CC BY
6УДК 575.22:577.21:633.413
А.М. Свирщевская, Л.В. Милько, А.В. Кильчевский
АНАЛИЗ RAPD СПЕКТРОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (BETA VULGARIS L.) И ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТЕЙ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЕЕ ФОРМ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Идентификация и паспортизация сортов, линий, гибридов - важные элементы селекционной работы с сельскохозяйственными культурами. Для создания генетических паспортов необходимы наследуемые генетические маркеры. Система молекулярных маркеров, применяемая для этой цели, должна представлять различные области генома, иметь высокий уровень межсортового полиморфизма, воспроизводимости и технологичности. RAPD (randomly amplified polymorphic DNA, или полиморфизм длины амплифицированных фрагментов ДНК c использованием случайных праймеров) маркеры относят к ранним поколениям геномных ДНК маркеров, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суть метода заключается в амплификации фрагментов ДНК, наработанных с помощью набора олигонуклеотидных случайных праймерных последовательностей и без рестрикции и последующем анализе полученных при электрофоретическом разделении в агарозном геле спектров полос-ампликонов [1]. Эта технология используется для выявления генетического разнообразия в популяциях, построения генетических карт, определения генетического родства, идентификации клонов, линий, сортов и гибридов сельскохозяйственных растений [2, 3]. У сахарной
свеклы (Beta vulgaris L.) RAPD маркеры вместе с RFLP маркерами были успешно применены для построения первых генетических карт хромосом [4, 5], для подтверждения сцепления морфологических маркеров окраски гипокоти-ля (гены R и Y) и сроков зацветания (ген B -однолетность / двухлетность) на хромосоме 2 и картирования генов устойчивости к нематоде [6, 7]. Помимо этого, были идентифицированы RAPD маркеры, ассоциированные с геном восстановителем фертильности для нового типа цитоплазматической мужской стерильности у дикой свеклы Beta maritima [8]. Известна только одна публикация, посвященная использованию данной технологии с целью определения генетического сходства между сортами сахарной свеклы европейской селекции и их дифференциации на основе данных RAPD анализа [9].
В данной экспериментальной работе была поставлена задача исследовать генетический материал сахарной свеклы различного происхождения и уровня плоидности с помощью RAPD маркеров, проанализировать вариабельность полученных геномных спектров и оценить возможности использования метода для идентификации форм этой пере-крестноопыляемой сельскохозяйственной культуры.
Материалы и методы исследования
Материал на первом этапе опытов включал Бел 69 - I -7 (4); Бел 69- I; Бел 69- I 3000у; Бел
20 образцов сахарной свеклы различного про- 69- 3 К; Бел 69- 3 (5); Бел 69- 3 (7); Бел 69- 3
исхождения и уровня плоидности. Среди них (12); Бел 69- 3 (14); Бел 69- 3 (15);
12 линий гиногенетического происхождения: 4 селекционных линий: 8138 (4х); 81678
Бц 40 СУГ 35РК 3000у; Янаш-2; Янаш-2(2); (4х) белорусской, «Однолетняя» украинской
и МС 193 немецкой селекции;
2 сорто-популяции белорусской селекции: Белорусская односемянная 69 (2х) и Ганусов-ская односемянная 55(2х) и 2 гибрида совместной немецко-белорусской селекции Белдан (3х) и Кавебел (3х).
ДНК линий были представлены смесью образцов ДНК листьев от 10 растений, сортов и гибридов - от 20 растений, а при оценке вну-трисортовой и внутрилинейной изменчивости - 20 образцами ДНК листьев от 20 индивидуальных растений.
Значительную часть изученного материала составляли линии сахарной свеклы гиногене-тического происхождения, созданные в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси [10]. Они были получены с использованием донорных растений диплоидных сортов Белорусская односемянная 69, Белоцерковская односемянная 40, Янаш А3. Исследованные гиногенетические линии формировались в культуре in vitro как регенеранты из неопло-дотворенных семяпочек диплоидных свекольных растений конкретного сорта. Вегетативные побеги таких линий сахарной свеклы культивировали на питательных средах для микроклонального размножения [11]. В эксперименты были включены также тетрапло-идные селекционные линии 81678 и 8138, предоставленные сотрудниками Опытной научной станции по сахарной свекле (г. Не-свиж) и диплоидные линии «Однолетняя», предоставленная сотрудниками ВНИИ по сахарной свекле (г. Киев, Украина) и МС 193 (компания KWS, Einbeck, Германия).
На этапе работы с популяциями генетический материал включал только диплоидные формы: гиногенетические линии Янаш КУГ РК, Белоцерковская односемянная 40 СУГ, Ганусовская односемянная 55- 9(2), Верх-нячская 103 ДГ и диплоидный сорт-стандарт сахарной свеклы для Беларуси Белорусская односемянная 69.
