7. Бабкин B.A., Остроухова Л.А., Иванова C.3., Иванова Н.В., Медведева Е.Н., Малков Ю.А., Трофимова Н.Н., Фёдорова Т.Е. Продукты глубокой химической переработки биомассы лиственницы. Технология получения и перспективы использования // Российский химический журнал. 2004. Т. XLIII, №3. С. 62-69.
8. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Остроухова Л.А., Федоров С.В., Онучина Н.А., Бабкин В.А. Полимер дигидро-кверцетина из древесины лиственницы // Химия растительного сырья. 2001. №4. С. 21-24.
9. Колзунова Л.Г., Бабкин В.А., Медведева Е.Н., Золотарь Р.Н., Малков Ю.А., Остроухова Л.А. Ультрафильтрация экстрактов арабиногалактана, выделенных из древесины лиственницы сибирской // Новые достижения в химии и химическойтехнологиирастительного сырья: матер. II Всеросс. конф. Барнаул, 2005. Кн. 2. С. 610-615.
10. Антонова Г.Ф. Исследования фракционного состава полисахарида арабиногалактана древесины лиственницы сибирской // Химия древесины. 1977. №4. С. 97-100.
11. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: учебное пособие для вузов. М., 1991. 320 с.
12. Мударисова Р.Х., Бадыкова Л.А., Монаков Ю.Б. Перспективы применения комплексов на основе природного полисахарида арабиногалактана в медицине // Химия и медицина: тез. докл. VI Всерос. научн. семинара Уфа, 2007. С. 76-77.
13. Душкин А.В., Метелева Е.С., Толстикова Т.Г., Толстиков Г.А., Поляков Н.Э., Неверова Н.А., Медведева Е.Н., Бабкин В.А. Механохимическое получение и фармакологическая активность водорастворимых межмолекулярных комплексов арабиногалактана и лекарственных веществ // Известия РАН. Сер. Хим. 2008. №6. С. 1274-1282.
Поступило в редакцию 4 марта 2010 г.
