CC BY
7
3. Дубинина Е. Е., Сальникова Л. А., Ефимова Л. Ф. // Там же.— 1983.—№ 10 — С. 30—39.
4. Колб В. Г., Камышников В. С. Справочник по клинической химии.— Минск, 1982.
5. Санитарно-химический анализ пластмасс / Гуричева 3. Г., Петрова Л. И., Сухорева Л. В. и др.— Л., 1977.
^ 6. Сафинова Л. Ш. Ц Гиг. труда.— 1982.—№ П.—
С. 51—53.
7. Сафинова Л. Ш. // Нарушение эндокринного и иммунного гомеостаза при важнейших заболеваниях.— Л., 1985.— С. 55—59.
8. Соколовский В. В., Белозерова Л. А., Огурцова Р. Е. // Лаб. дело.— 1977.— № 1.— С. 26—27.
9. Соколовский В. В. // Антиоксиданты и адаптация.— Л., 1984.— С. 5—19.
10. Соколовский В. В. II Вопр. мед. химии.— 1988.— № 6.— С. 2—11.
11. Тиунов Л. А. И Вестн. АМН СССР.— 1988.—№ 1.— С. 62—69.
12. Шлейкин А. Г., Родионова Л. П., Макарова И. И., Киселева И. И. II Флюктуации состояния биохимических систем.—Л., 1986.—С. 38—40.
13. Beutler Е. Red Cell Metabolism.—New York, 1975.
14. Ellman G. L., Courtnay K. D., Andrew V. Jr., Fethemsto-ne R. M. II Biochem. Pharmacol.— 1964.— Vol. 7.—
p gg_95
15. Stock В. H. U J. biol. Chem.— 1986.—Vol. 261, N 13.— P. 5959—5964.
16. Vainio H., Paakkonen R., Ronnholm K. et al. // Scand. J. Work Environm. Hlth.— 1976.— Vol. 2, N 3.— P. 147—151
Поступила 11.12.89
КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990
УДК 614.7:I615.918:582.282.23|-07:612.6.052
¥ я N
^ А. Е. Борисенко, Е. Е. Мирская, Е. Г. Борисенко
ИЗМЕНЕНИЕ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ СРЕДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ АФЛАТОКСИН В,, В РЕЗУЛЬТАТЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ДРОЖЖЕЙ
Московский технологический институт пищевой промышленности; НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи
АМН СССР, Москва
#
>
Афлатоксины являются одними из самых сильных гепатоканцерогенов. Пищевые продукты (в частности, бобы, арахис, зерно) могут поражаться грибами, синтезирующими афлатоксины, в процессе производства, хранения или приготовления пищи. Наиболее часто происходит загрязнение афлатоксином В] — самой токсичной для человека формой афлатоксина. Это сильный му-
таген, действие которого на организм опосредовано метаболической активацией. Афлатоксин Bi вызывает мутации у Salmonella typhimurium, индукцию и мутагенез профага X у Е. coli, мутации у Neurospora crassa, а также в культуре клеток китайского хомячка [1].
Целью настоящей работы являлось изучение возможности биодеградации афлатоксина Bi дрожжами. В качестве критерия биодеградации было выбрано снижение мутагенного действия афлатоксина Bi на биологические объекты.
До сих пор остается открытым вопрос о способности дрожжей разрушать афлатоксины. В то же время изучение возможности метаболизма афлатоксинов дрожжами весьма перспективно, так как дрожжи являются технологичными в крупнотоннажных процессах биоконверсии растительного сырья. Была исследована способность различных родов и видов дрожжей разрушать афлатоксин Bj. Наибольшей способностью снижать концентрацию этого токсина в среде обладали дрожжи рода Rhodotorula. Самым активным деструктором афлатоксина Bi показал себя штамм Rh. mucilaginosa 1В. Мутагенную активность определяли по индукции реверсий к прото-трофности у бактериальных штаммов системы Эймса [7] — наиболее распространенной во всем
мире системы краткосрочного тестирования на генотоксичность и потенциальную канцероген-ность.
