CC BY
5УДК 575.22: 631.527: 633.413
Л.В. Милько, А.М. Свирщевская, А.В. Кильчевский
ОЦЕНКА ПОЛИМОРФИЗМА ДНК ГИНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ И СОРТА БЕЛОРУССКАЯ ОДНОСЕМЯННАЯ 69 САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (BETA VULGARIS L.) С ПОМОЩЬЮ RAPD-МАРКЕРОВ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Современное развитие сельскохозяйственных технологий предполагает разработку и внедрение новых подходов для изучения генетического разнообразия исходного материала сельскохозяйственных культур, что во многом зависит от прогресса в исследовании молекулярно-генетического полиморфизма генотипов. Одним из эффективных приемов изучения генетической изменчивости является анализ продуктов амплификации фрагментов ДНК, генерируемых в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР). Широкое распространение для дифференциации и распределения сортов по уровню генетической близости получили методы ЯЛРБ, ББКР, ЛБЬР [1]. Для этих типов маркеров характерна более высокая по сравнению с биохимическими и морфологическими маркерами разрешающая способность, позволяющая дифференцировать генотипы линейного, гибридного и сортового материала, используя данные по многим локусам.
ЯЛРБ-анализ - это быстрый метод выявления генетического полиморфизма, который применяется для геномного маркирования в эволюционных исследованиях, для картирования хромосом и маркирования хозяйственно-ценных признаков, идентификации и дифференциации селекционно-значимого генетического материала различных сельскохозяйственных растений. С помощью ЯЛРБ маркеров были проанализированы виды и сорта картофеля [2], различные генотипы томатов [3], ячменя [4], пшеницы [5], инбред-ные линии подсолнечника [6] и многих иных культур. У свеклы ЯЛРБ маркеры были применены для таксономической характеристики ее однолетних диких видов - близких родичей
культивируемых свекл, содержащих важные для селекции признаки, что привело к успешному разделению образцов на 3 таксономических группы macrocarpa, adanensis и maritima [7]; при картировании генов устойчивости к нематоде и окраски гипокотиля, что привело к установлению 4 первичных групп сцепления, включающих 9 RAPD локусов, 2 изофермент-ных локуса и 2 указанных гена [8], при картировании генов устойчивости к ризомании Rr1, окраски гипокотиля R и односемянности плодов M с установлением 50 RAPD и 248 ПДРФ локусов [9]. Была также предпринята попытка идентифицировать сорта сахарной свеклы с помощью RAPD фингерпринтинга [10].
Сахарная свекла - облигатный перекрестник, и несмотря на то, что большинство ее современных сортов являются F1 гибридами, полученными с использованием ЦМС, они не являются генетически выровненными. Значительная генетическая вариабельность, наблюдаемая у нее, детектируется как с помощью изоферментов, так и с помощью ПДРФ маркеров [11], что позволило использовать эти данные для целей идентификации удвоенных гаплоидных линий свеклы [12]. Также была продемонстрирована межсортовая и внутри-сортовая изменчивость, выявленная с использованием ПДРФ маркеров при попытке идентификации сортов свеклы [13]. Принимая во внимание результаты, полученные японскими и британскими исследователями, мы взяли в работу выровненный линейный материал сахарной свеклы. Эти гиногенетические линии были созданы нами в лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии НАНБ путем эксперимен-
тального гиногенеза in vitro, и формировались при постоянном изучении различными методами (цитологии, цитофотометрии, изофер-ментного анализа, ДНК маркирования) [14].
Цель настоящей работы заключалась в оценке уровня полиморфизма ДНК у близкород-
ственных гиногенетических линий сахарной свеклы, полученных в культуре неоплодот-воренных семяпочек in vitro растений сорта Белорусская односемянная 69 (2х) и у самого сорта, а также возможности дифференциации между ними c помощью RAPD-маркеров.
Материалы и методы исследования
Материал. Генетический материал включал 9 гиногенетических линий сахарной свеклы, полученных при культивировании различных неоплодотворенных семяпочек in vitro от нескольких донорных растений сорта Белорусская односемянная 69, и сам сорт.
Выделение ДНК. Использовали метод выделения тотальной ДНК из растений сахарной свеклы с помощью протеиназы К [15].
