CC BY
4
5. Коган А. X. // Бюл. экспер. биол.— 1959. — Т. 48, № 10, —С. 109—113.
6. Меерсон Ф. 3. Адаптация, деадаптация и недостаточность сердца. — М., 1978.
7. Сталиорайтите Е. И., Блажас И. Н., Пангоните Д. С. // Арх. пат,— 1986,—Т. 48, № 1, —С. 23—19.
8. Ishikawa S., Fattal G.. Popiewicz J. // Amer. Rev. resp. Dis.—1972, —Vol. 105, N 3. — P. 358—367.
Поступила 28.02.89
i© Е. Р. ЯКИМОВА. Ю. Н. МОЛЬКОВ. 1990 V УДК 615.277.4.015.46:612.017.1 615.277.4.015.4:616-008.9
Е. Р. Якимова, Ю. И. Мольков
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКОГО КАНЦЕРОГЕНА
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
В ранее опубликованных работах [6, 8, 10] нами было показано участие альвеолярных макрофагов в развитии неспецифического симптомо-комплекса неблагоприятных изменений резистентности организма к воздействию химических загрязнений окружающей среды. При проведении ^ дальнейших исследований предусматривалось выяснение роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) в осуществлении механизмов неспецифической резистентности организма на уровне системы альвеолярные макрофаги — ткань легкого в ранние сроки биологического действия химического канцерогена Ы-нитрозодиметиламина (НДМА). Представлялось целесообразным проведение параллельных исследований метаболического статуса липидных систем (по интенсивности синтеза и ПОЛ, состоянию фосфолипидного компонента биомембран) и функции гуморального иммунитета, отражающего изменение наиболее ранних этапов иммунного ответа [1—4, 13].
В связи с изложенным выше предпринято изу-- чение сравнительной динамики биохимической ■ трансформации скорости ПОЛ, синтеза липидов и фосфолипидов, активности мембраносвязанного фермента — (З-глюкозидазы (альвеолярные макрофаги, ткань легкого), а также иммунной реакции неспецифических гетерофильных антител (сыворотка крови) в процессе развития ранних эффектов НДМА.
Методика. В эксперименте были использованы белые беспородные крысы массой 300—320 г, исследуемые сериями по 24—48 животных, разделенных на 4 группы (1—контрольная, 3 — опытные). Животным опытных групп однократно внутрижелудочно вводили НДМА (30 мг на 1 кг массы) и исследовали их через 12, 24 и 48 ч. Для определения скорости синтеза липидов и фосфолипидов в альвеолярных макрофагах и ткани легкого животным I серии за 2 ч до забоя вводили 150 мкМи пальмитиновой кислоты-14С (внутри-брюшинно). Выделяли альвеолярные макрофаги, осадок клеток получали с помощью центрифугирования суспензии, взятой от 2 животных на 1 экспериментальную точку (6 точек в группе). Готовили гомогенаты легочной ткани (1 г ткани
0
>
на 9 мл 0,85 % раствора хлористого калия). Экстракцию липидов ткани легкого и макрофагов проводили по методу J. Folch и соавт. [14]. Фос-фолипиды ткани легкого отделяли от липидов, используя тонкослойную хроматографию [5], и обсчитывали в ß-счетчике твердой фазы «Протока» (СССР). Скорость синтеза фосфолипидов выражали в процентах к скорости синтеза сбщих липидов. Интенсивность включения углерода |4С в состав липидов ткани легкого и макрофагов оценивали на жидкостном сцинтилляционном счетчике импульсов «Магк-2» фирмы «Тракор» (Голландия), учитывая эффект химического гашения. Во II серии исследований определяли активность ß-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21) и уровень ПОЛ (по содержанию малонового диальдегида) в макрофагах (от 1 животного). Активность ß-глюкозидазы оценивали с помощью ультрамикросистемы биохимического анализа [11]. Содержание малонового диальдегида [15] определяли, используя индукцию процессов неферментативного ПОЛ инкубированием суспензии макрофагов в течение 30 мин при 37 °С с добавлением Fe3+ (10 мМ) и аскорбата в концентрации 10 мМ. Выделение и подсчет клеток осуществляли по методам, описанным ранее [11]. Отдельно исследовали способность гетерофильных антител сыворотки крови крыс к агглютинации эритроцитов барана, белых беспородных мышей и морской свинки с помощью ранее описанного микрометода в планшетах [9].
