CC BY
24УДК 633.63: 577.1
worn
Селекция сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) с помощью молекулярных маркеров
Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук Д.Н. ФЕДОРИН, канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (e-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение
Селекция с помощью маркеров (СПМ) — это метод отбора, который играет всё более важную роль в программах селекции большинства сельскохозяйственных культур, в том числе сахарной свёклы. Молекулярная селекция позволяет быстро отобрать большое количество растений на раннем этапе процесса селекции, в результате чего для внедрения новых сортов и гибридов может потребоваться гораздо меньше времени: работу по созданию каждого нового сорта или гибрида можно сократить на несколько лет. Молекулярные маркеры — это небольшие сегменты ДНК, которые расположены в непосредственной близости от гена (или нескольких генов) в ДНК растения, придающего ему желаемое свойство, например, большую засухоустойчивость, которое селекционер хочет сформировать у нового сорта. Анализ небольшого фрагмента ткани растения, взятого из его новой разновидности, в отношении которой проводится отбор, при использовании маркеров в качестве индикаторов позволяет селекционеру понять, имеется ли желаемый ген в новом растении. Если такой ген отсутствует, селекционер сразу же может перейти к анализу следующего растения. Молекулярная селекция в настоящее время является одной из приоритетных областей наращивания потенциала в рамках программ селекции сахарной свёклы. Маркерная селекция отличается от классической тем, что проводит оценку генов в растении молекулярными методами и позволяет исследователю выбрать лучшую комбинацию для скрещивания. Таким образом, селекционный процесс идёт более целенаправленно и ускоренными темпами [2, 3]. Маркерную селекцию в своей работе широко используют ведущие в области агропромышленных технологий компании, такие как KWS, Advanta Seeds UK Ltd, Syngenta и многие другие.
Так, было проведено исследование для поиска обильного источника микросателлитных (SSR-маркеров) в целях развития маркерной селекции. 41 микросателлитный маркер был изолирован из геномной библиотеки Beta vulgaris ssp. maritima и 201 SSRs были извлечены из библиотеки Beta vulgaris ssp. vulgaris. Исходя из этих маркеров с использованием 92 особей F2 от скрещивания сахарной и столовой свёклы была построена генетическая карта высокой плотности. На карте представлены 284 маркера,
которые насчитывают более 555 сМ и охватывают девять хромосом вида средней плотности маркеров, маркер каждые 2,2 сМ. Таким образом, был создан набор маркеров к девяти хромосомам сахарной свёклы [7].
Иностранными авторами с использованием RAPD-метода у сахарной свёклы была проведена идентификация генов, связанных с мужской стерильностью. Установлено, что RAPD-маркер АВ-8-18-600г сцеплен с геном, контролирующим генную мужскую стерильность. Этот маркер показал только три и одну рекомбинации в популяциях F2 с 231 и 261 растениями соответственно [6].
С использованием 14 полиморфных SSR-маркеров были осуществлены профилирование генотипов сахарной свёклы для агрономических показателей качества сахара и кормовых достоинств и анализ генетического разнообразия. Это разнообразие на основе маркеров SSR будет способствовать расширению программы гибридизации сахарной свёклы с участием различных родительских пар [9].
При большом разнообразии образцов корнеплодной свёклы огромное значение имеет установление геномного состава разных видов, степени их родства и происхождения. На основе такого рода данных представляется возможным успешнее осуществлять отдалённые скрещивания с целью наиболее полного использования генетического потенциала разных форм растений [1]. Иностранными авторами сахарная свёкла в молекулярном плане изучена достаточно широко. Так, был создан ряд молекулярных маркерных генетических карт для сахарной свёклы [5, 10]. Каждая создана по сахарной свёкле, а другие типы культуры (дикая, столовая и кормовая свёкла, мангольд) ещё не представлены генетическими картами. Хотя их фундаментальная генетическая основа вряд ли сильно различается, частота встречаемости аллелей, вероятно, варьирует. Таким образом, всё более актуальной становится проблема изучения молекулярно-генетиче-ского полиморфизма сельскохозяйственных растений с использованием ДНК-маркеров [4].
Цель данной работы заключалась в выявлении RAPD-маркеров, характеризующих полиморфизм различных разновидностей корнеплодной свёклы (сахарной, столовой, кормовой) для использования в селекционной практике.
