CC BY
421
ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
УДК 543.257.063
И. А. Салахов, С. Ю. Г армонов
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ БОЯРЫШНИКА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Разработана методика ВЭЖХ - определения витексина - 2 - рамнозида, рутина, гиперозида и проведена оптимизация пробоподготовки сухого экстракта боярышника в виде таблеток для рассасывания. Методика позволяет количественно определять все указанные соединения в лекарственных формах на основе боярышника (таблетки, настойки), отличается хорошей чувствительностью и воспроизводимостью аналитических определений.
Плоды дикорастущих и культивируемых кустарников боярышника сглаженного Crategus laevigata, боярышника колючего Crategus oxyacantha sensu Pojark., боярышника Королькова Crategus Korolkovii L. и других видов семейства розоцветных содержат большой комплекс биологически активных веществ - флавоноидов, холлин, ацетилхолин, дубильные вещества, фитостерины и тритерпеновые кислоты [1-3]. Это позволяет им усиливать кровообращение в коронарных сосудах сердца и головного мозга, повышать сокращения сердечной мышцы, вместе с тем уменьшая ее возбудимость, благодаря чему эти фитопрепараты широко применяются при функциональных расстройствах сердечной деятельности и ангионеврозах [1, 2].
Препараты боярышника выпускают как в виде спиртовой настойки, так и в виде сухого экстракта в виде таблеток для рассасывания, содержащих в качестве вспомогательных веществ ментол, сорбит, аспартам и стеарат магния. Экстракт боярышника содержит сумму биологически активных флавоноидов витексина-2-рамнозида, рутина и гиперозида, которые имеют близкие хромофорные, элюационные и другие аналитические свойства, что затрудняет их совместное определение в растительной матрице сложного состава.
Для проверки качества лекарственных форм на основе боярышника используется спектрофотометрический метод количественного определения суммы флавоноидов в настойке в пересчете на рутин, а в сухом таблетированном экстракте количественно определяют суммарное содержание витексин-2-рамнозида и гиперозида методом ВЭЖХ [4, 5]. При этом использована хроматографическая колонка с неподвижной фазой С18, в качестве элюента смесь фосфорной кислоты - изопропилового спирта - тетрагидрофурана - воды (1:5:20:80; об. %) и аналитическая длина волны детектирования 340 нм. В литературе также описано определение флавоноидов методом ТСХ и ГЖХ [6-8]. Необходимо отметить, что методика ВЭЖХ определения суммы флавоноидов в лекарственных формах на основе боярышника имеет ряд несомненных преимуществ перед другими методами по избирательности, чувствительности и экспрессности аналитических определений, однако, при описанных в нормативных документах условиях хроматографирования она не позволяет
проводить раздельное определение флавоноидов и других компонентов лекарственной смеси.
Представляет интерес одновременное определение содержания отдельных флавонои-дов в лекарственном растительном сырье на основе боярышника и лекарственных формах на его основе, а также упрощение процедур пробоподготовки сырья и лекарственных форм.
В связи с этим целью работы явилась разработка методики эффективного, чувствительного и одновременного определения витексина-2-рамнозида, рутина и гиперозида в таблетированных экстрактах и спиртовых настойках на основе боярышника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Экспериментальная часть
В работе использовали жидкостной хроматограф фирмы Perkin Elmer (США) с программным обеспечением TotalChrom Workstation версии 6.2, состоящий из двухканального градиентного насоса SERIES 200, УФ - детектора SERIES 200 с переключением длин волн в диапазоне 190 - 360 нм, интерфейс SERIES 600 и вакуум - дегазатора SERIES 200. Для хроматографического разделения использована колонка Summetry С18 (4,6 мм х 250 мм х 5 мкм) с предколонкой Summetry С18 (3,9 мм х 20 мм х 5 мкм), скорость подвижной фазы составляла 1 мл/мин, а объем инжектируемой пробы - 20 мкл. Для контроля pH мобильной фазы использовали рН-метр фирмы Hanna (Румыния). В предварительных испытаниях для определения спектров анализируемых веществ использовался сканирующий в диапазоне от 190-1100 нм УФ-спектрометр марки SPECORD 40 фирмы AnalitykJe-na (Германия).
