CC BY
6
ОЦЕНКА ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ПРИ
ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С БИОСУБСТРАТАМИ
1 2 Н.Б. Мельникова , С.П. Перетягин
1 Приволжский медицинский исследовательский университет, Н. Новгород, Россия
Ассоциация российских озонотерапевтов Н.Новгород, Россия
Abstract
The paper presents a method that allows one to assess the dependence of the response of biological substrates oxidized by ozone on its concentration and dose during chemical interaction with the substrate in model systems.
Key words: ozone, biological oxidation, model systems
В работе представлен метод, позволяющий оценивать зависимость отклика окисляемых озоном биологических субстратов от его концентрации и дозы при химическом взаимодействии с субстратом в модельных системах.
Ключевые слова: озон, биологическое окисление, модельные системы
Биохимическая адаптация организма человека при экстремальном воздействии на него каких-либо факторов направлена на сохранение целостности и функциональной активности низкомолекулярных веществ, макромолекул и надмолекулярных комплексов. Кроме того, адаптация способствует снабжению организма источниками энергии и питательными веществами, поддерживает регуляторные механизмы обмена веществ и его изменений в зависимости от непостоянных условий среды.
Воздействие озона в терапевтических дозах может служить пусковым механизмом запуска химических реакций, способствующих биохимической адаптации организма человека. Кроме общепринятых механизмов положительного действия озона (например, оптимизация про- и антиоксидантного потенциала, усиление кислородообеспечения тканей, интенсификация энергообразования, восстановление микроциркуляции, иммуномодулирующее действие, противоотёчное, гипокоагуляционное, детоксикационное за счёт активных форм кислорода АФК), существует возможность и «негативных» механизмов, способствующих деструкции аминокислот, липидов и углеводов под действием озона.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния различных концентрации озона в физиологическом растворе NaCl на биологические субстраты в модельных системах.
Для достижения указанной цели необходимо было изучить следующие вопросы:
1) исследовать концентрационную зависимость отклика биологической системы при воздействии озона на модельных системах некоторых главных химических компонентов живых организмов:
• аминокислот и электролитов (модельная система 10 % раствор аминоплазмаля Е),
• углеводов (модельная система 5 % раствор глюкозы).
2) Выбрать и обосновать количественный показатель, способный выступать как отклик системы на озонирование для каждого из перечисленных типов химических компонентов в живых организмах.
3) Сопоставить результаты отклика системы на модельных системах и цельной крови больного.
Материал и методы
Принято привлекать понятие отклика системы (Я), как какого-либо свойства, способного количественно характеризовать биохимический процесс, в случае сложных, неоднозначно интерпретируемых процессов.
Озон может вызывать сложный каскад химических реакций в крови человека, являясь, с одной стороны, окислителем, а с другой способного выполнять функции эндогенного антиоксиданта. Исходя из этого, для оценки зависимости каких-либо свойств или изменений главных химических компонентов живых организмов от концентрации озона в системе, нами были использованы отклики систем (Я):
к 0/о = ['свойство]нач - [свойство]конеч
' [ свойство] нач. , (!)
где свойство может быть представлено концентрацией компонента, площадью полосы на ВЭЖ-хроматограмме, оптической плотностью в электронной спектроскопии или любым другим регистрируемым сигналом, отражающим свойства системы.
Экспериментальная часть
1) Анализ аминокислот
1.1 Анализ аминокислот методом электронной спектроскопии [2, 3] проводили, используя нингидриновую реакцию с 0,2% водным раствором нингидрина по методике, указанной в ФСП на кислоту глутаминовую. После полного охлаждения продукты нингидриновой реакции каждой из 20-ти а-аминокислот разбавляли водой в различных соотношениях до получения значений оптической плотности максимумов поглощения от 0,4 до 1,0, и изучали спектральные характеристики продуктов для смеси а-аминокислот в диапазоне длин волн 380-600 нм. Было установлено, что спектры поглощения имеют единый максимум при длине волны 400±2 нм и в диапазоне длин волн 580 нм.
Исключение составляют продукты реакции с цистеином, пролином и гистидином. Продукт реакции с цистеином характеризуется низкой интенсивностью поглощения в видимой области и имеет максимум при длине волны 450 нм. Пролин - единственная а-аминокислота, в структуре которой
отсутствует первичная аминогруппа, этим объясняется отсутствие характерного (при 400 нм) максимума поглощения в видимой области спектра. Однако в диапазоне 395-402 нм отмечается четкое плечо с достаточно интенсивным поглощением. Продукт реакции с гистидином имеет недостаточную интенсивность поглощения в видимой области спектра. Важно отметить, что большинство продуктов реакции характеризуются единым максимумом поглощения при 400 нм (рис. 1-4).