Методика RAPD-ПЦР. В опытах использовали произвольные праймеры длиной 10 нуклеотидов серии Р- Р28, Р36, Р38, Р39, Р43, Р44, Р46, Р48, Р49, Р53 [8]. Их характеристика приведена в таблице 1. По наборам продуктов реакции, представляющих собой фрагменты ДНК разной длины, регистрировались различия между геномами близкород-
ственных линий. Такие фрагменты могли служить специфическими геномными маркерами и позволяли находить полиморфные локусы генома. Реакционная смесь для проведения RAPD - ПЦР объемом 20 мкл содержала де-ионизированную воду, 1 х ПЦР-буфер, 3 мМ М§С12, по 200 мкМ дНТФ 4 типов, 0,25 мкМ праймера, 40 нг ДНК образца и 0,1 ед. Taq-полимеразы. Амплификацию с произвольными праймерами проводили, используя прибор «MJ Mini Personal Thermal Cycler BIO-RAD» в режиме: первая денатурация 94°С - 2 мин 12 сек, один цикл с отжигом праймера при 39°С 2 мин и элонгацией 72°С 2 мин, затем 35 циклов с профилем (94°С 40 сек, 47°С - 1 мин 40 сек, 72°С 1 мин 30 сек) с последней элонгацией в течение 7 мин при 72 °С.
Таблица 1
Характеристика произвольных ЯАРБ-праймеров, использованных для выявления полиморфизма ДНК между близкородственными генотипами сахарной свеклы
Праймер Последовательность GC состав, % Размер ПЦР фрагментов, п. н.
Р28 5'-CAAACGTCGG-3' 60 550-1500
Р36 5'-CCG AATTCGC-3' 60 490-1000
Р38 5'-GATACGTTGTC-3' 46 500-800
Р39 5'-CCAGTTCGCC-3' 70 550-1500
Р43 5'-AGTCAGCTGC-3' 60 350-1500
Р44 5'-GGACCCCGCC-3' 90 470-1500
Р46 5'-GGTTGGGGAG-3' 70 370-1400
Р48 5'-GCGGTGCTCG-3' 80 530-1500
Р49 5'-GACAGCCTAC-3' 60 320-1200
Р53 5'-GTCTAAGTCG-3' 50 830-3000
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием в трис-боратном буфере в течение 3,5 часов при напряжении
80 В в двух-трех повторностях. Спектры полученных амплифицированных фрагментов ДНК фотографировали в ультрафиолетовом свете. Для определения длины фрагментов
использовали маркер молекулярной массы (М) 100 bp + 1,5 Kb DNA Ladder (Fermentas). На основе полос с хорошим разрешением, соответствующих фрагментам ДНК размером в диапазоне в основном 350 - 1500 п.н., и только для праймера Р53 - до 3000 п.н., которые полностью воспроизводились, составляли би-
нарные матрицы по каждому из праймеров, в котором отмечалось «присутствие» (1) или «отсутствие» (0) фрагментов с одинаковой молекулярной массой на электрофореграмме. Для построения дендрограммы использовали компьютерную программу ТКЕЕСОК [16] с расчетом значений бутстрепа [17].
Результаты и обсуждение
Исследовали близкородственный линейный материал сахарной свеклы, который был получен методами культивирования in vitro неопло-дотворенных семяпочек растений сорта сахарной свеклы Белорусская односемянная 69 (2х). Всего было проанализировано 9 линий гино-генетического происхождения, среди которых растения пяти были репродуцированы из семян, а четыре были представлены растениями, культивируемыми in vitro. К первой группе относились: линия Белорусская 69-I от одного из трех селекционных компонентов сорта и ее две производные - облученная на стадии семян дозой 300 Грэй линия Белорусская 69-I 300Gy и линия Белорусская 69-1-7(4), а также линия Белорусская 69-3 и ее производная Белорусская 69-3(5). Линия Бел 69-3 была представлена растениями, расклонированными приемами микроклонального размножения in vitro от единичного растения №3, пересаженными в грунт и размноженными на изолированном участке для получения семян. Ко второй группе относились линии Белорусская 69 - 3(7), Белорусская 69 - 3(12), Белорусская 69 - 3(14) и Белорусская 69 - 3(15).Особенностью этих четырех гиногенетических линий являлось то, что они были индуцированы в культуре in vitro позже других линий и поэтому не прошли ни одного цикла семенной репродукции на момент анализа, как остальные исследованные линии, поэтому образцы их ДНК выделяли из листьев культивируемых in vitro растений.