Результаты исследования. Проведенное экспериментальное изучение ранних этапов мембрано-повреждающего действия НДМА позволило установить достоверное и нарастающее увеличение содержания малонового диальдегида в альвеолярных макрофагах на 59 % (р<0,05), 190 и 240 % (/?<0,01) в различные сроки (через 12, 24 и 48 ч), что составляло в контроле 0,36± ±0,09 мкмоль на 105 клеток, в опыте 0,54±0,02, 1,06±0,13 и 1,21±0,21 мкмоль на 106 клеток соответственно. Эти изменения могут быть связаны с нарушением регуляции механизмов индукции процессов ПОЛ со стороны специализированных систем клетки, что способствует увеличению
Влияние НДМЛ на содержание гетерофильных агглютининов в сыворотке крови крыс. По оси абсцисс — время после однократного введения НДМА, ч; по оси ординат — величина титра агглютинации, выраженная абсолютным значением обратного логарифма по основанию 2 [(—) 1оег]; титры агглютинации гетерофильных антител сыворотки крови крыс с эритроцитами: 1, 1а — мыши; 2, 2а — морской свинки: 3, За — барана; 1, 2, 3 — контроль, 1а, 2а, За — опыт (при воздействии НДМА).
влияния перекисей на целостность и стабильность мембранных структур.
Усиление процессов липопереоксидации в альвеолярных макрофагах сопровождалось увеличением скорости синтеза липидов и фосфолипидов в клетках макрофагов и ткани легкого, что было выявлено с помощью метода радиоактивной индикации. При этом уровень возрастания скорости синтеза липидов в макрофагальных клетках достигал 80,1, 190 % (/><0,05) и 220 % (/><0,01), в ткани легкого— 12, 65,3 и 230 % (р<0,05), что выражалось количеством углерода 14С, составляющем в контроле 397±80 расп/мин на 10® клеток, в опыте 715^180, 1154+339 и 1252±185 расп/мин на 106 клеток макрофагов, в ткани легкого— 60,6± 17,5 (контроль), 67,7±41, 100±56 и 258,9±64,8 расп/мин• г-Ю-3 (опыт) соответственно через 12, 24 и 48 ч после введения НДМА. Наряду с этим установлено существенное снижение скорости синтеза фосфолипидов (в процентном отношении к скорости синтеза общих липидов) в легочной ткани на 29,3, 47,3 и 70,0 % (/><0,001) по отношению к контролю. Динамика изученных изменений может отражать процессы усиления депонирования липидов, а также увеличение фос-фолипид-липидного дисбаланса скорости синтезируемых биокомпонентов, что связано со спецификой развития защитных реакций в клетке.
Изучение влияния НДМА на активность фос-фолипидзависимого фермента р-глюкозидазы (альвеолярные макрофаги), имеющего лизосо-мальную локализацию, позволило установить последовательное и достоверное снижение ее на 40,8, 66 и 67,7 % (/><0,001). Активность фермента в контроле составляла при этом 1,14± ±0,12 нмоль/мин на 106 клеток, в опыте — 0,68± ±0,14, 0,39±0,06 и 0,37±0,04 нмоль/мин на 10« клеток в различные сроки. Это может свидетель-
ствовать о дестабилизации фосфолипиднс-го компонента лизосомальной мембраны, способствующей, вероятно, гидролитической деградации и разрушению других ультраструктурных элементов клетки, что было показано ранее [12].