38 САХАР № 8 • 2018
Зато, что наша жизнь не блёкла,
МЫ ГОВОРИМ: СПАСИБО, СВЁКЛА!
121548, Москва, Кутузовский проспект, дом 7/4, корпус 1, офис 171 +7 И95) 974-62-51 ¡пРоЭАоптопН-йезргег.ги ими/,florimonH-despre7.com
Ф
FL0RIM0ND
DESPREZ
КОМПЛЕКСНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ САХАРНЫХ 3АНОДОВ
Материалы и методы исследований
В качестве материалов были использованы проростки следующих разновидностей корнеплодной свёклы: столовой свёклы (convar. esculentasalise) — со-ртотипов «Бордо» и «Хавская односемянная», «Цилиндра», кормовой (convar. crassa Alef.) — сортотипов «Эккендорфская жёлтая», «Полусахарная белая», образцы односемянной кормовой белой свёклы; сахарной (convar. saccharifera Alef.) — урожайно-сахаристый сортотип — РМС-46, РМС-70, предоставленные доктором сельскохозяйственных наук М.А. Богомоловым. Геномную ДНК выделяли из 0,2 г зелёных листьев растений свёклы с помощью гуанидин-тиоциа-нат-фенол-хлороформного метода с использованием СТАВ. Качество выделенной ДНК определяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученную ДНК растворяли в 10 мМ трис-НО-буфер, рН 8, содержащим 0,1 мМ ЭДТА и использовали для ПЦР-анализа. Параметры амплификации были следующие: предварительная денатурация при 95 оС в течение 10 мин, затем 30 циклов: 95 оС - 40 с, 62 оС - 40 с, 72 оС - 40 с и финальный этап элонгации цепи 72 оС — 5 мин. В качестве прай-меров использовали умеренно повторяющиеся последовательности нуклеотидов PawS 5, PawS 6, PawS 11, PawS 16, PawS 17 к семейству ретротранспозонов [8], гомологичные их консервативным участкам, синтезированные в ЗАО «Синтол» (г. Москва).
Результаты исследований и их обсуждение
Проведённый ПЦР-анализ геномной ДНК растений различных разновидностей корнеплодной свёклы Beta vulgaris L. с праймерами на кодирующие области генома показал высокий генетический полиморфизм исследуемых образцов. В результате амплификации геномной ДНК исследуемых растений прай-мером PawS 5 было установлено, что все растения сахарной свёклы № 4 — гибрид РМС-70, полусахарной белой — № 11 ПСБ-1, кормовой белой № 12 — имеют ПЦР-продукты сходной длины: 650 п. н. и 850 п. н. Сходство наблюдается и при амплификации образцов № 2 (кормовая 16), 9 (белая полусахарная),
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 М Рис. 1. Амплификация геномной ДНК свёклы праймером PawS 5
Обозначения: 1 - К-5; 2 - К - 16; 3 - К - 17; 4 - РМС - 70; 5 - РМС - 46; 6 - «Манон»; 7 - КБ - 35; 8 - КБ - 6; 9 - БПС - 4; 10 - F1ПСБ2; 11 - ПСБ1; 12 - F1КБ4; 13 - «Хавская односемянная»; 14 - «Бордо»; 15 - «Цилиндра»; 16 - «Эккендорфская жёлтая»; М-маркер молекулярных
1 (кормовая К-5), имеющих ампликоны длиной 700 п. н. Образец кормовой белой свёклы № 8 не имеет продуктов амплификации с данным праймером. Значительные сходства генетического материала обнаружены в образцах № 1 (кормовая К-5), 15 (столовая «Цилиндра») и 16 (кормовая «Эккендорфская жёлтая»), отличающиеся только на один ПЦР-продукт (рис. 1).
Результаты амплификации геномных ДНК растений свёклы с праймером PawS 6 указывают на то, что в составе генома всех исследованных организмов (за исключением образцов № 7, 8, 13, 14) обнаруживается общий ампликон длиной около 700 п. н. (рис. 2).