Контроль был представлен диплоидным сортом-стандартом для Беларуси - Белорусская односемянная 69. ДНК линий были представлены смесью образцов ДНК листьев от 10 растений (bulk), а сорта - смесью от 20 растений, а при оценке внутрисортовой изменчивости - 20 образцами ДНК листьев от 20 индивидуальных растений. Проведенный ранее на гиногенетических линиях цитофотометри-
ческий анализ показал, что при регенерации из неоплодотворенных семяпочек донорного диплоидного растения сахарной свеклы возникают в основном гаплоидные побеги, но в 8-10% случаев регенерируют исходно диплоидные, т.е. гетерозиготные, побеги [18]. В рассматриваемой выборке гиногенетических линий такой гетерозиготной линией оказалась только линия Бел 69 - 3(5), все остальные линии были зафиксированы на начальных этапах формирования in vitro как гаплоидные. Линии, прошедшие циклы семенной репродукции, были диплоидными. Линии, представленные культивируемыми растениями, были миксо-плоидными, включающими в разных соотношениях как гаплоидные клетки, так и удвоенн-ные гаплоидные клетки ( х + хх).
Среди упомянутых ранее работ [7-10], в которых RAPD маркеры у свеклы были применены для целей таксономической характеристики ее видов, при картировании генов устойчивости к нематоде, ризомании, окраски гипокотиля и односемянности плодов, наиболее близким по поставленной нами задаче дифференциации генотипов свеклы было исследование авторов из Великобритании о возможности идентификации сортов сахарной свеклы с помощью RAPD фингерприн-тинга [10]. В нем 17 растений 7 сортов (по 2-3 отдельных растения от каждого сорта) были проанализированы с применением 10 случайных праймеров, а затем для 15 растений от 2 сортов сахарной свеклы была оценена внутри- и межсортовая изменчивость по 5 лучшим праймерам, выявившим наибольшее количество полиморфных RAPD локусов. В наших опытах была оценена возможность дифференциации между близкородственными генотипами сахарной свеклы - гиногене-тическими линиями, полученными в культуре неоплодотворенных семяпочек in vitro расте-
ний сорта Белорусская односемянная 69 (2х) и самим сортом, при использовании 10 случайных декамерных ЯДРО праймеров, а внутри-сортовая изменчивость сорта определена на основе оценки полиморфизма ДНК в ЯЛРБ локусах спектров индивидуальных растений выборки. Были определены праймеры - Р 28, Р 43, Р 44, Р 48 и Р 53, применение которых позволило детектировать полиморфные локусы.
М
1 2
3
4
5 6
Электрофоретические спектры, полученные в результате ПЦР с остальными 5 праймерами у исследованных гиногенетических линий сахарной свеклы были однотипными. Продукты ПЦР представляли фрагменты амплификации размером от 320 п.н. до 3000 п.н., количество фрагментов амплификации в спектрах линий варьировало в зависимости от праймера от 3 до 15 (рисунки 1 и 2).
7 8 9 10
ЩЯШШШШ _ ШшШ SS3S3
890 п.н.
^ > ■ 700 пн
_700 пн.
—630 пн.
,„ ......я L, , ■ „,,
шшшшшш
Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК гиногенетических линий и сорта сахарной свеклы Белорусская односемянная 69 (2х) с праймером Р 44.
Обозначения: М- маркер 100 Ър+1,5КЪ; 1- Бел 69 (2х) сорт, 2- Бел 69 - I -7(4) 02 г, 3- Бел 69 - I, 4- Бел 69- I 300ву, 5- Бел 69- 3, 6- Бел 69- 3 (5), 7- Бел 69- 3 (7), 8- Бел 69- 3 (12), 9- Бел 69- 3 (14), 10- Бел 69- 3 (15).
Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК гиногенетических линий и сорта сахарной свеклы Белорусская односемянная 69 (2х) с праймером Р 53.
