CC BY
16
DOI 10.31588/2413-4201-1883-247-3-177-181
УДК 615.331.036
ОЦЕНКА МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В
УСЛОВИЯХ IN VITRO
Мухаммадиев Рин.С.1 - к.б.н, н.с., Мухаммадиев Риш.С.1 - к.б.н, н.с., Валиуллин Л.Р.1 - к.б.н., в.н.с., Касанова Н.Р.2 - к.с-х.н., Будынков Н.И.3 - к.б.н, с.н.с.,
Глинушкин А.П.3 - д.с-х.н., профессор
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической
безопасности»
2 ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана» 3ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии»
Ключевые слова: биопрепарат, молочнокислые, пропионовокислые бактерии, мутагенность
Keywords: biological drug, lactic acid, propionic acid bacteria, mutagenicity
В настоящее время из значительного количества изучаемых биологических объектов, особое внимание уделяется молочнокислым и пропионовокислым микроорганизмам. Интерес исследователей к ним связан с тем, что они являются продуцентами хозяйственно ценных биологически активных соединений, обладают выраженным антагонистическим эффектом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и способностью к активному росту и размножению [3, 9]. Использование пробиотических микроорганизмов
уменьшает патологические расстройства желудочно-кишечного тракта при использовании антибактериальных
средств. Пробиотики способны улучшать иммунную систему, функцию
эпителиального барьера и производить антибактериальные факторы. Поэтому в настоящее время молочнокислые и пропионовокислые микроорганизмы в составе препаратов широко применяются в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства [6, 7]. Тем не менее, согласно ЕАБП, ВОП и ВОЗ применение препаратов на основе таких микроорганизмов должно базироваться на их эффективности и безопасности [10].
В различных отраслях производства для оценки мутагенной активности широко
применяется более 100 тест-систем [1]. Тем не менее, до настоящего времени не существует универсальных тест-систем, выявляющих главные типы генетических повреждений. В работе по выявлению и оценке мутагенных свойств изучаемых агентов используется целый комплекс, батареи тестов, которые взаимодополняют друг друга и отличаются по уровню биологической организации объекта исследования (прокариоты, эукариоты, системы in vitro, in vivo) или по конечному действию (повреждение ДНК, генные мутации, хромосомные аберрации, и др.). При этом последовательность испытаний препаратов проводят от простых к сложным тест-системам и от кратких опытов к более длительным [5]. Применяемые тест-системы должны быть легко воспроизводимыми и обладать существенной пропускной способностью.
Целью данной работы была оценка мутагенной активности нового
биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов в условиях in vitro.
Материал и методы исследований. Работа проводилась на базе лаборатории пробиотических препаратов и ферментов ФГБНУ «Федеральный центр
токсикологической, радиационной и биологической безопасности. Объектом
исследования являлся новый биопрепарат на основе штаммов молочнокислых (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus bucheri, Lactococcus lactis) и пропионовокислых
микроорганизмов (Propionibacterium
freudenreichii), который предполагается применять для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний
сельскохозяйственных животных.
Определение мутагенной
активности препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов методом оценки индукции генных мутации осуществлялось стандартным тестом Эймса с применением микроорганизмов [2, 5]. В качестве тестерных микроорганизмов применили штаммы Salmonella typhimurium ТА98 и TA100, предоставленные научно-образовательным центром фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
В эксперименте, биопрепарат разводили основой препарата в агаризованной среде до концентрации (1,4-1,6)х109 КОЕ/мл. В пробирки, содержащие по 3 мл 0,6 % полужидкого «верхнего» агара с микродобавками биотина и гистидина и нагретые на водяной бане до температуры 45 °С, добавляли 0,1 мл суспензии бактерии и 0,1 мл тестируемого образца. Содержимое пробирок быстро перемешивали и наслаивали на слой 1,5 % селективного «нижнего» агара в чашки Петри. После полного застывания слоя «верхнего» агара чашки переносили инкубироваться в термостат при 37 оС. Положительными контролями,
индуцирующими мутации у тест-штаммов, служили прямые мутагены - 2-нитрофлуорен (2 мкг на пробу) для ТА 98, азид натрия (4 мкг на пробу) для ТА 100. Общий контроль (0,1 мл основа лечебного препарата) ставили на обоих штаммах в пяти повторностях, остальные пробы испытывали в трех повторностях. Мутагенный эффект препарата
устанавливали через 48 ч совместной инкубации метаболитов с бактериальной культурой. Сравнивали количество колоний ревертантов в опытных и
контрольных вариантах
(колониеобразующие единицы КОЕ).
Мутагенность биопрепарата
выражали через значения МИ (мутагенный индекс) - отношение количества колоний-ревертантов His+ в опыте (среднее число колоний на чашках с препаратом) к контролю (среднее число колоний на чашках с основой препарата). За присутствие мутагенного действия принимали превышение значения МИ, равный 2,0 и более для штамма бактерий ТА 98 и 1,8 и более для штамма ТА100. Превышение величины МИ от 2 (1,8) до 10 принимали как слабый, от 10 до 100 - как средний, от 100 и более - сильный мутагенный эффект тестируемого препарата [2].
