CC BY
3
фильных агглютининов (в наиболее ранние сроки) в зависимости от изменения процессов ПОЛ, последовательном снижении функции изученных элементов системы обеспечения неспецифической иммунобиологической резистентности организма, развитии защитных реакций за счет индукции литогенеза.
Литература
1. Бердинских Н. К., Санина К. Л., Гула Е. П.. Мельникова Н. Н. //Вести. АМН СССР.— 1982. — № 3. — С. 53-55.
2. Кишев М. Г.// Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии. — Краснодар, 1983. —С. 121 — 122.
3. Козлов В. А. // Клеточные факторы регуляции иммуногенеза. — Новосибирск, 1985. — С. 88—95.
4. Козлов 10. П. //Липиды: Структура, функция, биосинтез, превращения. — М., 1977.— С. 86—93.
5. К оценке по системе биохимических, морфологических, иммунологических и физиологических показателей ранних изменений функциональных реакций организма человека при воздействии факторов окружающей среды: Метод, указания, —Пермь, 1986.— С. 55—59.
ЧЙ
Чг
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1990 УДК 615.285.7.065:616-006.6
6. Литвинов И. Н. //Гиг. и сан, — 1985. — № 6. — С. 10— 13.
7. Меркурьева Р. В.. Литвинов И. П., Аулика Б. В. и др. // Бюл. экспер. биол. — 1982. — № 4. — С. 43—44.
8. Меркурьева Р. В., Судаков К■ В., Бонашевская Т. И., Журков В. С. // Медико-биологические исследования в гигиене, —М„ 1986.— С. 30—32.
9. Мольков 10. И. Иммунологические аспекты профилактики, диагностики и терапии рака. — М., 1965. — С. 126-137.
10. Сидоренко Г. И., Ахундов В. Ю., Литвинов Н. Н. и др.//Бюл. экспер. биол.— 1982, —№6. — С. 101— 103.
11. Система биохимических, цитологических, цитохимических и электронно-микроскопических критериев оценки функционального состояния альвеолярных макрофагов человека и экспериментальных животных при воздействии факторов окружающей среды: Метод, рекомендации.—М„ 1983.— С. 13—19.
12. Фетисов В. В., Литвинов Н. Н., Гасимова 3. М. // Бюл. экспер. — 1987, —№ 1. —С. 114—117.
13. Фрейдлин И. С. Система мононуклеарных фагоцитов.— М„ 1984, —С. 50—54.
14. Folch /., Lees М.. Sloane-Stanley G. Н.Ц J. biol. Chem. — 1957. — Vol. 226. — P. 497—509.
15. Tappet A. L., Zalltin H. // Arch. Biochem. — 1959. — Vol. 80. — P. 326-336.
Поступила 07.05.88
И. В. Андреева, И. И. Држевецкая, О. 10. Русина, Р. И. Анискина,
А. Г. Скавронская
ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ КАНЦЕРОГЕННОСТИ ПЕСТИЦИДОВ В КРАТКОСРОЧНЫХ ТЕСТАХ
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР, Москва
Широкое применение пестицидов в мировой практике представляет значительную опасность, поскольку эти вещества вызывают как острые интоксикации [11], так и отдаленные эффекты — рост аллергической и онкологической заболеваемости [4]. Формирование безопасного ассортимента пестицидов предполагает исследование их в краткосрочных тестах [3, 9]. Первое место среди этих тестов занимает исследование на мутагенную активность в бактериальной системе [10].
В экспериментах, представленных в настоящем сообщении, использовали штаммы сальмонелл системы Ames: ТА100, ТА1535 (мутации замены пар оснований), ТА98 (мутации сдвига рамки считывания) [10], а также сконструированный в лаборатории генетики бактерий тест-штамм AG262 [5].