В растениях № 1—6 и 10 — это единственный ПЦР-продукт, что указывает на сходство их генетического материала. Кроме того, полное сходство состава ам-пликонов наблюдается и в образцах 13, 14, представляющих собой генотипы столовой свёклы. Длины выявленных ампликонов составляют 400 и 500 п. н. Наибольшее число сайтов амплификации обнаружено в образце столовой свёклы № 15 (сорт «Цилиндра»), которые обеспечивают образование продуктов длинами 250, 400, 500, 700 и 800 п. н. В результате амплификации геномной ДНК с праймером PawS 16 установлено, что в образцах № 2, 3, 8, 9 не обнаруживается продуктов амплификации с данными праймерами (рис. 3).
Сходство в результатах амплификации наблюдается у следующих образцов: № 4 и 10 — ампликоны
10 II 13 14 15 16 м
Рис. 2. Амплификация геномной ДНК свёклы праймером PawS 6
Обозначения: 1 - К-5; 2 - К- 16; 3 - К - 17; 4 - РМС - 70; 5 - РМС - 46; 6 - «Манон»; 7 - КБ - 35; 8 - КБ - 6; 9 - БПС - 4; 10 - F1ПСБ2; 11 - ПСБ1; 12 - F1КБ4; 13 - «Хавская односемянная»; 14 - «Бордо»; 15 - «Цилиндра»; 16 - «Эккендорфская жёлтая»; М - маркер молекулярных масс
12 13 Н IÍ 111 М
Рис. 3. Амплификация геномной ДНК свёклы праймером PawS 16
Обозначения: 1 - К-5; 2 - К- 16; 3 - К - 17; 4 - РМС - 70; 5 - РМС - 46; 6 - «Манон»; 7 - КБ - 35; 8 - КБ - 6; 9 - БПС - 4; 10 - F1ПСБ2; 11 - ПСБ1; 12 - F1КБ4; 13 - «Хавская односемянная»; 14 - «Бордо»; 15 - «Цилиндра»; 16 - «Эккендорфская жёлтая»; М - маркер молекулярных масс
масс
№ 8 • 2018 САХАР 39
т
FLDRIM0N0 ЗА ТО, ЧТО НАША ЖИЗНЬ НЕ БЛЁКЛА,
DESPREZ МЫ ГОВОРИМ: СПАСИБО, СВЁКЛА!
121548, Москва, Кутузовский проспект, дом 7/4, корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 tnfotDflorimond-des pre7.ru ww w, fl orí mond-desprez, com
650 п. н., № 5 и 12 - ампликоны 400 п. н., № 13, 14 и 16 — ампликоны 400, 650 и 1 200 п. н. Амплификация геномной ДНК растений свёклы с праймером PawS 17 показала, что данный праймер обнаруживает наименьшее число мест отжига на ДНК-матрице из всех вышеперечисленных праймеров. Показано, что общими для всех растений № 1, 12 и 14 являются ампликоны длинами 500, 800, 900 и 2 000 п. н., при этом доминирующим является продукт в 500 п. н. Необходимо отметить, что растения образца № 16 имеют только один ПЦР-продукт длиной 1000 п. н. В образцах № 2—11 и 13 продуктов амплификации с праймером PAWS 17 не обнаружено. Проведённый ПЦР-анализ геномной ДНК со специфическими праймерами к сателлитной ДНК B. vulgaris показал наличие одной полосы на гель-электрофорезе с длиной 280 п. н., характерной для культурной свёклы, что соответствует теоретическим значениям, рассчитанным с помощью специализированной программы на основе сиквенса сателлитной ДНК.
Заключение
Таким образом, анализ электрофореграмм свидетельствует, что в геноме изученных образцов свёклы наблюдается наличие сателлитной ДНК сахарной свёклы. Полученные данные свидетельствуют о том, что в составе генетического аппарата представленных растений сахарной, кормовой полусахарной и столовой свёклы присутствуют элементы ДНК культурной свёклы. Результаты проведённых исследований используются для молекулярной идентификации материала генетической коллекции свёклы корнеплодной рода Beta, а также для установления филогенетических связей. Для растений сахарной свёклы (образцы № 4—6) выявлен единый ПЦР-продукт длиной 700 п. н. при амплификации праймером PawS 6, что может являться одним из тест-признаков при видовой идентификации. Для полусахарной свёклы (образцы № 9—11) возможным тест-признаком при амплификации праймером PawS 5 является ампликон длиной 850 п. н. Для столовой свёклы однородный состав ПЦР-продуктов выявлен при использовании в качестве праймера PawS 16: 400, 650 и 1200 п. н., что может быть использовано при осуществлении паспортизации генотипов столовой свёклы. Использование RAPD-метода при тестировании растительного материала свёклы на генетическую стабильность и однородность позволяет проводить отбор генотипов уже на ранних стадиях развития растений, тем самым значительно снижая объём работ по созданию выравненного линейного материала для гетерозисной селекции сахарной свёклы. Дальнейшая работа по совершенствованию метода анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей генома позволит создать универсальную и общедоступную технологию, пригодную для идентификации сортов и
гибридов свёклы для использования в селекционном процессе и защиты авторских прав селекционеров.