Обозначения: М- маркер 100 Ър+1,5КЪ; 1- Бел 69 (2х) сорт, 2- Бел 69-1-7(4) 02 г, 3 - Бел 69-1, 4 - Бел 69- I 300ву, 5 - Бел 69-3, 6 - Бел 69-3 (5), 7 - Бел 69-3(7), 8 - Бел 69-3(12), 9 - Бел 69-3(14), 10 - Бел 69-3(15).
На приведенных электрофореграммах отмечены позиции полиморфных локусов и их размеры в парах нуклеотидов: 890, 700 и 630 п.н. при амплификации с праймером Р44 и 1200 п.н. - с праймером Р 53.
Количество полиморфных локусов, встречающихся в электрофоретических спектрах линий и сорта изменялось от двух до семи. Уровень полиморфизма ДНК в ЯЛРБ локусах варьировал от 20 до 77,7%. Всего в данной выборке было исследовано 53 ЯЛРБ-локуса, 18 из которых были полиморфными. Таким образом, средний уровень полиморфизма ЯЛРБ локусов среди исследованных генотипов сахарной свеклы составил 33,9%.
Кроме того, в ходе анализа в ряде случаев были обнаружены полученными методом ЯЛРБ уникальные полосы-ампликоны, характерные для отдельных генотипов. На-
пример, при использовании в ПЦР прайме-ра Р 28 линия Белорусская 69-3(15) имела в спектре фрагменты ДНК размером 1500 п.н. и 550 п.н., линия Бел 69-3(7) - ампли-кон размером 950 п.н., при амплификации с праймером Р 43 у линии Белорусская 69-3(15) задокументирован уникальный ампликон размером 550 п.н., а линии Бел 69-3(12) - ампликон размером 450 п.н.
На основании полученных данных по 53 ЯЛРБ локусам, характеризующих степень генетического сходства/различия изученных близкородственных генотипов сахарной свеклы была построена дендрограмма (рисунок 3). На ней отмечены все значения бутстре-па (вероятности формирования кластера), хотя топология дерева в участках со значениями бутстрепа менее 50 % не может считаться достоверно установленной.
0.1
37
36
28
18
53
51
43
44
Бел69-1
Бел69-1 300G
Бел69-[-7(4)
Бел69(2х) сорт
Бел69-3(5)
Бел69-3(7)
Бел69-3(15)
Бел69-3
Бел69-3(12)
Бел69-3(14)
Рис. 3. Дендрограмма, отражающая генетическое сходство между исследованными гиногенетическими линиями, полученными на основе диплоидного сорта сахарной свеклы Белорусская односемянная 69.
Из дендрограммы следует, что диплоидная гетерозиготная гиногенетическая линия Бел 69-3(5) кластеризовалась со значением бут-стрепа 53% с миксоплоидной линией Бел 69-3(7), в которой присутствовали диплоидные (удвоенные гаплоидные) клетки и гаплоидные клетки. Гаплоидные линии Бел-3(12) и Бел-3(14) образовали кластер со значением бутстрепа 44%, и это представляется логич-
ным, поскольку обе эти линии были взяты для анализа еще на ранней стадии формирования in vitro. При построении дендрограмм на основании данных по другим типам ДНК маркеров, например, SSR маркеров, на более репрезентативных выборках, включающих линейный и гибридный материал сахарной свеклы разного уровня плоидности, полученный из генетически отдаленных источ-
ников, нами также было отмечено формирование с высокой вероятностью кластеров из генотипов одинакового уровня плоидности -гаплоидов, тетраплоидов [19]. Тем не менее, в данном опыте третья исходно гаплоидная линия Бел 69-3(15) не попала в один кластер с другими гаплоидами. Образец Бел 69-3, являющийся родительской формой для 5 гино-генетических линий, также достоверно не вошел в общий кластер ни с гаплоидными, ни с диплоидными/миксоплоидными хх+х линиями, индуцированными на его основе. Другой кластер (бутстреп 51%) по результатам ЯЛРБ анализа объединил две линии Бел-1 и Бел-1 3000у, каждая из которых была сформирована из семяпочечных регенерантов от нескольких растений селекционного компонента I сорта Белорусская односемянная 69, представляющего собой отселектированную по ряду технологических характеристик популяцию сорта. Третья линия Бел 69 1-7(4) была индуцирована из единичной семяпочки одного растения этого компонента сорта и, по-видимому, была более выровненной по сравнению с двумя другими линиями, созданными на более широкой генетической основе. Она располагается на
дендрограмме рядом с ними, но в общий кластер не вошла ( бутстреп 37%).