Учитывали реверсии к прототрофности. В качестве полноценных питательных сред применяли питательный бульон Lennox, агар Lennox, в качестве минимальной среды — минимальную среду А, содержащую 1,5% агара «Difco» [8]. я Положительными контролями служили извест-ные мутагены: этилметансульфонат (ЭМС) фирмы «Serva», 4-нитрохинолин-1-оксид фирмы «Da-lichi Pure Cliemicals», бенз(а)пирен фирмы
«Serva», циклофосфан —: отечественный коммерческий препарат, 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4, 5, 9, 10-тетрагидро-4,9-диазог;ирен (ДДДТДП)—отечественный препарат [1], ме-тилметансульфонат фирмы «Merck Schuchardt». Препараты были испытаны с метаболической активацией и без нее. Для обеспечения метаболической активации препаратов использовали микросомную фракцию печени крыс с кофакторами (S9mix), приготовленную по Ames [10]. Ree- и Pol-assay-эксперименты проводили по методам, описанным J. Shirasu и соавт. [13] и М. Hollstein и соавт. [12]. Для испытания препаратов в жидкой среде культуры сальмонелл засевали иа ночь в бульон Lennox. Ночную куль-туру разводили в 10 раз свежим бульоном и подращивали до логарифмической фазы (108кл/мл) при 37 °С на качалке. Затем культуру отмывали физиологическим раствором путем центрифугирования и ресуспендировали в физиологическом растворе. К бактериальной культуре, содержащей ЫО8—2-Ю8 кл/мл, добавляли испытуемое вещество в различных концентрациях и инкубировали при 37 °С в течение 60 мин. Затем отмывали ее от вещества и высевали без разведения на селективные для мутантов среды и соответствующие разведения — на полноценную среду
Таблица 1
Летальное и мутагенное действие кронетона на штаммах ТА100, ТА98 и АС262 при обработке в жидкой среде
Кронетон, МКг/МЛ ТА 100 ТА98 AG262
% выживших клеток число мутантов His+ в 1 мл % выживших клеток число мутантов His+ в 1 мл % выживших клеток число мутантов His+ в 1 мл
0 100 200 300 500 100 41 4 0,23 0,02 151 188 107 38 2 100 17 13 0,2 0,001 27 20 20 3 0 100 69 17 0,06 0 10 8 8 7 1
Контроль:
ЭМС, 1 % 0 2012 0 9 0 1560
дддтдп,
10 мкг/мл 0 398 0 2118 0 0
для определения доли выживших клеток. При оценке результатов относительно мутагенности веществ и градации их по степени мутагенности руководствовались методическими указателями [7]. При испытании препаратов на твердой среде ночную бульонную культуру добавляли вместе с препаратом в полуобогащенный агар и выливали на селективные для мутантов чашки [10].
Первым из числа испытанных был западногерманский препарат кронетон (2-этил-тиометил-фе-нил-Ы-метилкарбамат) — высокотоксичный инсектицид с молекулярной массой 225, нерастворимый в воде. Для проведения экспериментов препарат растворяли в диметилсульфоксиде. Результаты экспериментов по испытанию на мутагенную активность кронетона представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 2
Мутагенное действие кронетона на штаммах ТА100, ТА98, ТА1535 и АС262 при обработке на плотной среде
ТА 1 00 ТА98 |ТА! 535 AG262
Кронетон, мкг на чашку абсолютное число мутантов на чашку
His+ His+ His+ His + Arg+
0 218 24 13 30 7
100 257 24 21 60 3
200 386 23 0 83 12
300 479 22 19 108 6
500 448 15 21 108 3
Контроль:
ЭМС, 1 % 3002 19 2921 1400 0
ДДДТДП,
10 мкг на чашку 482 1963 0 0 577
Концентрации препарата от 100 мкг/мл и выше, растворенного в жидкой среде, оказывают летальное действие на микробы (см. табл. 1). При действии кронетона в дозе 200 мкг/мл остается от 4 до 17 % живых клеток на различных штаммах сальмонелл; большие дозы вызывают еще более значительную гибель, которая не по£ зволяет определить мутагенный эффект. Мута* генное действие кронетона в жидкой среде при 60-минутной экспозиции при всех испытанных дозах не наблюдается. Летальный эффект препарата выявляется и при испытании в spot-тесте на твердой среде без метаболической активации. При этом определяется зона ингибиции роста на штаммах ТА100 и AG262. Диаметр зоны ингибиции роста 5—6 мм. Контрольные соединения метилметансульфонат и 4-нитрохино-лин-1 -оксид дали зоны ингибиции роста 5 и 4 мм соответственно.
