CC BY
7А.М. Свирщевская1, О.М. Малышева1, Л.В. Милы®1, О.Ч. Мазур1, С.А. Мелентьева2, И.С. Татур2, А.В. Кильчевский1
АНАЛИЗ ВАРИАНТОВ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ atpA И atp6 У ЛИНИЙ И ГИБРИДОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (BETA VULGARIS L.),
ВОЗДЕЛЫВАЕМЫХ В БЕЛАРУСИ
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2РУП «Опытная научная станция по сахарной свекле» Республика Беларусь, 222603, Минская обл., г. Несвиж, ул. Озерная, 1
Методы современной селекции и развитие гибридных сортов перекрестно-опыляемой сахарной свеклы включают отбор и получение инбредных закрепителей стерильности (О-типов) и их стерильных аналогов, а также тестирование на комбинационную способность отобранных односемянных линий с ци-топлазматической мужской стерильностью (ЦМС) и многосемянных фертильных опылителей [1]. Производство гибридных семян, таким образом, основано на использовании признака ЦМС т.н. Оуэновского типа, который наследуется по материнской линии и приводит к нарушению микроспорогенеза и образованию летальной (стерильной) пыльцы. Он является полигенным и проявляется при взаимодействии рецессивных аллелей нескольких ядерных генов, называемых закрепителями стерильности, а также цитоплазматических детерминант, расположенных в митохондриаль-ном (мт) геноме [2]. Из ядерных генов, отвечающих за проявление ЦМС у сахарной свеклы, к настоящему времени изучен на молекулярно-генетическом уровне только один, локализованный на III хромосоме и обозначенный как Rf1 [3]. Для мтДНК было показано, что при переходе к состоянию ЦМС она подвергается целому ряду структурных перестроек, набор которых стабилен и позволяет дискриминировать мужскостерильные и фертильные растения молекулярно-биологическими методами. Сравнительное изучение мт-генома растений с N- и S-типом цитоплазмы с использованием рестрикционного анализа, метода блот-гибридизации и секвенирования выявило для митохондрий S-цитоплазмы гены - cob (ген апоцитохрома b), cox2 (ген 2-ой субъединицы цитохромоксидазы c), nad1 (ген 1-ой субъе-
диницы НАДН-дегидрогеназного комплекса), atp6 и atpA (гены 6-ой и а субъединицы F1F0-АТФaзного комплекса митохондрий), где эти перестройки наблюдаются. Набор множественных преобразований митохондриального генома в районах этих генов выявлен у всех ЦМС-форм [4].
Задачей наших исследований являлся анализ вариантов митохондриальных генов-маркеров atp6 и atpA. Последовательность области гена atpА для нормального типа мтДНК (Ы-тип цитоплазмы) и ЦМС-типа мтДНК ^-тип цитоплазмы) приведена в базе данных EMBL под номерами Х68690 (2699 п.н.) и Х68691 (2847 п.н.) соответственно. Рекомбинационные перестройки у ЦМС-растений происходят в 5'-области, прилегающей к гену atpА. Используя эти данные, российскими исследователями была подобрана система из трех прайме-ров, которая применяется для амплификации специфичных фрагментов ДНК обоих типов мт-генома [5]. После проведения амплификации при совместном использовании трех праймеров в реакции должны образовываться либо два продукта реакции для гетероплазма-тичных растений, либо один амплификацион-ный продукт (специфичный для митохондрий нормальных или стерильных растений) в случае гомоплазматичных растений. Для гена atp6 стратегия проведения амплификации с тремя праймерами была сходной [2].
Определение вариантов мт генов в популяциях растений линий и гибридов сахарной свеклы, используемых в белорусской селекционной практике, было мотивировано нуждами селекционеров, работающих с этим материалом. Основываясь на данных молекулярного маркирования, они, уже на первом году
вегетации свекольного растения, т.е. еще до появления генеративного побега, получили бы возможность распознавать растения, несущие признак ЦМС и могли использовать их для отборов педигри материнских линий и в последущих скрещиваниях. Помимо этого, при проведении селекционерами оценочных опытов гибридного материала сахарной све-
клы, поступающего в Беларусь из-за рубежа от коммерческих фирм Германии, Дании, Нидерландов, Бельгии (40-50 гибридов ежегодно), установление типа цитоплазмы в популяциях растений гибридов позволяет опосредованно определить качество (выравненность) закупленного семенного материала и выявить возможные «генетические загрязнения».