Для определения цитотоксического эффекта препарата в отношении культур тестерных штаммов S. typhimurium ТА98, ТА100 в пробирки, содержащие 2,0 мл 0,6%-ого расплавленного
полуобогащенного агара, добавляли по 0,1 мл суспензий штаммов бактерий в количестве 2*109 КОЕ/мл и по 0,1 мл препарата в исследуемой дозе. В контрольные пробы вместо исследуемого препарата вносили по 0,1 мл основы препарата. После полного застывания L-агара полученную смесь наслаивали на его поверхность и через 48 ч инкубирования в термостате при 37 оС осуществляли учет выросших колоний штаммов бактерий S. typhimurium.
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывали методом вариационной статистики. Для каждой выборки устанавливали среднее арифметическое (Х), ошибку среднего арифметического (т). Проверку на нормальность распределения
осуществляли с использованием критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборочных средних проводили по ^критерию Стьюдента в случае нормального распределения или по критерию Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к>2) в случае распределения, отличающегося от нормального. Различия считали достоверными при р< 0,05.
Результат исследований.
Микроорганизмы входят в состав различных тест-систем для определения мутагенной активности препаратов, химических соединений и их метаболитов. Доказано, что наиболее удобными и пригодными объектами для исследования мутаций являются бактерии, поскольку они способны делится быстро, вследствие чего их число можно многократно увеличить, регистрировать и получать результаты в течение нескольких часов.
В связи с вышеизложенным, оценку мутагенной активности разрабатываемого нами препарата на основе штаммов пробиотических микроорганизмов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний
сельскохозяйственных животных
проводили с применением мутационного теста на Salmonella typhimurium (тест Эймса). Метод был выбран нами в качестве недорогого, быстрого, простого и удобного анализа для оценки потенциала мутагенности препарата. Следует отметить, что данный тест имеет высокую корреляцию с канцерогенными свойствами веществ или препаратов [8]. Сущность этого метода заключается в том, что индикаторные штаммы бактерий Salmonella typhimurium, несущие генные мутации в гистидиновом опероне (у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности) выращивают на специальной среде, на которой могут расти только мутанты данных штаммов.
С целью выявления разных типов мутаций в работе использовали мутантные штаммы S. typhimurium, имеющие следующие генетические характеристики [2]: ТА 100 - his G46, rfa, uvr-, pKm 101, bio; ТА 98 - his D3052, rfa, uvr-, pKm 101, bio-
Штамм ТА98 регистрирует мутации типа сдвига рамки считывания, ТА100 -типа замены пар оснований в молекуле ДНК. Штаммы ТА100 и ТА98 несут дополнительно плазмиду устойчивости к ампициллину pKm 101, а также ген umu C, что повышает вклад ошибочной репарации в процесс мутагенеза, и, таким образом, чувствительность штаммов.
Поскольку для определения мутагенности препарата требуется изучение мутагенной активности в нетоксических концентрациях для микроорганизмов, проводилась оценка токсичности препарата по отношению к Salmonella typhimurium. Результаты исследований показали, что биопрепарат (титр 1,4-1,6*109 КОЕ/мл) не проявляет цитотоксического действия на штаммы Salmonella typhimurium TA98, TA100. Ранее методами МТТ-теста, окрашивания трипановым синим и световой микроскопией, нами было показано отсутствие цитотоксичности штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий изучаемого препарата после его инкубации с линиями клеток млекопитающих [4].
Результаты оценки индукции обратных мутаций в клетках S.typhimurium к гистидиновой прототрофности через 48 часов инкубации в присутствии биопрепарата и его основы (негативный контроль) показали, что варианты опыта достоверно не отличались (р>0,05) от отрицательных контрольных вариантов (Рисунок 1).
Изучаемый препарат и его метаболиты не вызывали индукцию обратных мутации от ауксотрофности по гистидину к прототрофности у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium TA98 и TA100. Положительными контролями,
индуцирующими мутации у тест-штаммов, служили прямые мутагены 2-нитрофлуорен для ТА98 и азид натрия для ТА 100. Число колоний-ревертантов (колонии клеток -обратных мутантов, у которых частично или полностью восстанавливаются признаки исходного организма) в опыте и контроле достоверно различались менее чем в 2,0 раза, что указывает об отсутствии мутагенного эффекта препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов. Препарат на основе пробиотических микроорганизмов имел низкий МИ равный 1,0-1,1 для штамма ТА98 и 0,96-1,07 - для штамма ТА100, что расценивается как отсутствие прямой мутагенной активности (Таблица 2).