Расположение дерева с кластерами и масштаб «генетической близости - генетической отдаленности» (0.1) указывает на близкое родство между всеми представленными образцами. При использовании ББЯ маркеров на больших выборках, включающих и линии, и гибриды сахарной свеклы, было показано, что генотипы, прошедшие стадию семенной репродукции, не «смешивались» с образцами, которые этой стадии не прошли [19]. При ЯЛРБ анализе эта тенденция просматривается, но не является очевидной. Для сорта Белорусская односемянная 69, воспроизводимого семенами, образцы ДНК могли быть сформированы по-разному - как из смеси листьев 20 растений, так и как из листьев популяции 20 индивидуальных растений. Таким образом, появилась возможность оценить его внутри-сортовую изменчивость, используя апробированные ЯЛРБ праймеры. На рисунке 4 приведены спектры 10 растений этой выборки, полученные при разделении в геле продуктов амплификации с праймером Р 48 с отмеченными полиморфными ЯЛРБ локусами.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
I 4 I 4 ?
1350 п.н. 1200 п.н. 1090 п.н. 820 п.н.
Рис. 4. КЛРБ-спектры индивидуальных растений сорта сахарной свеклы Белорусская односемянная 69, полученные при использовании в ПЦР праймера Р 48
Обозначения: М - маркер 100 Ър+1.5КЪ; 1-10 образцы ДНК индивидуальных растений сорта Белорусская односемянная 69. Отмечены позиции полиморфных локусов и их размеры, в п.н.
Средний уровень полиморфизма ДНК в ЯЛРБ-локусах при популяционном анализе («б» вариант, таблица 2) сорта Белорусская односемянная 69 при использовании 5 прай-меров составил 44.6%, причем по трем прай-
мерам Р43, Р44 и Р48 из 5 соотношение полиморфных локусов к проанализированным было выше, чем при использовании образцов ДНК - смесей («а» вариант, таблица 2). Средний уровень полиморфизма ДНК в ЯЛРБ-
локусах в этом случае составил 36,3%. Кроме того, при оценке внутрисортовой изменчивости методом популяционного анализа дополнительную информацию внес праймер Р39, с его помощью были выявлены 12 ЯЛРБ локу-сов, 4 из которых оказались полиморфными. Спектры фрагментов ДНК, амплифицирован-ных с помощью этого праймера для других генотипов свеклы при использовании ДНК-смесей не включали полиморфные локусы, в том числе при повторном воспроизведении.
Невысокую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции (концентрации ионов магния, соотношению праймер/ матрица, температурному режиму) следует отнести к недостаткам метода. В экспериментах на близкородственных генотипах сахарной свеклы для получения воспроизводимых
спектров электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК в ага-розном геле проводились 2-3 раза, а в ряде случаев амплификация проводилась повторно. ЯЛРБ метод имеет и другие особенности: многие праймеры дают разные продукты амплификации, которые могут иметь одинаковую электрофоретическую подвижность, и, следовательно, их трудно различить при использовании обычной техники электрофореза; малейшие загрязнения препарата ДНК могут вызвать артефакты, связанные с амплификацией чужеродной ДНК. Предполагается, что изменение ЯЛРБ-спектра, т. е. исчезновение или появление новой полосы ДНК, отражает различные изменения генома, например, мутацию в участках, узнаваемых праймером, или делецию/инсерцию в промежутке между такими участками [20].