Анализ взаимосвязи полученных результатов позволил установить, что в процессе увеличения* содержания малонового диальдегида (альвеолярные макрофаги) проявляется более выраженная корреляционная зависимость с уменьшением активности р-глюкозидазы в этих клетках (г — =—0,68 и —0,81 через 24 и 48 ч) и снижением относительной скорости синтеза фосфолипидов ткани легкого {г——0,75 и —0,88 через 24 и 48 ч), чем с увеличением скорости синтеза общих липидов (в ткани легкого и макрофагах г=0,56 и 0,67 в те же сроки). Это позволяет судить о наличии непосредственного влияния усиления процессов ПОЛ на целостность и стабильность фос-фолипидного остова клеточных мембран и усугубление фосфолипид-липидного дисбаланса в соотношении синтезируемых соединений на уровне г системы альвеолярные макрофаги — ткань лег- * кого.
Исследование гетерофильных агглютининов в сыворотке крови показало, что уже через 12 ч воздействия отмечается выраженный токсический эффект канцерогенного вещества на выработку гетерофильных антител. При этом было установлено достоверное снижение титра в реакции агглютинации как с эритроцитами мыши, так и с эритроцитами барана: у контрольных животных среднее значение преобразованной величины титров составляло 5,6±0,7 и 3,4±0,3, у подопытных — 1,8±0,2 и 1,6±0,2, т. е. было снижено на 67,9 и 53,0 % (/><0,001) соответственно. Это может быть связано с нарушением функции ряда звеньев иммунной защиты, в том числе В-лимфоцитов^ и других клеточных систем, ответственных за выработку гетерофильных антител. Подобные изменения сохранялись через 24 и 48 ч, однако при этом наблюдалась заметная тенденция к восстановлению титров, причем сдвиги реакции агглютинации со стороны эритроцитов мыши и морской свинки имели сходный характер (см. рисунок). Полученные данные позволяют судить о том, что в наиболее ранние сроки функция гетерофильных агглютининов может служить первичной мишеныо биологического действия химического канцерогена. Нарастающее снижение числа и жизнеспособности макрофагов, установленное ранее [7], служит, возможно, пусковым моментом постепенного восстановления статуса гетерофильных антител.
Таким образом, исследование ранних биоэффектов изученного химического канцерогенеза показало наличие иммунобиохимических сдвигов, значение которых состоит в проявлении дестаби- & лизации со стороны фосфолипидного компонента Т мембран лизосом, фосфолипид-липидного баланса интенсивности синтеза в клетке (альвеолярные макрофаги, ткань легкого) и функции гетеро-
фильных агглютининов (в наиболее ранние сроки) в зависимости от изменения процессов ПОЛ, последовательном снижении функции изученных элементов системы обеспечения неспецифической иммунобиологической резистентности организма, развитии защитных реакций за счет индукции литогенеза.
Литература
1. Бердинских Н. К., Санина К. Л., Гула Е. П.. Мельникова Н. Н. //Вести. АМН СССР.— 1982. — № 3. — С. 53-55.
2. Кишев М. Г.// Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии. — Краснодар, 1983. —С. 121 — 122.
3. Козлов В. А. // Клеточные факторы регуляции иммуногенеза. — Новосибирск, 1985. — С. 88—95.
4. Козлов 10. П. //Липиды: Структура, функция, биосинтез, превращения. — М., 1977.— С. 86—93.
5. К оценке по системе биохимических, морфологических, иммунологических и физиологических показателей ранних изменений функциональных реакций организма человека при воздействии факторов окружающей среды: Метод, указания, —Пермь, 1986.— С. 55—59.
ЧЙ
Чг
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1990 УДК 615.285.7.065:616-006.6
6. Литвинов И. Н. //Гиг. и сан, — 1985. — № 6. — С. 10— 13.
7. Меркурьева Р. В.. Литвинов И. П., Аулика Б. В. и др.//Бюл. экспер. биол. — 1982. — № 4. — С. 43—44.
8. Меркурьева Р. В., Судаков К■ В., Бонашевская Т. И., Журков В. С. // Медико-биологические исследования в гигиене, —М„ 1986.— С. 30—32.