ДНК выделяли из листьев побегов, культивируемых in vitro и/или из тепличных растений первого года вегетации. Выделение ДНК (смесь образцов в одной пробе) проводили с использованием протеиназы К, а экстракцию ДНК для экспериментов с популяциями растений - SDS-методом, следуя протоколу [12] .
Метод RAPD включает два основных этапа. Первый этап представляет собой полимераз-ную цепную реакцию ДНК с использованием одного случайного короткого (обычно дека-мерного) праймера с преобладающим GC составом (60-80%) и низкими температурами отжига. Второй этап - фракционирование фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле для выявления полиморфизма продуктов амплификации. Как правило, использование одного случайного RAPD праймера приводит к появлению спектра из 3-10 полос-ампликонов, которые представляют разные локусы генома [2].
Для амплификации применяли прибор «MJ Mini Personal Thermal Cycler BIO-RAD». Реакционная смесь для проведения ПЦР объемом 20 мкл содержала деионизированную воду, реакционный буфер без М§02 (Dialat Ltd), 3 мМ М§С12, 0,2 мМ дНТФ, 40 нг ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы.
Амплификацию с праймерами проводили в следующем режиме: первый цикл с денатурацией при 94°С в течение 2 мин 12 сек, отжигом при 39°С в течение 2 мин, элонгацией при 72°С в течение 2 мин, затем 35 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 40 сек, отжиг при 47°С в течение 1 мин 40 сек и элонгацию при 72°С в течение 1 мин 30 сек. Последняя элонгация - 7 мин при 72°С. Анализ продуктов амплификации проводили в 2%-ном агарозном геле с 1 х ТАЕ буфером после электрофоретиче-ского разделения в течение 3,5 часов при напряжении 80 В. Для определения длины фрагментов использовали маркер М - 100 bp +1,5 Kb DNA Ladder (Fermentas).
Для выяснения степени воспроизводимости результатов амплификацию с каждым из прай-меров и разделение продуктов амплификации в агарозном геле проводили 2-3 раза. Полосы в полученных RAPD спектрах подсчитывались в каждом из гелей (один гель - результат одного эксперимента). Данные для каждого генотипа записывали в виде бинарных матриц, в которых значения «1» и «0» соответствовали наличию или отсутствию фрагментов с одинаковой молекулярной массой в спектре. Для построения дендрограмм использовали компьютерную программу TREECON [13] c расчетом значений бутстрепа [14] .
Результаты и обсуждение
Обычно в геноме имеется несколько участков, гомологичных последовательности RAPD праймера в обеих цепях ДНК, поэтому один и тот же олигонуклеотид, взаимодействуя с противоположными цепями ДНК, может служить в качестве как прямого, так и обратного праймера. При расстоянии между участками «правильной посадки» праймера от 200 п.н. и, как правило, не более 2000 п.н. будет происходить амплификация фрагментов с разных участков генома. Различия в продуктах амплификации у разных генотипов могут наблюдаться в результате мутаций в сайтах связывания с праймером или в результате перестроек хромосом [1]. Среди работ по применению данной технологии у свеклы наиболее близким по поставленной нами задаче дифференциации ее генотипов было исследование авторов из Великобритании о возможности идентификации сортов сахарной свеклы с помощью RAPD профилей [9]. В нем 17 растений 7 сортов (по 2-3 отдельных растения от каждого сорта) были проанализированы с применением 10 случайных праймеров, а затем для 15 растений от 2 сортов сахарной свеклы была оценена внутри- и межсортовая изменчивость по 5 лучшим праймерам, выявившим наибольшее количество полиморфных RAPD ло-кусов. Последовательности случайных RAPD праймеров, использованных для этой культуры в ней указаны не были, поэтому в наших экспериментах применяли серию из 10 праймеров Р, приведенную в работе с подсолнечником [15], которые обозначили как Ра, РЬ, Рс, Рd, Ре, Р£, Р§, Р^ Рi и Р] характеристика которых приведена в таблице 1.