Как видно из табл. 2, при испытании на твердой среде без метаболической активации кронетон в концентрациях 100—150 мкг на чашку слабо индуцировал мутации в штамме ТА100 и в щ несколько большей степени — в штамме AG262. В последнем случае абсолютное число индуцированных мутантов увеличивалось в 2—3 раза при дозе 200—300 мкг на чашку по сравнению со спонтанным фоном.
Практически не наблюдается мутагенеза на штамме Эймса ТА1535, не содержащем плазми-ду. В условиях эскперимента кронетон не индуцирует мутаций типа сдвига рамки считывания как в штамме AG262, так и в штамме ТА98, несущем плазмиду рКМ101.
При испытании кронетона мутагенный эффект зарегистрирован при использовании штамма Эймса ТА100 и созданного в лаборатории генетики бактерий НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалек штам-^ ма AG262. Штамм AG262 представляет собой^ сальмонеллезный гибрид, несущий гены umuCD+ кишечной палочки [6]. Штамм ТА100 содержит плазмиду рКМ101 с генами mucAB, представляющими собой аналоги генов umuCD. Наличие этих генов в составе обоих штаммов обеспечивает мутагенез под влиянием SOS-индуцирующих агентов. Отсутствие мутагенного эффекта на штамме Эймса ТА1535, не содержащего плазми-ды рКМ101 и не отличающемся по другим признакам от штамма ТА100, позволяет считать кронетон SOS-индуцирующим агентом.
Результаты, полученные со штаммами ТА 100 и AG262, однотипны с данными, полученными ранее с использованием известных мутагенов [6]. Пример кронетона позволяет считать штамм AG262, несущий, кроме того, две ауксотзофные мутации различной природы, перспективным в практике выявления неизвестных мутагенных веществ. ^
Таким образом, инсектицид кронетон в испытанных концентрациях оказывает слабое мутагенное действие, не требующее метаболической
Таблица 3
Мутагенное действие фунгицида ромуцнда в условиях метаболической активации на штаммах ТА100, ТА98 и А0262
ТА 1 00 ТА98 AG262
Ромуцид, абсолютное число мутантов на чашку
мкг на чашку
ф His+ His + Агв+ His +
\
0 187 32 14 25
1 229 35 15 23
50 217 33 16 28
500 299 47 9 26
1000 446 40 18 25
Контроль:
бенз(а)пирен,
5 мкг на чашку 760 177 56 0
циклофосфан,
500 мкг на чаш-
ку 923 0 0 1102
активации при испытании на бактериях. Проявление мутагенного эффекта наблюдается лишь % при длительной совместной инкубации бактерий и препарата на плотной среде, но не при кратковременной обработке в жидкой среде. Препарат проявляет выраженный летальный эффект в отношении микробов при обработке в жидкой среде без активации и при испытании эро!-тестом на твердой среде. По свойственной кро-нетону мутагенной активности он может быть отнесен к числу положительно охарактеризованных относительно потенциальной канцероген-ности признаков. В связи с этим необходимо отметить, что конетон способствует усилению спонтанного аденоматозного процесса в легких у мышей линии ВАЬВ/с и оказывает канцерогенное действие на вирусно-химический канцерогенез, вызываемый введением метилхолантрена-20 и вируса простого герпеса II типа [2].
Все сказанное свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения кронетона относительно его потенциальной канцерогенное™.
Следующим соединением, испытанным относительно мутагенной активности, был препарат ромуцид — новый отечественный фунгицид. Он высокоактивен против мучнистой росы и средне-активен против стеблевой ржавчины пшеницы. Ромуцид относится к соединениям дикарбоно-вых кислот, его молекулярная масса 39,28; для проведения экспериментов препарат растворяли в диметилсульфоксиде.
При всех испытанных концентрациях ромуци-да в жидкой среде без метаболической активации он не вызывает превышения абсолютного количества мутантов над спонтанным фоном. Концентрации препарата от 50 мкг/мл и выше 1?(до 1000 мкг/мл) оказывают слабое летальное действие на микробы.