Таблица 2
Характеристика ЯАРБ-спектров 20 растений сорта сахарной свеклы Белорусская
односемянная 69, полученных при использовании 5 праймеров, выявивших полиморфные ЯАРБ локусы при разных вариантах формирования образца ДНК (а- смесь растений и б-индивидуальные растения)
Праймеры Р28 Р43 Р44 Р48 Р53
Вариант ДНК а б а б а б а б а б
Количество проанализированных локусов 9 9 15 15 12 9 10 16 7 7
Количество полиморфных локусов 7 7 3 4 3 3 3 9 2 2
Уровень полиморфизма при «а» и «б» вариантах образца ДНК, % 77,7 77,7 20,0 26,6 25,0 33,3 30,0 56,3 28,6 28,6
Средний уровень полиморфизма на праймер, % 77,7 23.3 29,2 43,2 28,6
ЯЛРБ-маркеры наследуются как доминантные, то есть фрагменты амплификации ДНК из гетерозигот не отличаются от фрагментов одной из родительских форм. Этот недостаток является особенно существенным в генетическом анализе, так как при оценке расщеплений выявляются не все классы, что существенно
ограничивает получаемую информацию. Лишь изредка наблюдается кодоминантность ЯЛРБ-маркеров, которая связана с перемещением или появлением нового участка связывания с праймером, чаще всего в результате инверсий и делеций [20]. В настоящей работе ампликоны рассматривались как доминантные маркеры.
Заключение
С использованием набора маркеров была исследована вариабельность более 50 RAPD ло-кусов генома у близкородственных генотипов сахарной свеклы - гиногенетических линий, полученных в культуре неоплодотворенных семяпочек in vitro растений сорта Белорусская односемянная 69 (2х) и у самого сорта. Апробированы 10 произвольных декамерных праймеров и отобраны 5 из них, позволяющих выявить полиморфные локусы и уникальные ампликоны, лежащие в основе оценки генетического сходства/различия и возможности дифференциации у близких в генетическом отношении генотипов свеклы. Выявление специфичных фрагментов амплификации у трех линий из девяти исследованных в полученных RAPD спектрах дает определенное основание для использования этого метода молекулярного анализа для генотипирования данного материала сахарной свеклы. Представляется очевидным, однако, что количество использованных праймеров серии Р, позволивших детектировать полиморфные RAPD локусы у исследованных генотипов, было недостаточным для того, чтобы замаркировать все образцы свеклы данной выборки. Отмечена тенденция по кластеризации линий одного происхождения (компонент I сорта Белорусская односемянная 69), одного уровня плоидности (гаплоидных) и
в зависимости от варианта репродукции линий (семенами или микроклонированием in vitro), подтвержденная ранее данными микросател-литного анализа [19]. По-видимому, геноти-пирование близкородственного генетического материала сахарной свеклы с помощью RAPD маркеров возможно при условии: а) использования больших (30-50) выборок образцов ДНК индивидуальных растений, представляющих ее линии и сорта, поскольку у перекрестноо-пыляемой свеклы при семенной репродукции могут встречаться генетические " загрязнения", и б) скрининга их с помощью большого коли -чества (50-200) произвольных RAPD прайме-ров, т. е. при проведении широкомасштабных популяционных исследований. Средний уровень полиморфизма ДНК в RAPD-локусах при популяционном анализе сорта Белорусская односемянная 69 при использовании 5 прай-меров составил 44,6%.
Мы выражаем благодарность старшему научному сотруднику лаборатории нехромосомной наследственности Института М.Г.Синявской за оказанную методическую помощь при организации экспериментов.
Работа была выполнена при поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь (проект № Б07М-224).
Список использованных источников
1. Гостимский, С. А. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений / С.А. Гостимский, З.Г, Кокаева,
B.К. Боброва // Генетика. - 1999. - Т. 35, №11. -
C. 1538-1549.
2. Оганисян, А.С. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR / А С. Оганисян, Е.З. Кочиева, А.П. Рысков // Генетика. - 1996. Т. 32, № 3. -С. 448-451.
3. Дорохов, Д.Б. Использование полиме-разной цепной реакции для идентификации генотипов томата / Д.Б. Дорохов // Изв. АН. РМ. Сер. биол. и хим. наук. - 1993. - №4. - С.19-22.
4. Сиволап, Ю.М. Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя (Hordeum vulgare L.) / Ю.М. Сиволап, Р.Н. Календарь,
В.П. Нецветаев // Генетика. - 1997. - Т. 33, №1. - С.53-60.