Для приготовления элюентов, а также растворения стандартных испытуемых препаратов использовали ацетонитрил ос.ч, метанол марки для хроматографии и сверхчистую воду, полученную на установке MilliporWaters (США) из бидистилированной воды. В качестве стандартов определяемых лекарственных веществ использовали фармацевтические субстанции, рутин (Fluka), ви-тексин-2-рамнозид (Fluka), гиперозид (Exrasynthese).
Для приготовления подвижной фазы использовали 0,02 М фосфатный буферный раствор (раствор гидрофосфата натрия (7,16 г), доведенного 30 %-ной фосфорной кислотой до рН 2,5).
Идентификацию определяемых соединений на хроматограммах проводили как по временам удерживания, так и по результатам сопоставления спектров поглощения с данными библиотеки спектров химической станции.
Методика выполнения анализа. Для выполнения анализа 20 анализируемых таблеток взвешивают и находят среднюю массу таблетки в граммах с точностью ±0,0002 г. Берут точную навеску растертых таблеток и растворяют при перемешивании в мерной колбе объемом 25 мл в 10 мл метанола при нагревании до 600С; параллельно готовят раствор рабочего стандартного раствора (РСО), оба раствора обрабатывают ультразвуком 10 мин. Добавляют 5 мл воды. Далее раствор доводят до метки 0,02 М фосфатным буферным раствором и фильтруют через гидрофобный мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Хроматографируют испытуемый раствор и раствор РСО, получая не менее 3 хроматограмм каждого раствора. Далее рассчитывают количество каждого компонента в анализируемых таблетках по формуле:
Xk_ (Sk тст mc)/(Scn тн)> где Sk и Scm - средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах испытуемого раствора и раствора РСО соответственно; тст, тс и тн - масса стандарта определяемого вещества в растворе РСО, средняя масса таблетки и масса навески растертых таблеток, взятой для приготовления испытуемого раствора соответственно в граммах.
Результаты и их обсуждение
Наибольшие значения коэффициентов молярного светопоглощения водноорганические растворы флавоноидов имеют при низких значениях рН, причем максимумы поглощения витексина-2-рамнозида, рутина и гиперозида фиксируются при 341, 358, 354 нм,
соответственно. На рис. 1 представлены электронные спектры определяемых веществ при растворении в элюирующей смеси. Эти данные послужили основой для выбора оптимальной длины волны для детектирования при ВЭЖХ анализе 354 нм.
А
0,2
0,1
0
235 285 335 385 435 Л , нм
Рис. 1 - Электронные спектры поглощения витексин-2-рамнозида (1); рутина (2); ги-перозида (5) в смеси ацетонитрил - метанол (50:50 об.) - 30 % и 70 % 0,02 М фосфатного буферного раствора. Концентрации соединений 5 мкг/мл. 1 = 1 см
При проведении извлечения флавоноидов из сухого экстракта нами была оптимизирована пробоподготовка растительного сырья. Как показали проведенные эксперименты, для полного извлечения компонентов растительной матрицы достаточна его обработка метанолом при нагревании до 600С в течение 10 минут, с последующей обработкой ультразвуком, причем процедура вакуум-отгонки растворителя досуха, необходимая при использовании многокомпонентных ограниченно смешивающихся с водой элюирующих смесей, была исключена. Это позволяет, в общем, значительно упростить проведение анализа и обеспечить достаточную экспрессность единичного аналитического определения.
При анализе флавоноидов экстракта плодов боярышника пики всех определяемых веществ и неидентифицированные компоненты растительного сырья полностью разделяются при использовании следующего состава подвижной фазы: 30 % смеси ацетонитрил - метанол (50:50 об.) и 70 % 0,02 М фосфатного буферного раствора (рис. 2). При этих условиях хроматографирования время удерживания последнего компонента составляет 12 минут.