9. Мольков 10. И. Иммунологические аспекты профилактики, диагностики и терапии рака. — М., 1965. — С. 126-137.
10. Сидоренко Г. И., Ахундов В. Ю., Литвинов Н. Н. и др.//Бюл. экспер. биол.— 1982, —№6. — С. 101— 103.
11. Система биохимических, цитологических, цитохимических и электронно-микроскопических критериев оценки функционального состояния альвеолярных макрофагов человека и экспериментальных животных при воздействии факторов окружающей среды: Метод, рекомендации.—М„ 1983.— С. 13—19.
12. Фетисов В. В., Литвинов Н. Н., Гасимова 3. М. // Бюл. экспер. — 1987, —№ 1. —С. 114—117.
13. Фрейдлин И. С. Система мононуклеарных фагоцитов.— М„ 1984, —С. 50—54.
14. Folch /., Lees М.. Sloane-Stanley G. Н.Ц J. biol. Chem. — 1957. — Vol. 226. — P. 497—509.
15. Tappet A. L., Zalltin H. // Arch. Biochem. — 1959. — Vol. 80. — P. 326-336.
Поступила 07.05.88
И. В. Андреева, И. И. Држевецкая, О. 10. Русина, Р. И. Анискина,
А. Г. Скавронская
ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ КАНЦЕРОГЕННОСТИ ПЕСТИЦИДОВ В КРАТКОСРОЧНЫХ ТЕСТАХ
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР, Москва
Широкое применение пестицидов в мировой практике представляет значительную опасность, поскольку эти вещества вызывают как острые интоксикации [11], так и отдаленные эффекты — рост аллергической и онкологической заболеваемости [4]. Формирование безопасного ассортимента пестицидов предполагает исследование их в краткосрочных тестах [3, 9]. Первое место среди этих тестов занимает исследование на мутагенную активность в бактериальной системе [10].
В экспериментах, представленных в настоящем сообщении, использовали штаммы сальмонелл системы Ames: ТА100, ТА1535 (мутации замены пар оснований), ТА98 (мутации сдвига рамки считывания) [10], а также сконструированный в лаборатории генетики бактерий тест-штамм AG262 [5].
Учитывали реверсии к прототрофности. В качестве полноценных питательных сред применяли питательный бульон Lennox, агар Lennox, в качестве минимальной среды — минимальную среду А, содержащую 1,5% агара «Difco» [8]. я Положительными контролями служили извест-ные мутагены: этилметансульфонат (ЭМС) фирмы «Serva», 4-нитрохинолин-1-оксид фирмы «Da-lichi Pure Chemicals», бенз(а)пирен фирмы
«Serva», циклофосфан —: отечественный коммерческий препарат, 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4, 5, 9, 10-тетрагидро-4,9-диазог;ирен (ДДДТДП)—отечественный препарат [1], ме-тилметансульфонат фирмы «Merck Schuchardt». Препараты были испытаны с метаболической активацией и без нее. Для обеспечения метаболической активации препаратов использовали микросомную фракцию печени крыс с кофакторами (S9mix), приготовленную по Ames [10]. Ree- и Pol-assay-эксперименты проводили по методам, описанным J. Shirasu и соавт. [13] и М. Hollstein и соавт. [12]. Для испытания препаратов в жидкой среде культуры сальмонелл засевали на ночь в бульон Lennox. Ночную куль-туру разводили в 10 раз свежим бульоном и подращивали до логарифмической фазы (108кл/мл) при 37 °С на качалке. Затем культуру отмывали физиологическим раствором путем центрифугирования и ресуспендировали в физиологическом растворе. К бактериальной культуре, содержащей 1-Ю8—2-Ю8 кл/мл, добавляли испытуемое вещество в различных концентрациях и инкубировали при 37 °С в течение 60 мин. Затем отмывали ее от вещества и высевали без разведения на селективные для мутантов среды и соответствующие разведения — на полноценную среду