В экспериментах, представленных в данном сообщении, в качестве тестерных использованы штаммы Salmonella typhimurium; ТА98, регистрирующий мутации сдвига рамки считывания, ТА100, регистрирующий мутации замены пар оснований, а также сконструированный в лаборатории генетики бактерий НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи штамм AG262 — гибрид сальмонеллы и кишечной палочки, содержащий, помимо точковой мутации his J46, фреймшифт-мутацию к аргининзависи-мости и гены umuDC кишечной палочки, ответственные за SOS-мутагенез [2]. В качестве полноценных питательных сред использовали питательный бульон и агар Lennox, в качестве минимальной среды — минимальную среду А [4], содержащую 1,5 % агара Difco.
Для биодеградации афлатоксина использовали штамм Rh. mucilaginosa 1В. Рост дрожжей проходил на питательных средах 2 видов: глюкозо-солевой среде и среде, представляющей собой смесь воды и фосфатного буфера pH 6,7 (2:3) и содержащей 2 % глюкозы и 3 % солевого концентрата [5]. Дрожжи культивировали при 30 °С на круговой качалке (220 об/мин) в течение 60 ч. В питательную среду для роста дрожжей вносили афлатоксин Bi фирмы «Sigma» (США) в концентрации 0,79 мкг/мл. Один из образцов глюко-зосолевой среды содержал афлатоксин Bi в повышенной концентрации — 3,2 мкг/мл. Выбор концентрации афлатоксина обусловлен чувствительностью бактериальных тестерных штаммов к мутагенному действию этого вещества [9].
Мутагенная активность питательной среды, содержащей афлатоксин Вь до и после выращивания на ней дрожжей
ИИ. тис1*1ад1по8а 1 В
Число ревертантов на чашку
Образец среды Штамм, тип реверсии
ТА98 His + ТА 100 His+ AG262
His+ Arg +
Контроль — питательная среда + +афлатоксин В|
(0,79) 1391±126 735±81 36 ±6 30±5
Культуральная жидкость+афлатоксин В, (0,79) 220±58 341 ±69 38±8 15±4 Культуральная ж и д кость+а ф л а -
токсин В, (3,2) 7374=174 732±137 33±8 25±5 Отрицательный контроль — культуральная жидкость Отрицательный контроль — питательная среда Контроль — питательная среда с буфером+аАла-токсин В1 (0,79) 14184=136 876±88 33±5 33±6
Культуральная жидкость с бу-феромН-афлатоксин В, (0,79) 480±98 432±85 31+7 19+4 Отрицательный контроль — культуральная жидкость с буфером 67± 11 — — — Отрицательный контроль — питательная среда
с буфером 72±9 — — —
Контроль — питательная среда + -[-афлатоксин В|
(0,79) прогретая 848±.156 — — —
Культуральная жидкость+афлатоксин В, (0,79)
прогретая 140±32 — — —
Положительный контроль —
бенз (а) пирен 313±27 574±51 56=4=7 332±45 Чистый контроль — диметилсульфок-
сид 75=Ьб 240 ±22 30 4=4 94=2
Примечание. В скобках — исходная концентрация афлатоксина В] (в мкг/мл), прочерк—исследование не проводилось.
Влияние дрожжей на мутагенную активность афлатоксина В) изучали путем сравнения мутагенной активности бездрожжевой питательной среды, содержащей афлатоксин Вь с мутагенностью культуральной жидкости после 60 ч роста дрожжей в присутствии афлатоксина Вь В качестве отрицательных контролей использовали оба вида питательных сред без афлатоксина, а также образцы культуральной жидкости, полученные в результате выращивания дрожжей на не содержащих афлатоксин питательных средах.
Стерилизацию жидкостей осуществляли путем микрофильтрации через фильтры Millipore с диаметром пор 0,22 мкм.