При испытании на твердой среде без метаболической активации ромуцид в этих концентра-
циях также не индуцирует мутаций в штаммах ТА 100, ТА98 и AG262.
В табл. 3 представлены данные экспериментов по испытанию ромуцида в условиях метаболической активации. Как видно из табл. 3, на штамме ТА 100 наблюдается повышение над спонтанным фоном в 2,5 раза при дозе 1000 мкг на чашку. Большие дозы ромуцида не взяты в опыт ввиду его плохой растворимости. При испытании spot-тестом на твердой среде без метаболической активации на штаммах ТА 100, ТА98 и AG-262 ни зон ингибиции роста, ни ревертантов получено не было. Наблюдавшееся при действии одной — максимальной — дозы некоторое увеличение числа мутантов у штамма ТА100, обработанного ромуцидом, побудило к дополнительному испытанию этого препарата в гес- и pol-assay-экспе-риментах. Опыты, проведенные на штаммах кишечной палочки АВ2463 (recAl) и KS402 (polAl), дали отрицательный результат — зон ингибиции роста указанных штаммов получено не было. Следовательно о наличии ДНК-тропно-го действия ромуцида можно судить лишь на основании слабого летального и мутагенного эффектов ромуцида при больших концентрациях препарата. Необходимо отметить, что мутагенное действие ромуцнда (1000 мкг на одну чашку) выявляется только в опыте со штаммом ТА100, но не AG262. В нашей практике это первый препарат, вызывающий мутации у ТА100 и не оказывающий действия на AG262. Может быть, это объясняется техническими причинами. Лишь одна — максимальная — концентрация ромуцида вызывает мутации у ТА 100. Поэтому использование растворителя, который дает возможность испытать большие концентрации препарата, может быть, позволит выявить эффект и на штамме AG262.
Результаты, полученные на штамме ТА100, нельзя считать случайными: приведенные данные являются средними из трех независимых опытов. Следует отметить, что механизм действия плазмид в клетках бактерий до сих пор окончательно не выяснен. Возможно, что присутствие плазмиды рКМ101, эффект которой может быть обусловлен не только наличием muc-генов, делает штамм ТА100 сверхчувствительным к некоторым агентам. Так или иначе, ромуцид нуждается в дальнейшем изучении его как возможного промутагена с подбором соответствующих растворителей, а также в испытании на других, тест-системах.
Литература
1. Абилев С. К-, Фонштейн JI. М., Мигачев Г. И . Андриевский А. М. // Генетика. — 1979. — Т. 15, № 5. — С. 807-811.
2. Анискина Р. И., Андреева И. В., Кочаткова Т. Л., Лям-кина И. И. II Вопросы профилактической токсикологии. — М„ 1985, —С. 5—9.
3. Бемщкий Г. А., Худолей В. В. // Вопр. онкол.— 1986.—^ № 4, — С. 3—11.
4. Дубинин Н. П., Лашин Ю. В. Мутагенез и окружающая среда. — М., 1978.
5. Лямкина И. И., Андреева И. В., Степанова Н. Ф„ Скавронская А. Г. //Молекул, генетика. — 1986. — № 8, —С. 24—27.
6. Лямкина И. И., Андреева И. В., Степанова Н. Ф. п др.//Генетика. — 1987,— Т. 23, № 5. — С. 802—808.
7. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем: (Метод, указание) /Фонштейн Л. М., Аби-лев С. К., Бобринев Е. В. и др. — М., 1985.
8. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ. — М., 1976.
9. Пилинская М. А. //Итоги науки и техники: Сер.: Общая генетика, — М., 1986.— Т. 9. — С. 97—151.