Материалы и методы
Исследовали 43 популяции сахарной свеклы, представляющих селекционные линии - материнские компоненты скрещиваний с ЦМС (8), фертильные линии гиногенетического происхождения (15), пары родительских компонентов скрещиваний (4 материнские линии с ЦМС и 4 отцовских популяции опылителей) и 4 гибридные комбинации на их основе (всего 12), а также коммерческие гибриды зарубежной селекции: Ненси, Золеа, Берни, Триада, Ярыса, Агния, Модус, Эврика (8). Гиногенетические линии были созданы нами в лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии методом экспериментальной гаплоидии in vitro [6] и впоследствии репродуцированы в условиях Биологической опытной станции ИГиЦ и Опытной научной станции по сахарной свекле (г. Несвиж). Растительный материал для выделения ДНК был предоставлен селекционерами Опытной научной станции по сахарной
Результаты
Определение вариантов S- и N-цитоплазмы путем анализа митохондриальных генов atp6 и atpA в линейном и гибридном материале сахарной свеклы.
Коммерческие гибриды сахарной свеклы зарубежной селекции
Обобщенные результаты анализа митохон-дриальных генов в популяциях зарубежных коммерческих гибридов (табл. 1) показывают,
свекле. В общей сложности были исследованы варианты мт генов atp6 и а1рЛ у 1000 растений сахарной свеклы.
Для выделения ДНК использовали методику [7]. Определение размера ампликонов в агарозном геле для установления вариантов митохондриальных генов atpЛ и atp6, соответствующих N S и смешанным типам цитоплазмы проводили по методу [5]. Использовали системы из трех праймеров (общий, ^специфичный, S-специфичный) для двух указанных генов. Амплификация включала: 1-ый этап - 95 °С 4 мин, 2-ой этап -45 циклов (94 °С - 28 с, отжиг при 58,6 °С -28 с, 72 °С - 43 с), 3-ий этап - финальная элонгация 7 мин при 72 °С, 4-ый этап - 4 °С -да. Размер продукта для atp6 для №типа цитоплазмы был равен 266 п.н., для S-типа -389 п.н. Для гена atpЛ размер ампликона, соответствующего ^цитоплазме, был равен 634 п.н., цитоплазме S-типа - 727 п.н.
исследования
что спектры продуктов амплификации гена atp6 были в основном двухполосными а atpЛ - однополосными (рис. 1). Фертиль-ных растений (с ^вариантом цитоплазмы) в исследованных популяциях практически не было, что соответствует стандарту коммерческих гибридов. Количество растений в популяциях гибридов варьировало от 42 до 54.
Таблица 1
Результаты анализа вариантов митохондриальных генов аtp6 и аtpA в популяциях 8 коммерческих зарубежных гибридов cахарной свеклы
Гибрид atp6 atpA
S SN N NS S SN N NS
Ненси 2 45 4 3 54 0 0 0
Золеа 3 51 0 0 50 4 0 0
Берни 0 45 0 9 54 0 0 0
Продолжение табл. 1
Гибрид atp6 atpA
S SN N NS S SN N NS
Триада 0 54 0 0 54 0 0 0
Ярыса 0 54 0 0 54 0 0 0
Агния 6 46 0 0 52 0 0 0
Модус 0 42 0 0 42 0 0 0
Эврика 1 49 0 0 50 0 0 0
Агния
atp6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L 11 12 1314 1516 17 18
atpA
L 123456789 1011 12 13 14 1516 1718
Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения ампликонов мт генов atp6 (гетероплазмия типа SN, вверху) и atpA (гомоплазмия S, внизу) в популяции растений сахарной свеклы гибрида Агния (представлены растения
№ 1-18). Маркер L (Ladder 1000bp)
Линии
В коллекции из 30 диплоидных линий сахарной свеклы, используемых в белорусской селекционной практике, 15 были отобраны селекционерами Опытной научной станции по сахарной свекле НАН Беларуси из пула мужски стерильных и фертильных линий, а остальные 15 линий были получены путем гиногенеза in vitro из фертильных растений-доноров от сортов Белоцерковская односемянная 40, Белорусская односемянная 69, Ялтушковская, Ганусовская односемянная 55, Верхнячская 103, и Янаш A3 и которые прошли несколько циклов семенной репродукции на той же станции. Всего было проанализировано 300 индивидуальных растений линейного материала.