Характеристика RAPD спектров сахарной свеклы (в пробе - смесь образцов ДНК отдельных растений)
На первом этапе экспериментов стояла задача выявить праймеры, с помощью которых обнаруживаются полиморфные локусы RAPD спектров у разнородного генетического материала сахарной свеклы (линий и гибридов различного происхождения и уровня плоидно-сти). Как и в работе британских авторов [9], нами были использованы 10 случайных прайме-ров, которые были оценены по их способности выявлять полиморфизм в локусах полученных спектров и по способности воспроизводить эти
спектры. На этой основе пять - шесть лучших из них были отобраны для дальнейшей работы с сахарной свеклой с целью идентификации ее форм. Полиморфные локусы были выявлены при анализе 20 генотипов сахарной свеклы с использованием 6 (Ра, Рс, Ре, Р£, Рh и Р] из 10 произвольных праймеров (таблица 1), при этом проба генотипа была представлена смесью ДНК 10 индивидуальных растений в случае линии, 15 - в случае гибрида и 20 растений в случае сорта. Продукты ПЦР представляли фрагменты ДНК размером от 350 п.н. до 2700 п.н. Количество учитываемых ампликонов в геномных RAPD спектрах варьировало в зависимости от праймера от 3 до 15, число полиморфных локусов - от 1 до 9. Всего в данной выборке из 20 генотипов при указанном типе пробы и использовании 10 праймеров было проанализировано 79 RAPD локусов, доля полиморфных из них составила 36,7%. Спектры фрагментов с RAPD праймерами РЬ, Рd, Pg, Рi были одинаковыми для всех генотипов и для целей идентификации не могли быть использованы.
В качестве примеров разделения продуктов амплификации в агарозном геле на рисунках 1 и 2 приведены электрофореграммы с полосами-ампликонами у 20 различных генотипов сахарной свеклы, полученными методом RAPD с двумя случайными праймерами. Анализ фореграммы 1 (праймер Р^ 11 генотипов из 20) показывает, что триплоидный гибрид Кавебел (образец 2), линий 8138 (4х) (образец 3) и 81678 (4х) (образец 4), которые были использованы в качестве компонентов для его создания, и линия Янаш-2 (образец 8) имеют ампликон одного размера - 1300 п.н. Известно, что во всех этих образцах присутствует генетический материал польского сорта Янаш А3. Линия «Однолетняя» украинской селекции характеризуется уникальным ам-пликоном размером 850 п.н. (образец 5), отличающим ее от всех других образцов. Размеры фрагментов амплификации определены с помощью программы Quantity One. Подсчет полос проводился в интервале 700-1500 п.н., обозначенном на рисунках скобкой. RAPD спектры диплоидных сортов Белорусской односемянной 69 и Ганусовской односемянной 55 - стандартов сахарной свеклы для Белару-
си (образцы 10 и 11) выглядят идентичными при амплификации с данным праймером РЬ На фореграмме 2 (праймер Р] 9 оставшихся из 20 генотипов под номерами 2-10,) образцы 5 и 8 - Белорусская односемянная 69-3 и гино-генетическая линия на ее основе Белорусская односемянная 69-3(12) соответственно имеют
В рассматриваемую выборку образцов сахарной свеклы входили как группа близкородственных генотипов (сорт Белорусская односемянная 69 и производные от нее линии), так и смесь форм сахарной
не две, как остальные близкородственные генотипы, а только одну полосу размером 1200 п.н. Спектр продуктов амплификации с праймером Р] линии Бел 69 3(15) (образец 10) по сравнению с другими линиями на основе Белорусской односемянной 69 характеризуется отсутствием полосы размером 950 п.н.
свеклы разного уровня плоидности (2х, 3х, 4х) и происхождения. Всего в этом генетическом пуле было детектировано 79 ЯЛРБ локусов, 29 из которых были полиморфными (табл. 1).
Таблица1
Характеристика серии из 10 ЯАРБ праймеров Ра-Р] использованных для выявления молекулярно-генетического полиморфизма между линиями, сортами и гибридами сахарной свеклы, и детектируемых с их помощью ЯАРБ локусов
Праймер GC состав, % Размер ПЦР фрагментов, п. н. Количество
Анализируемых генотипов Детектируемых RAPD локусов Полиморфных RAPD локусов
Ра 60 450-2500 20 9 7
РЬ 60 700-1300 20 6 0
Рс 46 500-1400 20 4 1
Ра 70 1000-1300 20 6 0
Ре 60 350-2000 20 15 4
И 90 650-2700 20 12 5
Ре 70 800-1300 20 7 0
РИ 80 700-1500 20 10 9
Р1 60 850-1500 20 3 0
Р] 50 700-1300 20 7 3
Всего локусов 79 29
Доля полиморфных локусов от общего числа детектируемых во всех ИЛРБ спектрах инициированных с использованием 10 праймеров Ра-Р] в общей выборке из 20 генотипов (проба в виде смеси индивидуальных образцов ДНК) составила 36,7 %.
Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК различных форм сахарной свеклы с
праймером РИ ( представлены 11 генотипов из 20) М- маркер 100 Ър+1.5КЪ; 1- Белдан (3х), 2- Кавебел (3х), 3- 8138 (4х), 4-81678 (4х), 5- Однолетняя, 6- МС 193, 7- Бц 40 СУГ (35)РК 300ву, 8- Янаш-2, 9- Янаш-2(2), 10- Бел 69 (2х), 11- Ган 55 (2х).
Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК гиногенетических линий сорта сахарной свеклы Белорусская односемянная 69 (2х) с праймером Р] (под номерами 2-10 представлены
остальные 9 генотипов из 20). М- маркер 100 Ър+1,5КЪ; 1- Бел 69 (2х), 2- Бел 69 - I -7 (4), 3- Бел 69- I, 4- Бел 69- I 300ву 5- Бел 69- 3 К, 6- Бел 69- 3 (5), 7- Бел 69- 3 (7), 8- Бел 69- 3 (12), 9- Бел 69- 3 (14), 10- Бел 69- 3 (15) , 11- 81678 (4х).
Данные спектров фрагментов ДНК 20 генотипов сахарной свеклы, полученных с использованием серии из 10 праймеров, легли в основу расчета показателя полиморфизма ЯДРО локусов, выявления среди них 5 наиболее информативных (праймер Рс был исключен из группы как наименее технологичный) и построения дендрограмм, группирующих с определенной степенью вероятности близ-
кие по генетическим расстояниям генотипы в кластеры.
При сравнении спектров ЯЛРБ локусов в выборке только близкородственных генотипов, например, образцов сорто-популяции Белорусской односемянной 69 и девяти производных от нее линий (гиногенетических и селекционных), полученных с использованием праймеров Ра, Ре, Р£ РИ и Р] полиморфизм локусов составил
33.9 % (из 53 детектируемых RAPD локусов 18 были полиморфными) [16]. Таким образом, наиболее информативные случайные праймеры из набора изученных были выявлены, уровень полиморфизма RAPD локусов в различных по составу выборках генотипов с образцами ДНК в виде смеси рассчитан и оценен как достаточно высокий и представляющий основу для дифференциации. Если на электрофореграммах обнаруживали специфичные ампликоны для группы образцов, как, например, в случае с гибридом Кавебел и линиями 8138 и 81678, входивших в состав его компонента-опылителя, то при кластеризации эти генотипы могли быть объединены в единый узел.
После завершения методического этапа сосредоточились на работе с линейным материалом сахарной свеклы и обработке полученных данных RAPD фингерпринтинга. Для построения ден-дрограмм, отражающих генетическое сходство, были составлены бинарные матрицы, характеризующие присутствие или отсутствие ампликонов в RAPD локусах генотипов свеклы различного происхождения. Важными показателями, характеризующими вероятность объединения генотипов в кластер, являлись значения бутстрепа, поскольку при статистически достоверной кластеризации они должны быть более 50%.
На рисунке 3 отражена картина кластеризации на основе оценки RAPD локусов 11 фер-тильных линий различного происхождения и плоидности, входивших в выборку генотипов на первом этапе экспериментов (в пробе - смесь образцов ДНК растений). Интерпретация расстояний показывает, что линия «Однолетняя» украинской селекции является наиболее генетически дистанцированной от остальной группы линий белорусской селекции на основе сорта Белорусской односемянной 69 и линий 8138 и 81678. Эти две тетра-плоидные линии, созданные на основе сорта Янаш, и две гаплоидные линии Бел 69-3(12) и Бел 69-3(14) гиногенетического происхождения достоверно (бутстрепы более 50%) кластеризуются. При построении дендрограмм с использованием других типов маркеров, например, микросателлитов, и на более репрезентативных выборках, включающих линейный и гибридный материал сахарной свеклы разного уровня плоидности, полученный из генетически отдаленных источников, нами
также было отмечено формирование с высокой вероятностью кластеров из генотипов одинакового уровня плоидности, отличного от исходного диплоидного; кроме этого, при микросателлитном анализе было показано, что генотипы, прошедшие стадию семенной репродукции, не «смешивались» с образцами, которые ее не прошли [17]. При RAPD анализе эта тенденция кластеризации генотипов по уровню плоидности (х, 4х) подтверждается, а по способу репродукции отмечена, но не всегда является очевидной. На рисунке 3 выделяется кластер из трех генотипов на основе компонента Бел 69-I, отселектированного на Опытной научной станции по сахарной свекле (г. Несвиж) из сорто-популяции Белорусская односемянная 69 по группе признаков продуктивности, и прежде всего, сахаристости. Следует отметить, что не все линии на основе сорта Белорусская односемянная 69 попали в один кластер. В целом же для данной группы линий сахарной свеклы шкала генетических дистанций мала, поскольку кроме «Однолетней» линии и двух гаплоидных линий (х), все остальные генотипы «укладываются» в минимальное расстояние «0.1», а значения бутстрепа более 50% встречаются лишь в половине кластеров. Возможным объяснением невысоких значений бутстрепа могут служить уникальные, редкие аллели RAPD локусов, которые могут снижать вероятность кластеризации близких в генетическом отношении генотипов.