10. Ames В. N.. МсСапп ]., Yamasaki Е.// Mutat. Res. — 1975,— Vol. 31, N 3, —P. 347—364.
11. Dally S., Danan M., Fournier E.// Arch. Mal. prof. — 1983. — Vol. 44. — P. 389—390.
12. Hollstein M.. McCann /., Angetosanlo F., Nichols W.// Mutat. Res.— J979. — Vol. 65, N 2, —P. 133—226. ¿
13. Shirasu J„ Moriya M., Kato K. et al.//Ibid.— 1976. Я Vol. 40, N 1. — P. 19—30.
Поступила 20.10.88
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1990 УДК 615,285.7:547.241],0С5:616.8-009.11-099
Н. В. Кокшарева, 10. С. Каган, И. И. Ткаченко
ПРОБЛЕМА ОТДАЛЕННОГО НЕЙРОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФОСФОРООРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ (ОБЗОР)
ВНИИ гигнены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс, Киев
В связи с широким использованием в народном хозяйстве фосфорорганических пестицидов (ФОП) одной из важнейших задач медицинской науки является необходимость еще на стадии экспериментального изучения прогнозировать их возможную потенциальную и реальную опасность для здоровья людей и предупреждать внедрение в практику веществ, небезопасных для человека и окружающей среды.
Особый интерес представляют отдаленные последствия применения ФОП. При этом наряду с изучением бластомогенных, тератогенных и мутагенных эффектов в последние годы большое внимание уделяется проблеме отдаленного нейроток-сического действия (ОНД) фосфорорганических соединений (ФОС). Этот эффект проявляется постепенно, после определенного латентного периода (обычно через 14—21 день, а иногда через 1 — 5 лет после перенесенного острого отравления) и характеризуется клинически — возникновением атаксии, мышечной слабости, парезов и параличей конечностей, морфологически — демиелини-зацией волокон проводящих путей спинного мозга и периферических нервов.
К настоящему времени описано 40 тыс. случаев возникновения парезов и параличей у людей в результате воздействия ФОС [17].
Согласно требованиям Всемирной организации здравоохранения, препараты, оказывающие ОНД, не должны внедряться в практику народного хозяйства.
В настоящем обзоре проанализированы данные литературы о способности ряда ФОП оказывать ОНД, рассмотрены некоторые вопросы механизма, возможности прогнозирования и выявления ранних (доклинических) признаков нейропа-тии в эксперименте на различных видах лабораторных животных, изучено соотношение между структурой ФОС и их свойством оказывать ОНД,
а также изложены принципы профилактики и ле- £ чения указанной патологии.
ОНД привлекло внимание мировой общественности еще в 30-е годы нашего столетия, когда в США были описаны десятки случаев параличей у людей, имевших контакт с триортокрезилфосфа-том (ТОКФ). В 1931 г. было установлено, что ТОКФ вызывает демиелинизацию нервных стволов, которая лежит в основе возникновения необратимых параличей у людей [50]. Более 20тыс. параличей явились следствием употребления ямайского джина, содержащего ТОКФ [23], 10 тыс. случаев зафиксировано в Марокко в 1959 г. в связи с употреблением оливкового масла, в котором присутствовал ТОКФ [69]. Известно массовое развитие параличей в результате но-, шения обуви с пластмассовыми стельками, содер-Ф жащими ТОКФ [50]. Число ФОС, для которых установлена отдаленная нейротоксичность, постепенно возрастает. ОНД оказывают лептофос, мипафокс, метамидофос, трихлоронат, днхлофос, ЭПН (0-этил-0-4-нитрофенилфенилтиофосфонат) и др. [29, 35, 50, 68, 73]. Зарегистрировано много случаев полиневритов, переходящих в тяжелые парезы, после отравления людей хлорофосом [2, 4]. Отмечено, что неврологические нарушения после кажущегося выздоровления наблюдались в ряде случаев на 2-м и даже 7-м году заболевания. Причиной периферических нейропатий могут быть также производственные факторы или факторы окружающей среды [61].
Недавно в эксперименте установлено [22], что новый фунгицид афос (0,0-дифенил-1-ацетоокси-2, 2,2,-трихлорэтилфосфонат) проявляет выраженную нейротоксическую активность в широком диапазоне доз (3000—25 мг/кг). Его воздействие^ сопровождается снижением двигательной активности, возникновением парезов и параличей, функционально-морфологическими изменениями