Скрининг 8 селекционных линий сахарной свеклы с цитоплазматической мужской стерильностью по гену а1р6 выявил гетеро-плазмию, т.е. наличие у одних и тех же растений митохондрий, свойственных как S-, так и №типам цитоплазм с количественным преобладанием S типа рис. 2). У двух растений линии МС 15255 отмечены митохондрии только S-типа.
По гену а1рА все образцы мужски стерильных линий МС 2/358 № 12 и МС 2/358 № 1232 были гетероплазматичны (SN вариант ми-тохондриальной ДНК), остальные МС линии имели образцы с цитоплазмой S- или SN-типа (табл. 2).
О T- CN
CM T— CN со Ю CD oo CD
т- CN со Ю <o oo en CD CD CD CD CT> CD CD CD CD CD CD CD
iri iri iri iri iri iri iri iri iri iri iri iri t t ■s* t t t f t
о о о о о о о о о о о о CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN cn
ю ю m m m m m m m m m m
Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol
z ZZ Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z z z z z z z z z z z Z z
W oo CO oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo oo w
Ю Ю m m m m m m m m m m m m m m m m m m m ю m Ю
£2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 ÇO ÇO £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2 £2
CN CN cn CN CN CM CM CM CM CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN cn
о о о о ООО о о ООО oooooooooooo
mm m m m m m m m m m m m m m m m m m m m mm m
Рис. 2. Варианты гена а1р6 в популяциях растений сахарной свеклы двух селекционных линий с ЦМС (представлены растения № 1-12 линии МС2/358 № 505 и линии МС2/358 № 12-49). Контроль: N (фертильное растение) - в центре и - по краям геля
Таблица 2
Результаты анализа вариантов митохондриальных генов atp6 и atpA в популяциях 30 диплоидных линий сахарной свеклы (гиногенетических и селекционных)
Линия* Количество образцов atp6 atpA
S SN N NS S SN N NS
Гиногенетические линии
Бц40СУГ35РК300Gy 10 2 5 3 2 8
Янаш 81678(4x)-4(2) 10 10 10
Бел69-3(5)РК 10 10 10
Ялт(4х)ДГ 10 10 10
Янаш 81678(4х)-2(2) 10 10 10
Бц40СУГ35РК30Gy 10 10 10
81678(4х)-2(1) 10 10 10
Бел69-1 300Gy 10 10 10
Янаш 81678(4х)-1(3)РК 10 10 10
Бц40СУГ 10 10 10
Бел69-1 10 10 10
Янаш 49РК 10 10 4 6
Ган о 55-9(2) 10 10 10
В103(4х)ДГ 10 10 9 1
ЯнКУГ РК 10 10 3 7
Селекционные линии
МС 15255 10 2 8 1 9
ОП 411 10 10 10
МС 119 10 10 6 4
ОП Б069(1к)п884/96 10 10 10
Ган о 55 п587/99 10 10 10
ОТ 1/603 №488 10 1 9 1 9
МС 2/358 №12-28 10 10 1 9
Продолжение табл. 2
Линия* Количество образцов atp6 atpA
S SN N NS S SN N NS
Гиногенетические линии
ОТ 1/603 №17-28 10 10 10
МС 2/358 №12 10 10 10
ОТ 1/603 №17 10 10 10
МС 2/358 №12-49 10 10 5 5
МС 2/358 №12-32 10 10 10
ОТ 1/603 №17-32 10 10 10
МС 2/358 №505 10 10 4 6
МС 2/358 №507 10 10 6 4
* - все линии гиногенетического происхождения были индуцированы в культуре in vitro из единичных клеток фертильных растений доноров; среди селекционных линий образцы с маркировкой «МС» несли признак ЦМС, образцы «ОП» и «ОТ» были фертильными.