Для того, чтобы идентифицировать сорта, необходимо выполнение нескольких условий: выявляемой изменчивости между сортами, минимальной внутрисортовой изменчивости, экспериментальной воспроизводимости полученных данных. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) - перекрестно-опыляемая культура, и несмотря на то, что большинство современных сортов представляют собой F1 гибриды, получаемые на основе ЦМС, свекольные сорта далеки от генетической выровненности/ однородности. Одновременно с межсортовой изменчивостью наблюдается значительная внутрисортовая изменчивость, выявленная с помощью анализа различных изоферментных систем, и которая представляет сложности для идентификации свекольных форм [18]. Ранее нами была проанализирована внутрипопу-ляционная изменчивость сорта Белорусская
односемянная 69 - стандарте для диплоидных форм сахарной свеклы в РБ, с использованием отобранных 5 праймеров. Генотип сорта мог быть представлен в анализе как в виде одного образца из смеси листьев 20 растений, так и в виде популяции из 20 образцов ДНК индивидуальных растений. Средний уровень полиморфизма RAPD локусов в спектрах сорта в первом случае составил 36,3 %, а во втором - 44,6 %. Эти данные продемонстрировали, что популяционный анализ в ряде случаев позволяет детектировать большее количество полиморфных локусов [16].
Поскольку внутрипопуляционная изменчивость сорта-стандарта Белорусская односемянная 69, выявленная с использованием отобранных в ходе экспериментов RAPD праймеров,
оказалась высокой, в дальнейшем для изучения был взят предполагаемо более выровненный в генетическом плане материал сахарной свеклы - линейный. Но даже в группе из 9 близкородственных линий гиногенетического происхождения и их донорного сорта Белорусская односемянная 69 средний уровень полиморфизма RAPD локусов составил 33,9% и были обнаружены уникальные ампликоны для отдельных линейных генотипов. Эти результаты дали основание для использования RAPD метода с целью генотипирования гиногенетических линий сахарной свеклы, но представлялось очевидным, что пяти лучших праймеров серии Р, выявивших полиморфные RAPD локусы у линий сахарной свеклы было недостаточно для того, чтобы маркировать все линии свеклы данной выборки [16].
Рис. 3. Дендрограмма, отражающая генетическое сходство между 11 линиями сахарной свеклы различного происхождения и уровня плоидности. Построена на основе анализа 53 RAPD локусов
П.Характеристика ЯАРБ спектров сахарной свеклы (популяционный анализ)
После изучения геномных ЯЛРБ спектров на материале близкородственных линейных генотипов сахарной свеклы для целей идентификации перешли к анализу внутри-популяционной изменчивости у диплоидных гиногенетических линий, индуцированных в культуре семяпочек растений от сортов польской, украинской, белорусской селекции и представляющих различные селекционные направления (урожайное-Верхнячская 103, сахаристое-Янаш А 3 и смешанного типа). Оценка внутрипопуляци-онной изменчивости является необходимым этапом при идентификации и паспортизации растений с помощью ДНК маркеров. Изучали популяции линий Ганусовской 55-9(2), Белоцерковская 40 СУГ, Верхнячская 103 ДГ, Янаш СУГ РК. Каждая линия была представлена популяцией из 15 образцов ДНК индивидуальных растений. Контрольной популяцией являлась сорто-популяция Белорусской односемянной 69, состоящая из 20 растений. Спектры, полученные при амплификации с праймерами Ра, РЪ, Рс, Р§ и Р1, были либо мономорфными, либо слабо воспроизводимыми, остальные 5 праймеров (таблица 2) давали спектры с полиморфными ЯЛРБ локусами, свидетельствующие о гетерогенности исследуемых растений линий сахарной свеклы по отдельно взятым амплифицированным фрагментам ДНК. Применение праймеров Рё, Ре, РГ РИ и Р] давало в спектре от 3 до 13 ампликонов, длина фрагмента ДНК зависела от праймера и колебалась, в основном, в интервале 3501500 п.н. На рисунке 4 и 5 представлены примеры амплификации ДНК исследуемых линий Янаш КУГ РК и Верхнячская 103 ДГ с праймером РИ. Максимальное количество ампликонов получили при амплификации с праймером Ре. Процент полиморфизма амплифицированных фрагментов генома определяли как отношение количества полиморфных фрагментов к общему количеству полученных фрагментов. Было установлено широкое варьирование количества полиморфных ЯЛРБ локусов у исследуемых
линий сахарной свеклы в зависимости от используемых праймеров - от 30% до 80%. В среднем уровень полиморфизма RAPD локусов для изученной выборки из 5 популяций (4 гиногенетических линии и 1 сорт, всего 80 растений) составил 54,5 % (табл. 2).