5. Сиволап, Ю.М. Идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD- и SSRP-анализа / Ю.М. Сиволап, Е.А. Топчиева, С.В. Чеботарь // Генетика. - 2000. - Т. 36, №1. - С. 44-51.
6. Сиволап, Ю.М. RAPD-анализ молеку-лярно-генетического полиморфизма подсолнечника / Ю.М. Сиволап, А.Е. Солоденко,
B.В. Бурлов // Генетика. - 1998. - Т. 34, №2. -
C. 266-271.
7. Shen Y. The taxonomic characterization of annual Beta germplasm in a genetic resources collection using RAPD markers /Y.Shen, H.J.Newbury and B.V. Ford-Lloyd // Euphytica.-1996. - Vol. 91. P. 205-212.
8. Uphoff H. / Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD) Markers in Sugar Beet (Beta vulgaris L.): Mapping the Genes for Nematode Resistance and Hypocotyl Colour / H.Uphoff and G. Wricke// Plant Breeding. - 1992. - Vol. 109. -P. 168-171.
9. Barzen E. An extended map of the sugar beet genome containing RFLP and RAPD loci/ E. Barzen, W. Mechelke, E. Ritter, E. Schulte-Kappert // Theor. And Appl. Genet. - 1995 -Vol. 90. - P. 189-193.
10. Ford-Lloyd B.V The Use of RAPD for the Identification of Sugar Beet Varieties / B.V. Ford-Lloyd., M.Munthali, and H.J.Newbury// Journal ofSugar Beet Research. October-December 1993. - Vol. 30, N 4. - P. 291-298.
11. Sabir A. / Determination of genetic stability using isozymes and RFLPs in beet plants regenerated in vitro / A. Sabir , G. Todd, J. Catty and B. V. Ford-Lloyd // Theor. Appl Genet. - 1992. Vol. 84, N 1-2. - P. 113-117.
12. Schmidt, T.DNA-fingerprinting in sugar beet ( Beta vulgaris L.) - identification of double-haploid breeding lines / T. Schmidt, K.Boblenz, M.Metzlaff, D.Kaemmer, K.Weising, G.Kahl // Ther. Appl. Genet. - 1993. -Vol. 85. - P. 653-657.
13. Nagamine, T./Use of restriction fragment length polymorphism to fingerprint beets at the genotype and species/ T. Nagamine , G. A. Todd, K. P. McCann, H. J. Newbury and B. V. FordLloyd // Theor. Appl. Genet. - 1989. - Vol. 78, N 6. - P. 847-851.
14. Svirshchevskaya A.M./ Production and Performance of Gynogenetic Sugarbeet lines / Svirshchevskaya A.M., Dolezel J. // J. of Sugar
Beet Research (USA). October-December, 2000. -Vol.37, N 4. - P.117-133.
15. Plaschke J. / Detection of genetic diversity in closely related wheat using microsatellite markers / J.Plaschke, M.W. Ganal, M.S. Roder // Theor. Appl.Genet. -1995. - Vol. 91 - P. 1001-1007.
16. Van de Peer, Y. Treecon for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for Microsoft Windows environment / Y.Van de Peer, R. De Wachter // Comput. Appl. Biosci. - 1994. -Vol. 10.- P. 569-570.
17. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap / J. Felsenstein // Evolution. - 1985. - V. 38. -P. 783-791.
18. Svirshchevskaya A.M., Dolezel J. Karyological characterization of sugar beet gynogenetic lines cultured in vitro. // J. of Applied Genetics. - 2001. - Vol. 42, N 1. - P.21-32.
19. Malyshev S. SSR markers assessment of genetic diversity in sugar beet lines/Sergey Malyshev,Anna Svirshchevskaya, and Nikolai Kartel / Modern Variety Breeding for Present and Future Needs (2008). Eds. J.Projens & M.L.Badenes. Editorial Universidad Politecnica de Valencia. - 2008. Valencia, Spain. - P. 176-177.
20. Williams, J.G.K. Genetic Analysis Using Random Amplified Polymorphic DNA Markers/ J.G.K. Williams, M.K. Hanafe, J. A. Rafalski, S.V. Tingey // Method Enzymol. - 1993. -Vol. 218. - P. 704-740.
Дата поступления статьи 10 апреля 2009 г.