Анализ обоих цитоплазматических генов для 6 фертильных селекционных линий выявил наличие митохондрий только №типа у подавляющего большинства растений (59 из 60). Одно растение фертильной линии ОП 1/603 № 488 характеризовалось наличием митохон-
дрий двух типов с преобладанием S-варианта (рис. 3). Линия Ганусовская односемянная 55 п 587/99 резко выделялась из этой группы, поскольку было показано, что все ее растения имели варианты цитоплазматических генов atpA и atp6, свойственные цитоплазме S-типа.
о
со ю «о со т-;
со со со со со со со со со со
со со со со со со со со со со
■ч-
OI OI OI OI OI OI OI OI OI OI
та Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z
s со со СО СО СО со со СО со со
o. о о о о о о о о о о
о «о «о «о «о «о «о «о «о «о со
о
чу т—
6 1— 1— 1— 1— 1— 1— 1— 1— 1— 1—
Ш О О О О О О О О О О
Рис. 3. Пример единичного растения № 8 фертильной линии ОТ 1/603 № 488 с 8н-типом гена а(рб. Все остальные растения имеют варианты этого мт гена, соответствующие ^типу цитоплазмы.
Контроль: «МС форма» (8н-тип) геля
В группе 15 линий гиногенетического происхождения по результатам анализа указанных двух цитоплазматических генов выделяются несколько подгрупп, имеющих общее происхождение: три линии, созданные на основе сорта Белорусская односемянная 69, три линии на основе Белоцерковской односемянной 40, четыре линии на основе сортообразца 81678 и линия Ялтушковская ДГ имели цитоплазму №гипа; а
две линии на основе сорта Янаш А3 и Верхняч-ская 103 ДГ характеризовались наличием вариантов, свойственных стерильной цитоплазме и SN-типа). Однако линия Бц40СУГ35РК300Gy, несмотря на преобладание образцов с №типом цитоплазмы, вероятно из-за конверсии, имела образцы с SN- и ^-вариантами цитоплазмы. Обобщенные результаты анализа всех 30 линий представлены в табл. 2.
Гибридные комбинации белорусской селекции и их родительские линейные компоненты При изучении линейного материала сахарной свеклы в популяциях были обнаружены растения как с цитоплазмой S-, так и К-типа, а также смешанного и К3). Для подтверждения использования признака в качестве возможного маркера при молекулярно-генетической паспортизации гибридов были проанализированы популяции четырех отечественных гибридов и их родительских компонентов. Материнские линии с ЦМС Было показано, что из 4-х линий сахарной свеклы с признаком ЦМС, а именно МС 223-2, МС 2/358 № 322, МС2/358 № 10 и МС121^-43-2/91), две линии (последние из этого перечня) являются лучшими в качестве материнского компонента для гибридизации, поскольку все растения первой (всего 24) и второй линии (20 из 21) характеризовались по обоим митохондриальным генам наличием вариантов, свойственных стерильной цитоплазме S- и SN- типа. Поскольку все рас-
тения были замаркированы, выяснилось, что единственное растение под номером 5 линии МС121^-43-2/91) по обоим генам характеризовалось митохондриями, свойственным нормальному типу цитоплазмы и оно было выбраковано из популяции линии с мужской стерильностью на ранних стадиях развития первого года вегетации, когда фенотипически данный признак не был еще распознаваем, т.е. еще до появления генеративных побегов с пыльниками. Эти две выровненные мужски стерильные линии могут представлять интерес для селекционеров, поскольку в комбинациях скрещиваний на их основе можно прогнозировать высокую степень гибридности. У двух других изученных мужски стерильных линий были обнаружены растения, которые по обоим генам характеризовались присутствием митохондрий нормального типа цитоплазмы, причем у линии МС 223-2 таких растений было 5 (рис. 4), а у МС 2/358 № 322 - два растения (табл. 3).Эти растения можно отнести к «генетическим загрязнениям» указанных линий с признаком ЦМС.