Полученные с праймерами Pe, Pf, Ph, Pj профили подтвердили предположение о том, что в ряде случаев возможно выявление более высокого уровня полиморфизма RAPD локусов при исследовании популяций растений образца, чем при анализе спектров, полученных с использованием проб, состоящих из смесей ДНК растений этого же образца свеклы. Причиной этого могут быть количественные различия в пробе при использовании смеси листового материала, приводящие к не 100%-ному связыванию праймера с соответствующими сайтами ДНК, а последующие циклы амплификации увеличивают эти различия, выражающиеся в отсутствии ряда ампликонов. В целом же, изменение RAPD-спектра, т. е. исчезновение или появление новой полосы ДНК, отражает различные изменения генома, например, мутацию в участках, узнаваемых праймером, или делецию/инсерцию в промежутке между такими участками [19]. RAPD-спектры могут также видоизменяться вследствие конкуренции за участки присоединения праймеров, на которую влияют перестройки и амплификация некоторых участков генома [20]. В любом из случаев высокий уровень полиморфизма ДНК свидетельствует о значительной изменчивости исследуемых растений сахарной свеклы внутри линейной популяции, полученной в культуре in vitro и прошедшей семенной цикл репродукции.
На основе данных RAPD анализа изученные линии и сорт были кластеризованы с помощью программы TREECON. Дендрограмма генетического сходства исследуемых генотипов сахарной свеклы приводится на рисунке 6. Построенная методом UPGMA, она состоит из четырех основных кластеров: группа I (Янаш КУГ РК, Белоцерковская 40 СУГ), группа II (Ганусовская 55), группа III (Верхнячская 103 ДГ) и группа IV (Белорусская 69).
Таблица 2
Результаты RAPD анализа по выявлению внутрипопуляционной изменчивости у четырех гиногенетических линий сахарной свеклы и контрольной сорто-популяции
Белорусской односемянной 69
Размер ПЦР фрагментов п. н. Количество
Праймер GC состав, % Анализируемых генотипов Детектируемых RAPD локусов Полиморфных RAPD локусов
Ра 70 550-1500 80 8 6
Ре 60 350-1500 80 13 5
и 90 470-1500 80 10 3
РИ 80 530-1350 80 10 8
Р| 50 380-1300 80 3 2
Всего локусов 44 24
Доля полиморфных локусов от общего числа детектируемых во всех RAPD спектрах инициированных с использованием 5 отобранных праймеров в общей выборке из 80 генотипов (проба - ДНК одного растения), составила 54,5 %.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Рис. 4. RAPD-спектры амплифицированной ДНК гиногенетической линии сахарной свеклы Янаш КУГРК, полученные при использовании в реакции произвольного праймера РИ. Обозначения: М - маркер 100 Ър+1,5КЪ; 1-10 индивидуальные образцы гиногенетической линии Янаш КУГРК
Рис. 5. RAPD-спектры амплифицированной ДНК гиногенетической линии сахарной свеклы Верхнячская
103 ДГ, полученные при использовании в реакции произвольного праймера РИ. Обозначения: М - маркер 100 Ър+1,5КЪ; 1-15 индивидуальные образцы гиногенетичесюй линии Верхнячская 103 ДГ
Рис. 6. Дендрограмма распределения 80 растений сахарной свеклы от 4 гиногенетических линий и 1 сорта, полученная методом ИРвЫЛ. Построена на основе анализа 44 ЯЛРБ локусов.
Из приведенной дендрограммы следует, что все 20 растений контрольной сорто-популяции Белорусская односемянная 69 сформировали один кластер. Линейные популяции, каждая из которых состояла из 15 растений, сгруппированы отдельно от сорта, но значения бутстрепов невысокие, большинство из них - менее 50, за редкими исключениями. На основании рассчитанных генетических дистанций дигаплоидная линия Верхнячская 103 ДГ идентифицируется как единая форма, так же, как и стандарт Белорусская односемянная 69. Все оставшиеся линии гиногене-тического происхождения - Ганусовская 55 9 (2), Белоцерковская 40 СУГ и Янаш КУГ РК, также сгруппированы в отдельные узлы, что указывает на возможность их идентификации на основании полученных данных. При этом эти три линии имеют небольшие количества растений (от одного до пяти), которые выходят за рамки основного кластера линии. Это 2 растения линейной популяции Янаш КУГ РК, 3 растения (2 и 1) Ганусовской 55 9 (2), 5 (2 и 3) растения Белоцерковской 40 СУГ. Эти указанные, выходящие за рамки своего основного кластера, растения распознавались программой для кластеризации как растения других линий. Это может объясняться значительной изменчивостью и сложной структурой популяции каждой линии сахарной свеклы, в ко -торой растения значительно отличаются по геномным профилям, а также недостаточно большим количеством использованных прай-меров для получения геномных RAPD про-
филей с высокой степенью полиморфизма.