Список литературы
1. Буренин, В.И. Генетические ресурсы рода Beta L. (Свёкла). - СПб., 2005. -274 с.
2. Корниенко, А.В. Генетика и селекция сахарной свёклы Beta vulgaris L. (прошлое, настоящее, будущее) / А.В. Корниенко, А.К. Буторина. — Воронеж : Воронежский ЦНТИ, 2012. — 391 с.
3. Корниенко, А.В. Молекулярная селекция сахарной свёклы / А.В. Корниенко, А.К. Буторина // Сахарная свёкла. — 2014. — № 1. — С. 12—15.
4. Сулимова, Т.Е. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции / Г.Е. Сулимова, И.Г. Удина, В.В. Зинченко. — М. : Макс-пресс, 2006. — 76 с.
5. Hansen, M. Error Rates and Polymorphism Frequencies for Three RAPD Protocols / M. Hansen, C. Hall-den, T. Sall // Plant Molecular Biology Reporter. — 1998. № 16. — P. 139—146.
6. Khodaei, L. Identification of RAPD Markers Linked to the Male Sterility Gene in Sugar Beet (Beta vulgaris L.) / L. Khodaei [and oth.] — JWSS. — 2007. — 11 (1). — Р. 381—391.
7. Laurent,V. Comparative effectiveness of sugar beet microsatellite markers isolated from genomic libraries and GenBank ESTs to map the sugar beet genome / V. Laurent [and oth.] // Theoretical and Applied Genetics. — 115(6). — November 2007. — Р. 793—805.
8. Rogovsky, M. Polymerase chain reaction based mapping of rye involving repeated DNA seguences / M. Rogovsky, K.W. Sherpherd, P. Langridge // Genome. — 1992. — V. 35. — № 4. — P. 621—626.
9. Sandhu, K. Profiling of sugar beet genotypes for agronomical, sugar quality and forage traits and their genetic diversity analysis using SSR markers / K. Sandhu [and oth.] // Electronic Journal of Plant Breeding. — 2015. — Vol. 2. — № 2. — P. 253—266.
10. Schondelmaier, J. Genetic and chromosomal location of the 5Sr DNA locus in sugar beet (Beta vulgaris L.) / J. Schondelmaier, T. Schmidt, C. Jung // Genome. — 1997. — V. 40. — № 2. — P. 171—175.
Аннотация. В статье рассматриваются вопросы использования RAPD-маркеров в молекулярной селекции сахарной свёклы. Применение RAPD-праймеров позволило провести идентификацию сортообразцов и отбор для скрещиваний из генетической коллекции свёклы корнеплодной рода Beta, установить филогенетические связи.
Ключевые слова: сахарная свёкла, кормовая свёкла, столовая свёкла, RAPD-праймеры, ПЦР-амплификация, идентификация Summary. The article deals with the use of RAPD-markers in molecular selection of sugar beet. The use of RAPD-primers allowed to identify the variety samples and selection for crossing from the genetic collection of beet of the Beta genus, to establish phylogenetic relationships.
Keywords: sugar beet, fodder beet, table beet, RAPD primers, PCR amplification, identification.
40 САХАР № 8 • 2018
Зато, что наша жизнь не блёкла,
МЫ ГОВОРИМ: СПАСИБО, СВЁКЛА!
121548, Москва, Кутузовский проспект, дом 7/4, корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡пРоЭАоптопН-йезргег.ги ими/,florimonH-despre7.com
m
FL0RIM0ND
DESPREZ