Рис. 4. Пример значительного числа фертильных растений (всего пять - № 2, 3, 4, 14, 16) с вариантом гена atp6
К-типа в популяции мужски стерильной линии МС 223-2
Отцовские компонент-опылители Анализ четырех отцовских компонентов скрещиваний с признаком многосемянности, запланированных для использования в качестве опылителей при создании гибридов, показал, что все растения линий ММ 080 п40/90 и Л8159 (4х) характеризуются К-типом цитоплазмы по обоим цитоплазматическим генам. При этом только
одно растение линии ММ 080 п40/90 помимо нормальной цитоплазмы по гену а1р6 содержало в минорных количествах митохондрии S-типа.
У гиногенетических линий Янаш СУГ, 2001 и Янаш 2, к 99/04 были выявлены многочисленные нарушения при формировании пыльцы, и они характеризовались в основном ге-тероплазмией типа SN- и S-вариантами двух
изученных генов. Растения с №типом цито- (рис. 5, ген а1рб, растение № 18 и рис. 6, ген плазмы по генам аХрб и atpA были единичными а1рА, растения № 18, 20, 21).
Рис. 5. Результаты электрофоретического разделения ампликонов мт-гена atp6 у линии Янаш 2, к 99/04: растение № 18 содержит продукт реакции 266 п.н., специфичный для мт-генома N-цитоплазмы, растения № 10 и № 16 характеризуются наличием только S-типа цитоплазмы (продукт 389 п.н.), остальные растения представлены вариантом SN (гетероплазмия). Маркер L (Ladder 1000bp)
Рис. 6. Результаты электрофоретического разделения ампликонов мт-гена atpA в популяции растений линии Янаш 2, к 99/04. У большинства растений наблюдаются митохондрии S-типа (ампликон 727 п.н.), за исключением образцов №18, 20, 21 с митохондриями N-типа (ампликон
634 п.н.). Маркер L (Ladder 1000bp)
Гибридные комбинации При характеристике диплоидных гибридов сахарной свеклы в популяциях комбинации МС 223-2 х ММ 080 п 40/90 были отмечены 3 растения из 30 исследованных (по обоим генам) и в комбинации МС 2/358 № 322 х Янаш СУГ, 2001 также 3 растения из 30 (№ 18, 24 и 30 по обоим генам) с №типом цитоплазмы (рис. 7).Третий диплоидный гибрид МС 121 ^-43-2/91) х Янаш 2, к 99/04 был охарактеризован как лучший из трех, поскольку вся популяция из 30 растений
имела варианты генов, характерных для стерильной цитоплазмы. То же следует сказать о триплоидном МС 2/358 №10 х Л 8159 (4х) гибриде, у которого были выявлены два растения с вариантами генов, характерных для нормальной цитоплазмы по одному из генов, остальные были стерильными и SN-типа). В целом, выявлена высокая степень стерильности в популяциях растений четырех изученных гибридных комбинаций сахарной свеклы белорусской селекции, что характеризует их позитивно. Тем
не менее, выявлены 2 диплоидных гибрида «нестерильность» которых, установленная в ходе изучения митохондриальных генов atpА и а1р6, достигает 10%.
Обобщенные результаты анализа двух ци-топлазматических генов atpА и atp6 для гибридов белорусской селекции и их линий-компонентов представлены в табл. 3.
Рис. 7. Варианты гена atpA S-типа в популяции растений гибридной комбинации МС 2/358 № 322 х Янаш СУГ, 2001. Образцы № 18, 24 и 30 характеризовались N-типом цитоплазмы (по 2 генам).