Анализ молекулярной вариансы (AMOVA), важного статистического метода, разработанного относительно недавно для оценки иерархической структуры генетической изменчивости между популяциями и внутри популяций, а также аналога F-критерия с использованием разных типов молекулярных маркеров, в том числе RAPD маркеров и их бинарных матриц [21, 22], позволил установить, что при попарных сравнениях популяций 4 гиногенети-ческих линий между собой и между этими линиями и сорто-популяцией стандарта Белорусская односемянная 69 в 5 случаях из 11 возможных внутрипопуляционная изменчивость оказывалась большей (с диапазоном от 52 до 70%), чем межпопуляционная, что указывает на сложную структуру популяции и исследованных линий, и сорта перекрест-ноопыляемой сахарной свеклы. AMOVA по данным RAPD анализа из общей выборки популяций дифференцирует две формы - а) исходно гомозиготную и прошедшую 5-6 циклов семенной репродукции линию гино-генетического происхождения Бц 40 СУГ, при включении которой в попарное сравнение в 4 случаях из 5 возможных внутрипопуляци-онная изменчивость была выше межпопуля-ционной и б) сорто-популяцию Белорусская односемянная 69, при включении которой в попарное сравнение в 4 из 5 возможных вариантов межпопуляционная изменчивость была выше (с диапазоном от 54 до 67%) внутрипопуляционной.
Заключение
На разных по объему и составу выборках образцов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) были испытаны 10 случайных коротких оли-гонуклеотидных праймеров и из них отобраны 5 наиболее эффективных для получения полиморфных геномных RAPD профилей. При использовании проб в виде смеси образцов ДНК растений доля полиморфных локусов среди общего количества детектируемых варьировала между 33 и 44%. Показано, что различия регистрируются даже между геномами близкородственных линейных генотипов сахарной свеклы. При оценке генетического сходства/ различия между линиями сахарной свеклы
разного происхождения и уровня плоидности на основе результатов RAPD маркирования отмечена достоверная кластеризация генотипов по уровню плоидности, отличного от исходного диплоидного (гаплоидов, тетра-плоидов); этот вывод хорошо согласуется с данными проведенного нами ранее микроса-теллитного анализа [17].
Выявление уникальных фрагментов амплификации и высокий уровень полиморфизма локусов в полученных с помощью эффективных случайных праймеров RAPD спектрах линий сахарной свеклы подтверждает возможность использования этого метода для их
генотипирования. В то же время, при проведении более масштабных исследований и для получения более достоверных данных с целью идентификации всех форм свеклы данной выборки, количество праймеров следует увеличить. Метод технически простой и быстрый, но зачастую требует повторения как этапа амплификации, так и электрофоретического разделения фрагментов ДНК в агарозном геле для повышения точности эксперимента и интерпретации полученных данных.
В результате анализа ЯЛРБ спектров, полученных с использованием тех же прай-меров с другим типом пробы (в образце не смесь, а ДНК одного растения) в популяциях сахарной свеклы (4 гиногенетических линии и 1 сорто-популяция, всего 80 растений),
был выявлен 54,5% средний уровень полиморфизма ЯЛРБ локусов во всей выборке. При этом было установлено широкое варьирование количества полиморфных локусов у исследуемых генотипов в зависимости от используемых праймеров - от 30% до 80%. Данные анализа молекулярной вариансы АМОУЛ для 5 изученных популяций указывают на сложную структуру популяции исследованных линий и сорта сахарной свеклы. Внутрипопуляционная изменчивость линии может превышать межпопуляционную, что усложняет молекулярную идентификацию образца с помощью ЯЛРБ маркеров.
Работа была выполнена в рамках задания 3-30 Государственной Программы «Инновационные биотехнологии».
Список использованных источников
1. Arabidopsis thaliana - модельный объект генетики растений: Учебно-методическое пособие по генетике растений. Ежова Т.А. [и др.]; М.: МАКС-Пресс, 2003. - 220 с.
2. Waugh R. RAPD Analysis: Use for Genome Characterization, Tagging Traits and Mapping / R.Waugh. Plant Molecular Biology. A laboratory Manual. Ed. by M.S. Clark. Part II. Chapter 6. - Berlin: Springer Verlag, 1997. -P. 305-333.
3. Малышев, С.В. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений / С.В. Малышев, Н.А. Картель // Молекулярная биология.- 1997. - Т. 31. - № 2. - С. 197-208.
4. Uphoff , H. A genetic map of sugar beet (Beta vulgaris L.) based on RAPD markers / H.Uphoff , and G.Wricke /Plant Breed. - 1995. -Vol. 114. - P. 355-357.