Известно, что афлатоксин Bj разрушается под действием температуры и повышенного давления [1]. Современная технология получения кормовых препаратов включает стадию термической обработки. Для изучения сочетанного действия дрожжей и термической обработки под давлением на афлатоксин Bi один из образцов глюкозо-со-левой среды с афлатоксином В\ после выращивания на нем Rh. mucilaginosa 1 В стерилизовали в автоклаве 30 мин под давлением 0,5 атм. В качестве контроля использовали содержащую афлатоксин Bi глюкозосолевую среду, также подвергшуюся автоклавированию.
Тестирование на S. typhimurium проводили стандартным чашечным методом Эймса с преин-кубацией [8, 10]. Смесь из 0,1 мл исследуемого образца, 0,1 мл ночной культуры тестерного штамма и 0,3 мл полной микросомальной активирующей смеси, содержащей митохондриальную фракцию печени крыс S9, преинкубировали в термостате при 37 °С в течение 20 мин. Затем в пробирки добавляли по 2 мл 0,6 % полуобогащенного верхнего агара и высевали на соответствующие селективные чашки [2, 3]. Учет колоний ревертан-тов проводили после 48—72 ч инкубации в термостате при 37 °С. В качестве положительного контроля использовали бенз(а)пирен фирмы «Sigma» (раствор в диметилсульфоксиде, концентрация 20 мкг на 1 чашку) — известный канцероген и мутаген, требующий, так же как и афлатоксин, метаболической активации (но без преинкубации) и так же вызывающий преимущественно мутации сдвига рамки считывания.
Прежде чем приступить к изучению мутагенной активности продуктов деградации афлатоксина Bi дрожжами, необходимо было определить мутагенное действие самого афлатоксина Bi на штаммы ТА98, ТА100 и AG262. Наиболее сильное мутагенное действие афлатоксин Bi оказал на штамм ТА98: превышение числа ревертантов над контролем при концентрации афлатоксина 0,079 мкг на чашку достигало 18,5 раза; на ТА100 отмечено примерно трехкратное превышение, а на AG262 — пятикратное превышение числа фрейм-шифт-ревертантов (достоверного увеличения числа точковых ревертантов на этом штамме не обнаружено).
Результаты экспериментов по выявлению возможного изменения мутагенной активности афлатоксина в результате его деградации дрожжами представлены в таблице. Как видно из данных тестирования, оба вида питательных сред, не содержащих афлатоксин, не обладали мутагенными свойствами, так же как и оба вида культуральной жидкости, полученные при выращивании дрожжей на чистых глюкозо-солевой среде и среде с фосфатным буфером. Выращивание дрож-
75-Ь13 220±31 40±7 14±2 72ч=8 — — —
жей в присутствии афлатоксина привело к досто- тельного количества афлатоксина Bi, в резуль-
tß
верному снижению мутагенной активности содержащих афлатоксин питательных сред. Наиболее выраженный эффект снижения мутагенности наблюдался на штамме ТА98 — в 6,3 раза, в меньшей степени — на штаммах ТА100 и AG262 — в 2,2 и 2 раза соответственно. На штамме ТА98 уменьшение мутагенной активности почти в 2 раза было зарегистрировано даже для среды, в которой исходная концентрация афлатоксина Bi составляла 3,2 мкг/мл.
Из таблицы видно, что при повторной стерилизации питательной среды с афлатоксином Bi путем автоклавирования ее мутагенная активность снижалась по сравнению с содержащей афло-токсин, но неавтоклавированной средой в 1,6 раза. При этом в условиях термической обработки уменьшение мутагенной активности афлатоксина в присутствий дрожжей наблюдалось такое же, как и в условиях эксперимента без автоклавирования (почти в 6 раз на ТА98).
При культивировании дрожжей на среде с афлатоксином В1, содержащей фосфатный буфер, также отмечено, хотя и несколько меньшее, чем в отсутствие буфера, снижение мутагенной активности культуральной жидкости по сравнению с таковой исходной питательной среды, содержащей афлатоксин В^ на ТА98 — в 3 раза, ТА100 — в 2 раза, Ав262 — в 1,7 раза.