Маркер L (Ladder 1000bp)
Таблица 3
Анализ цитоплазматических генов МрА и Мрб в популяциях растений сахарной свеклы селекционных линий РУП «Опытная научная станция по сахарной свекле» (г. Несвиж) и гибридов на их основе
Генотип* Количество образцов atp6 atpA
S SN N NS S SN N NS
МС 223-2 х ММ 080 п40/90 30 27 3 22 5 3
МС 223-2 21 16 5 10 6 2 3
ММ 080 п40/90 24 23 1 24
МС 2/358 №322 х Янаш СУГ, 2001 30 21 6 3 27 3
МС 2/358 №322 24 22 2 13 9 2
Янаш СУГ, 2001 21 20 1 20 1
МС 2/358 №10 X л 8159 (4х) 29 11 17 1 18 10 1
МС 2/358 №10 24 24 19 5
Л 8159 (4х) 21 21 21
МС 121 (S-43-2/91) X Янаш 2, к 99/04 30 2 28 18 12
МС 121 (S-43-2/91) 21 20 1 18 2 1
Янаш 2, к 99/04 21 2 18 1 18 3
* - гибридные комбинации обозначены жирным шрифтом; образцы с маркировкой «МС» несли признак ЦМС (стерильные материнские формы), остальные популяции -многосемянные опылители, включая Янаш СУГ, 2001 и Янаш 2 к 99/04 гиногенетического происхождения (фертильные отцовские формы)
Экспериментальные данные по анализу типа цитоплазмы в популяциях линейного и гибридного материала сахарной свеклы, используемого в белорусской селекции (всего 1000 растений), на основании обнаруженных вариантов двух мт генов atp6 и atpA, выявили наличие трех основных групп образцов-растений с N-нормальной, S-стерильной и смешанной цитоплазмой с митохондриями S- и N-типа. В смешанном варианте в подавляющем большинстве случаев отмечена гетероплазмия с преобладающим S-компонентом стерильной цитоплазмы по сравнению с менее выраженным компонентом нормальной N-цитоплазмы, т.е. SN в редких случаях - NS.
Митохондриальная гетероплазмия, или сосуществование в ткани альтернативных вариантов последовательности мт ДНК или более, чем одного митохондриального гаплотипа, широко распространена среди многоклеточных эукари-от [8], в том числе высших растений, причем количество мутантных вариантов может меняться в поколениях. У сахарной свеклы обнаружено несколько типов N- и S- цитоплазм, в формировании Оуэновского типа ЦМС участвует Svulg-тип мтДНК, который характеризуется изменениями структуры и экспрессии генов, а также различиями в некодирующих областях [9]. Ее митохондриальный геном состоит из набора линейных и кольцевых субгеномных молекул различного размера с возможностью рекомбинации между ними благодаря наличию повторов. Эти молекулы могут независимо реплицироваться и содержаться в общем пуле мтДНК в неравных стехиометрических соотношениях. С помощью ПЦР в реальном времени и с использованием специфичных для N-типа и Svulg (Оуэновского)-типа маркеров (открытых рамок считывания и генов, но не atp6 и atpA) было показано наличие всех исследованных маркеров мтДНК N-типа в мужски стерильных растениях и только некоторых специфичных маркеров Svulg - типа в фертильных растениях, что свидетельствовало в пользу гетероплазматич-ного характера организации мтДНК сахарной свеклы, но у фертильных растений она была неочевидной [10].
Наши результаты по вариантам генов atp6 и atpA в популяциях линий и гибридов сахарной свеклы, используемых в белорусской се-
лекционной практике, хорошо согласуются с этими данными: в популяциях растений линий с ЦМС, коммерческих гибридов, гибридных комбинаций (табл. 1, 2, 3) гетероплазмия типа SN - частое явление, в популяциях фертильных растений гетероплазмия также была выявлена, причем разной стехиометрии - и NS- и SN-rara (например, у линии Бц40СУГ35РЮ000у), и только чаще SN типа (например, у гиногенети-ческих линий .Янаш 49РК, В103(4х)ДГ, ЯнКУГ РК, таблица 2). Показано также, что в популяциях растений и гибридов, и линий с ЦМС SN тип гетероплазмии наблюдался чаще при исследовании вариантов гена atp6. Ген atpA характеризовался однополосными вариантами S и N и редко двухполосными вариантами типа SN Сопоставляя результаты молекулярного маркирования с полученными ранее данными по фенотипической характеристике растений (цитоанализ пыльцевых зерен) указанных линий - гиногенетических на ранних этапах их формирования и единичных селекционных [11], мы пришли к заключению, что у тех линий, растения которых имели фертильную пыльцу, отмечены N-варианты мт генов, а в группе линий, индуцированных в культуре in vitro из гаплоидных клеток растений доноров сорта Янаш А3 были обнаружены в больших количествах стерильные или полустерильные растения, а молекулярное маркирование выявило в популяциях этих гиногенетических линий S- и SN-варианты генов. Использованный нами метод оценки позволил различать фертильные растения сахарной свеклы и стерильные (с основной фракцией митохондрий, характерных для S-типа цитоплазмы), но без ранжирования на полу- и полностью стерильные.