5. Barzen, E. An extended map of sugar beet genome containing RFLP and RAPD loci / E. Barzen ,W. Mechelke, E. Ritter, E.Schulte -Kappert, and F.Salamini // Theor. Appl.Genet.
- 1995. - Vol. 90. - P. 189-193.
6. Uphoff , H. and G.Wricke. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in sugar beet (Beta vulgaris L.): Mapping the genes for nematode resistance and hypocotyls colour / H. Uphoff , and G.Wricke // Plant Breed. - 1992.
- Vol. 109. - P. 168-171.
7. Shen, Y. The taxonomic characterization of annual Beta germplasm in a genetic resources
collection using RAPD markers / Y. Shen, H.J. Newbury and B.V. Ford-Lloyd. // Euphytica.-1996. - Vol. 91. - P. 205-212.
8. Identification and mapping of RAPD and RFLP markers linked to a fertility restorer gene for a new source of cytoplasmic male sterility in Beta vulgaris ssp. Maritime/ Laporte, V. [и др.] // Theor. Appl. Genet. - 1998. - Vol. 96. - P. 989-996.
9. Ford-Lloyd, B.V. The Use of RAPD for the Identification of Sugar Beet Varieties / B.V. Ford-Lloyd, M. Munthali, and H.J. Newbury // Journal of Sugar Beet Research. October-December. - 1993. - Vol. 30, N 4. - P. 291-298.
10. Svirshchevskaya, A.M. Karyological characterization of sugar beet gynogenetic lines cultured in vitro / A. Svirshchevskaya, J. Dolezel // J. of Applied Genetics. - 2001. -Vol. 42, N 1. - P. 21-32.
11. Свирщевская, А.М. Культура тканей сахарной свеклы: генет. и физиол. аспекты / А.М. Свирщевская, В.Е. Бормотов. - Мн.: Наука и техника, 1994. - 140 c.
12. Plaschke, J. Detection of genetic diversity in closely related wheat using microsatellite markers / J. Plaschke, M. Ganal , M.S.Roеder // Theor. Appl. Genet. - 1995. - V. 91. - P. 1001-1007.
13. Van de Peer, Y Treecon for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for Microsoft Windows environment / Y Van de Peer, R. De Wachter // Comput. Appl. Biosci. - 1994. - V 10. - P. 569-570.
14. Felsenstein, J. Confidence limits on phylog-enies: An approach using the bootstrap / J. Felsenstein // Evolution. - 1985. - V. 38. - P. 783-791.
15. Сиволап, Ю.М. RAPD-анализ моле-кулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annuus L.) / Ю.М. Сиволап, А.Е. Солоденко, В.В. Бурлов. // Генетика. - 1998. - Т. 34, - № 2. - С. 266-271.
16. Милько, Л.В. Оценка полиморфизма ДНК гиногенетических линий и сорта Белорусская односемянная 69 сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) c помощью RAPD маркеров / Л.В. Милько, А.М. Свирщевская, А.В. Кильчевский // Молекулярная и прикладная генетика: сборник научных трудов. Том 10. Институт генетики и цитологии НАНБ; ред.колл.: А.В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск: Право и экономика, 2009. - С. 39-47.
17. Malyshev, Sergey. SSR markers assessment of genetic diversity in sugar beet lines / Sergey Malyshev, Anna Svirshchevskaya, and Nikolai Kartel. Modern Variety Breeding for Present and Future Needs. Eds. J.Projens & M.L. Badenes. Valencia, Spain: Editorial Universidad
Politécnica de Valencia, 2008. - P. 176-177.
18. Bailey, D.C. Isozyme variation and plant breeders rights / Isozymes in plant genetics and breeding. Tanskley, S.D. and Orton, T.J. (eds). Part A. Amsterdam: Elsevier, 1983. - Р. 425-441.
19. Williams, J.G.K. Genetic Analysis Using Random Amplified Polymorphic DNA Markers / J.G.K.Williams, M.K., Hanafey, J. A Rafal-ski, S.V. Tingey // Method Enzymol. - 1993. -V. 218. - P. 704-740.
20. Deverno L.L. Mitochondrial DNA Variation in Somatic Embryogenic Cultures of Larix / L.L.Deverno, P. J., Charest, L. Bonen // Theor. Appl.Genet. - 1994. - V. 88. - P. 727-732.
21. Excoffier L. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: Application to human mitochondrial DNA restriction sites / L. Excoffier L., P.E. Smouse, J.M. Quattro // Genetics. - 1992. -Vol. 131. - P. 479-491.
22. Huff, D R. RAPD variation within and among natural populations of outcrossing buf-falograss Buchloe dactyloides (Nutt) Engelm./ D R. Huff, R. Peakall, P.E. Smouse // Theor. and Appl. Genet. - 1993. - Vol. 104. - P. 388-398.
Дата поступления статьи 4 марта 2011 г.