В экспериментах с использованием тонкослойной хроматографии на пластинах 5ПиГо1 (ЧССР) показано, что в результате жизнедеятельности дрожжей происходит разрушение 90—95 % афлатоксина В1 и образуются афлатоксины В2 и В2а, а также неидентифицированное соединение, обозначенное как Вх. По данным литературы [6], афлатоксины В2 и В2а немутагенны. Следовательно, возможно, что мутагенная активность культуральной жидкости связана с наличием в ней остаточных количеств афлатоксина В1 и, вероятно, неидентифицированного соединения Вх.
Таким образом, использование дрожжей ИЬ. тиа^тоэа 1В приводит к разрушению значи-
тате чего происходит снижение мутагенной активности питательных сред в отношении всех использованных бактериальных тестерных штаммов. Такой вывод позволяет сделать заключение о возможности применения технологии, основанной на применении указанного штамма дрожжей, для обработки пищевых и кормовых продуктов, кон-таминированных афлатоксином В).
Литература
1. Канцерогенные вещества: Справочник. Материалы Международного агенства по изучению рака: Пер. с англ.— М., 1987.— С. 72—73.
2. Лямкина И. И., Андреева И. В., Степанова Н. Ф., Скав-ронская s/1. Г. // Молекул, генетика.— 1986.— № 8.— С. 24—27.
3. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем: (Метод, указание) / Фонштейн Л. М., Абилев С. К., Бобринев Е. В. и др.— М., 1985.
4. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ.— М., 1976.
5. Тихомирова О. И. Биотрансформация отходов животноводческих комплексов с помощью микроорганизмов: Дис. ... канд. техн. наук.— М., 1985.
6. Тутельян В. А., Кравченко Л. В. Микотоксины: (Медицинские и биологические аспекты).— М., 1985.
7. Ames В. N., МсСапп /., Yamasaki Е. // Mutat. Res.—
1975.— Vol. 31, N 3.— P. 347—364.
8. Dunn J. J., Lee L. S., Ciegler A. // Environm. Mutagen.— 1982.—Vol. 4, N 1.—P. 19—26.
9. Wong J. J., Hsich D. P. H. // Proc. nat. Acad. Sei. USA.—
1976.—Vol. 73, N 7.— P. 2241—2244.
10. Yahagi TNagao M. // Mutat. Res.— 1977.—Vol. 48, N 2.— P. 121 — 130.
Поступила 13.12.88
Summary. Changes in the mutagenic activity of the nutrient medium containing aflatoxin Bj as a result of living activity of the yeast Rhodotorula mucilaginosa I B has been studied. Reduction of mutagenic activity of the medium when tested on the strains Salmonella typhimurium TA98 (6.3 times fold), TA100 (2.2 times fold), AG262 (2 times fold) has been revealed. The data obtained leads to the conclusion that the technology, based on the use of the indicated strain of the yeast for the treatment of food and feed stuffs contaminated by aflatoxin Bi, can be used.
КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 616-099-02: (615.916:546.815 .819]-084: (615.874.25:546.41 (-092.9
Б. П. Суханов, А. А. Королев, А. Н. Марнинник, Н. М. Мерзлякова
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТОРНОЙ РОЛИ КАЛЬЦИЯ
ПРИ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
I ММИ им. И. М. Сеченова
Наблюдающееся в настоящее время ухудшение экологической обстановки приводит к постоянному возрастанию количества тяжелых металлов, в том числе свинца, поступающего в организм человека с продуктами питания. В этой связи предупреждение неблагоприятных воздействий неорганических солей свинца на организм является актуальной задачей.
Один из реальных путей снижения степени токсического действия свинца — разработка и организация соответствующего лечебно-профилактического питания. Диеты, включаемые в рацион, должны содержать компоненты, препятствующие всасыванию свинца в желудочно-кишечном тракте, депонированию его в различных органах и тканях и способствующие выведению