Поскольку сахарная свекла является облигат-ным перекрестником с пыльцой, разносимой насекомыми и ветром на большие расстояния, любые из ее линейных или гибридных популяций в случае репродукции при недостаточной изоляции могут содержать растения, к ним не относящиеся. Изучение вариантов не одного, а двух мт генов на замаркированных растениях этих популяций в ряде случаев может помочь распознать, принадлежит ли обнаруженное необычное растение к своей популяции или к чужой. Например, если по обоим вариантам мт генов количество необычных для популя-
ции растений одинаково, как в случае гибридной комбинации МС 2/358 №322 х Янаш СУГ, 2001 (табл. 3), где 3 растения имели варианты генов, характерные для фертильных растений с К-типом цитоплазмы, то эти три фертильных растения можно отнести к «генетическому загрязнению» данной гибридной популяции, гибридные растения которой должны быть стерильными. Если количество необычных для рассматриваемой популяции растений по результатам молекулярно-генетического анализа одного из мт генов не совпадает с их количеством по результатам молекулярно-генетического анализа второго мт гена, то трактовка происхождения таких растений в популяции и оценка «чистоты» или выровнен-ности гибрида или линии усложняются. Эти данные помогают понять причины затруднений при разработке принципов паспортизации сортов такой перекрестноопыляемой культуры, как свекла. Уже на начальных стадиях применения микросателлитного маркирования для характеристики популяций и составлении молекулярно-генетических паспортов линий и гибридов сахарной свеклы нами было установлено, что иногда частоты встречаемости определенных аллелей SSR-локусов очень малы, что позволяет считать эти аллели редкими и даже уникальными, что отражается в формуле паспорта [12]. В случае обнаружения единичных растений-носителей этих уникальных аллелей в исследуемой маркируемой популяции свеклы, представляется целесообразным проведение у них анализа вариантов мт генов atp6 и atpЛ и установления принадлежности этих растений либо к искомой популяции с известным типом
цитоплазмы, либо к привнесенным извне «генетическим загрязнениям».
Важно отметить, что в изученных предложенным методом популяциях селекционных линий и гибридов сахарной свеклы наблюдалось все возможное разнообразие вариантов генов atp6 и atpЛ и гетероплазмия, т.е метод оказался информативным. Определение типов цитоплазм у сахарной свеклы в публикациях последних лет происходило с использованием и других молекулярных маркеров - специфических рамок считывания, (например, от^В, rps4, входящих в состав обоих типов цитоплазмы, oтf324, S-RAPD, специфичных для мт ДНК S-типа и о^246, специфичной для мт ДНК К-типа), гена сох11, минисателлитов [10, 13-15]. Эти работы были посвящены решению конкретных задач по установлению копийности маркерных последовательностей, подтверждению явления гетероплазмии у фер-тильных растений, детальной характеристике множественных вариантов S- и К-цитоплазм с помощью ПЦР в реальном времени у этой сельскохозяйственной культуры, но использованный нами метод был прост и надежен для разделения стерильных растений от фертильных на ранних этапах формирования свекольного растения, что было важно для программ селекции, а также способствовал разрешению спорных моментов при составлении молекулярно-генетических паспортов коммерческих гибридов сахарной свеклы, закупаемых хозяйствами Республики. Такие исследования с целью скрининга селекционного материала сахарной свеклы были проведены в стране впервые.