При указанных рабочих условиях проведения анализа линейные, хорошо воспроизводимые градуировочные зависимости интенсивности сигнала (высота пика) - содержание определяемого вещества записываются в виде уравнений:
для витексина-2-рамнозида 8(шЛи-в) = 6358бСх(мкг/мл) + 2706 (г = 0,9997, П = 15);
для рутина 8(шЛи-8) = 64123 Сх(мкг/мл) + 1236 (г = 0,9996, П = 12); для гиперозида 8(шЛИ-8) = 92222Сх(мкг/мл) - 4341 (г = 0,9997, П = 14).
Пределы обнаружения составляют для витексина-2-рамнозида, рутина и гиперозида
0,5 мкг/мл; 0,5 мкг/мл; 0,3 мкг/мл соответственно при интервале определяемых содержаний веществ 3 мкг/мл - 100 мкг/мл.
5=63
О 2 4 б 5 10 12 ^мин
Рис. 2 - Хроматограмма разделения смеси биологически активных веществ экстракта боярышника: витексин-2-рамнозид (1); рутин (2); гиперозид (5). Подвижная фаза: 30 % смеси ацетонитрил - метанол (50:50 об.) и 70 % 0,02 М фосфатного буферного раствора. Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны детектирования 354 нм
Экспериментально возможность хроматографического определения отдельных флавоноидов в анализируемых матрицах проверена в различных модельных и готовых лекарственных формах (табл. 1, 2).
Таблица 1 - Результаты определения флавоноидов боярышника в модельных смесях (п=5, Р=0,95)
Аналит Компоненты смеси (мкг/мл) Введено аналита (мкг/мл) Найдено аналита (мкг/мл) Эг
Витексин-2- Рутин (20) 6,1 4,3 6,0±0,5 3 90±0 31 0,05 0,05
рамнозид Г иперозид (20) 2,8 2,90±0,23 0,05
Витексин-2- 5,12 4,80±0,38 0,06
Рутин рамнозид (60) 0,9 0,87±0,07 0,05
Гиперозид (50) 1,3 1,35±0,11 0,05
Витексин-2- 0,85 0,90±0,09 0,05
Г иперозид рамнозид (40) 1,8 1,80±0,14 0,05
Рутин (25) 2,5 2,6±0,2 0,06
Предварительно установлено, что вспомогательные вещества, входящие в состав таблеток, определениям не мешают. Результаты, приведенные в табл. 1, удовлетворительны по метрологическим характеристикам.
Таблица 2 - Результаты определения флавоноидов боярышника в лекарственных формах (п=5, Р=0,95)
Лекарственная форма Найдено, мг
Витексин-2- рамнозид Рутин Г иперозид
Таблетки для рассасывания (в таблетке) 1,21±0,04 0,150±0,004 0,69±0,03
Спиртовая настойка (в 100 мл) 1,53±0,06 0,34±0,02 1,26±0,06
Выводы
1. Найдены оптимальные условия количественного раздельного определения витек-сина-2-рамнозида, рутина и гиперозида в сухом таблетированном экстракте плодов боярышника.
2. Разработана методика ВЭЖХ-определения флавоноидов боярышника и проведена оптимизация пробоподготовки сухого экстракта в виде таблеток для рассасывания. Методика позволяет количественно определять все указанные соединения в лекарственных формах на основе боярышника (таблетки, настойки), отличается хорошей чувствительностью и воспроизводимостью аналитических определений.
Литература
1. МашковскийМ.Д. Лекарственные средства. Ч.ІІ. М.: Медицина, 1993. 686 с.
2. Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология. - М: Медицинское информационное агентство, 2000. 147 с.
3. Химический анализ лекарственных растений / Ладыгина Е.А., Сафронович Л.И., Отряшенко-ва В.Э. и др. М.: Высшая школа, 1983.
4. НД 42-10888-00. Препарат «Настойка боярышника».
5. НД 42-10428-99. Препарат «Боярышник в лекарственной форме таблетки для рассасывания».
6. Коренман И.М. Методы определения органических соединений. М.:Химия, 1970. 343 с.
7. Муравьева ДА. Фармакогнозия. М: Медицина, 1991. 465 с.
8. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. Л.:Химия, 1981. 624 с.
© И. А. Салахов - асп. каф. аналитической химии, стандартизации и менеджмента качества КГТУ; С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. той же кафедры.