Рисунок 1 - Мутагенная активность биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов: НК - негативный контроль (основа препарата), ПК -позитивный контроль (2-нитрофлуорен или азид натрия), ПМП - препарат ((1,4-1,6)х109)
Таблица 2 - Величина мутагенного индекса (МИ) биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов
Показатель Мутагенный индекс
ТА98 ТА100
Негативный контроль (основа препарата)* 1 1
Позитивный контроль (2-нитрофлуорен или азид натрия) 3,8 9,6
Препарат ((1,4-1,6)х109)* 1,0-1,1 0,96-1,07
Примечание: * - различия между вариантами статистически не значимы (р>0,05)
Следовательно, изучаемый препарат на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов не вызывает мутации типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания, поскольку не вызывает повышения частоты реверсий ни в штамме S. typhimurium ТА98, ни в ТА1 00.
Заключение. Таким образом, методами оценки индукции генных мутации, установлено, что пробиотический препарат и содержащиеся в нем метаболиты штаммов пробиотиков в качестве активного компонента не представляют мутагенной опасности.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Абилев, С.К. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и
бластомогенных свойств химических соединений. Итоги науки и техники / С.К. Абилев, Г.Г. Порошенко // Сер. Токсикология. М.: ВИНИТИ, 1986. - Т. 14. - 171 с.
2. Ильинская, О.Н. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности / О.Н. Ильинская, А.Б. Маргулис // Методическое руководство. - Казань: КГУ. - 2005. - 32 c.
3. Мухаммадиева, А.С. Выделение и изучение морфологических и биохимических свойств новых штаммов молочнокислых бактерий, перспективных для создания пробиотических препаратов / А.С. Мухаммадиева, Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Л.Р. Валиуллин // Ветеринарный врач. - 2020. - № 3. - С. 3946.
4. Мухаммадиев, Р.С. Исследование цитотоксичности молочнокислых и пропионовокислых бактерий в тесте in vitro / Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Е.В. Скворцов, И.И. Идиятов, Л. Р. Валиуллин // Ветеринарный врач. -2019. - № 4. - С. 17-20.
5. Фисенко, В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому)
изучению новых фармакологических веществ / В.П. Фисенко // М.: Ремедиум. -2000. - 398 с.
6. De Vuyst, L. Biodiversity, ecological determinants, and metabolic exploitation of sourdough microbiota / L.De Vuyst, G. Vrancken, F. Ravyts, T. Rimaux, S. Weckx // Food microbiology. -2009. - Vol. 26. - № 7. - P. 666-675.
7. Giraffa, G. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology / G. Giraffa, N. Chanishvili, Y. Widyastuti // Research in microbiology. - 2010. - Vol. 161. - P. 480487.
8. Mc Cann, J. Detection of
carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals / J. Mc Cann, E. Choi, E. Yamasaki, B.N. Ames // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1975. - Vol. 72. - P. 5135-5139.
9. Takeda, K. Effects of a fermented milk drink containing Lactobacillus casei strain Shirota on the human NK-cell activity / K. Takeda, K. Okumura // J. Nutr. - 2007. -Vol. 137. - P. 791-793.
10. Von Wright, A. Regulating the safety of probiotics the European approach / A. Von Wright // Curr. Pharm. Des. - 2005. -Vol. 11. - P. 17-23.
ОЦЕНКА МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В УСЛОВИЯХ
IN VITRO
Мухаммадиев Рин.С., Мухаммадиев Риш.С., Валиуллин Л.Р., Касанова Н.Р. Будынков Н.И.,
Глинушкин А.П.
Резюме
Мутагенная активность разрабатываемого нами препарата на основе штаммов молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов показала, что изучаемый препарат и его метаболиты не вызывали индукцию обратных мутации от ауксотрофности по гистидину к прототрофности у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium TA98 и TA100. Число колоний-ревертантов в опыте и контроле достоверно различались менее чем в 2,0 раза. Биопрепарат имел низкий МИ равный 1,0-1,1 для штамма ТА98 и 0,96-1,07 для штамма ТА100. Полученные данные в условиях in vitro указывают на безопасность биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов, а также возможность его дальнейшего применения в сельском хозяйстве и ветеринарной медицине.
EVALUATION OF MUTAGENIC ACTIVITY OF THE DRUG ON THE BASIS OF LACTIC AND PROPIONIC MICROORGANISMS IN VITRO
Mukhammadiev Rin S., Mukhammadiev Rish S., Valiullin L.R., Kasanova N.R. Budynkov N.I.
Glinushkin A.P. Summary
The mutagenic activity of the drug based on strains of lactic acid and propionic acid microorganisms showed that the studied drug and its metabolites did not induce reverse mutations from histidine auxotrophy to prototrophy in histidine-dependent Salmonella typhimurium TA98 and TA100 strains. The number of revertant colonies in the experiment and control differed significantly less than 2.0 times. The drug had a low MI of 1.0-1.1 for the TA98 strain and 0.96-1.07 for the TA100 strain. The data obtained indicate the safety of the drug based on lactic acid and propionic acid microorganisms, as well as the possibility of its further use in agriculture and veterinary medicine.