Список использованной литературы
1. Bosemark, N.O. Genetics and Breeding / N.O. Bosemark // The sugarbeet crop / D.A. Cooke and R.K. Scott (Eds.). - London: Chapman and Hall, 1993. - P. 66-119.
2. Вепрев, С.Г. Изменение типа цитоплазмы у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) при инбридинге: влияние гибридизации / С.Г. Вепрев, И.Б. Хворостов, Г.М. Дымшиц // Генетика. - 2003. - Т. 39, № 6. - С. 796-804.
3. Molecular mapping of a fertility restorer gene for Owen cytoplasmic male sterility in sugar beet / E. Hagihara [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2005. - Vol. 111. - P. 250-255.
4. Изменение типа цитоплазмы у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) при инбридинге. I. Гибридологический анализ и тестирование типа митохондриальной ДНК / С.Г. Вепрев [и др.] // Генетика. - 1997. - Т. 33, № 7. -С.934-942.
5. ПЦР-анализ конверсии N-типа цитоплазмы в S-тип у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / И.П. Хворостов [и др.] // Доклады АН. - 1997. - Т. 357, № 4. - С. 572-574.
6. Svirshchevskaya, A.M. Production and Performance of Gynogenetic Sugarbeet lines / A.M. Svirshchevskaya, J. Dolezel // J. of Sugar
Beet Research (USA). - October-December, 2000. - Vol. 37, N 4. - P. 117-133.
7. Plaschke, J. Detection of genetic diversity in closely related wheüt using microsatellite markers / J. Plaschke, M.W. Ganal, M.S. Roder // Theor. Appl.Genet. - 1995. - V. 91. - P. 1001-1007.
8. Kmiec, B. Heteroplasmy as a common state of mitochondrial genetic information in plants and animals / B. Kmiec, M. Woloszyn-ska, H. Janska // Curr.Genet. - 2006. - V. 50. -P. 149-159.
9. The cytoplasmic male-sterile type and normal type mitochondrial genomes of sugar beet share the same complement of genes of known function but differ in content of expressed ORFs / M. Satoh [et al.] // Mol. Gen. Genomics. -2004. - V. 272. - P. 247-256.
10. Брагин, А.Г. Оценка стехиометрии маркерных последовательностей митохондри-ального генома сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) методом ПЦР в реальном времени / А.Г. Брагин, М.К. Иванов, Г.М. Дымшиц // Доклады АН. - 2006. - Т. 406. - Вып. 2. -С. 260-265.
11. Свирщевская, А.М. Гинонез in vitro: создание и изучение коллекции линий сахарной свеклы / А.М. Свирщевская [и др.] // Молекулярные механизмы генетических
процессов и биотехнология: матер. Меж-дунар. ммпозиума, Москва, 18-21 ноября 2001 г., Минск, 22-24 ноября 2001 г. - М., 2001. - С. 417-418.
12. Микросателлитный анализ линейного материала сахарной свеклы / А.М. Свир-щевская [и др.]. // Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы Междунар. науч. конф., 3-6 дек. 2008 г., г. Минск / редкол.: Н.П. Максимова [и др.]. - Минск: Изд. центр БГУ, 2008. - С. 160-162.
13. The distribution of normal and male sterile cytoplasms in Chinese sugar-beet germplasm / D. Cheng [et al.] // Euphytica. - 2009. - V. 165. -P. 345-351.
14. Анализ гетероплазматического состояния митохондриальной ДНК фертильных и мужскостерильных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / А.Г. Брагин [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. -2011. - Т. 15, № 3. - С. 524-530.
15. Mitochondrial genome diversity in Beta vulgaris L.ssp.vulgaris (Leaf and Garden Beet Groups) and its implications concerning the dissemination of the crop / D. Cheng [et al.] // Genet. Resour. Crop Evol . - 2011. - Vol. 58. -P. 553-560.
Дата поступления статьи 20 августа 2013 г.