Рис 1. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина: 1 - треонин; 2 - метионин; 3 - лизин; 4 - пролин; 5 -фенилаланин
Рис 2. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина: 6 - глутамин; 7 - серин; 8 -изолейцин.
Рис 3. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина: 9 - глицин; 10 - аргинин; 11 - триптофан; 12 - аспарагин; 13 - тирозин
Рис 4. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина: 14 - лейцин; 15 - аланин; 16 - валин; 17 - аспарагиновая кислота; 18 - глутаминовая кислота
Таким образом, был сделан вывод, что наиболее целесообразно проводить реакцию с использованием водного раствора нингидрина с последующим определением оптической плотности её продукта при длине волны 400 нм.
Установлено, что наиболее стабильный продукт во времени наблюдается при проведении реакции между 1 мл 0,1 % раствором глицина и 1,1 мл 0,2 % водного раствора нингидрина (значение оптической плотности за период времени 1-2 ч после начала реакции снижается на 1 %).
Нами также изучено влияние температуры, и продолжительности реакции во времени на стабильность продуктов. Установлено, что наиболее стабильные и высокие значения оптической плотности наблюдаются при проведении реакции в течение 20 мин при температуре 120 °С.
На основе проведенных исследований были установлены оптимальные условия проведения нингидриновой реакции: к 1 мл 0,1 % раствора а-аминокислоты добавляют 1,1 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагре -вают при температуре 120 °С в течение 10 мин. После полного охлаждения продукт реакции разбавляют водой до 100 мл и спустя 1 ч после начала реакции на спектрофотометре определяют значение оптической плотности при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Таким образом, было показано, что указанные выше условия проведения нингидриновой реакции позволяют определить суммарное количество для большинства а-аминокислот, а оптическая плотность при длине волны 400 и 580 нм может выступать в качестве свойства, однозначно определяющего отклик системы при озонировании на изменения электронного состояния аминокислот, наиболее вероятно, комплекса аминокислот с АФК.
1.2 Анализ аминокислот методом высокоэффективной обращено-фазовой хроматографии (ВЭЖХ) (1) проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-10AVvp с УФ-детектором, колонка Discovery C18 с зернением 5 мкм.
Пробоподготовка включала дериватизацию смеси аминокислот по реакции с нингидрином, описанной в п. 1.1.
Условия детектирования: аналитическая длина волны 400 нм и 580 нм, температура 40оС, подвижная фаза - фосфатный буфер (рН 7,5) : ацетонитрил = 85 : 15, внешний стандарт - фурациллин, скорость потока 1 мл/мин. Время выхода деривата 15 мин
Площадь пика деривата будет выступать в качестве параметра, отражающего свойства системы (количество комплекса аминокислот с АФК).
2) Анализ глюкозы проведен по известной унифицированной методике ортотолуидиновым методом и йодиметрическим титровании, основанной на принципе - глюкоза при нагревании с ортолуидином в присутствии серной кислоты даёт сине-зелёное окрашивание.
Оценку взаимодействия озона с испытуемыми системами проводили после предварительного насыщения стандартного физиологического раствора NaCl кислород-озоновой смесью с разными концентрациями в ней озона, получаемой от аппарата МЕДОЗОНС-Бьюти (РУ№ 2018/7050 ; РОСС RU.АГ58.Д03252) путём добавления в условиях in vitro проозонированного раствора к модельной системе в объёмах 1: 10.
Результаты
1) Зависимость отклика системы (R) по аминокислотам от концентрации озона, вводимого в систему на примере 10% раствора аминоплазмаля Е.
В качестве отклика системы (R) по аминокислотам была использована суммарная концентрация аминокислот, определяемая по оптической плотности при длине волны 580 нм (рис. 5).
Abs
□VER1_eaolada / Aspect Plus V1.72
0.5500-
400.00 140.00 430.00 520.00 5В0.00
пт
Рис. 5. Электронные спектры 10 % раствора Аминоплазмаля Е после обработки озоном в разной концентрации: исходный препарат (кривая 1), С (О3) = 3 000 мкг/л (кривая 2), С (О3) = 10 000 мкг/л (кривая 3), С (О3) = 40 000 мкг/л
(кривая 4)
Данные представлены в таблице 1:
Таблица 1. Влияние озонированного в 10% растворе аминоплазмаля Е
на отклик системы
С (озона), мкг/л, насыщающие 0,9% раствор NaCl R, % (по данным эл. спектроскопии) R, % (по данным ВЭЖХ-анализа)
3 000 17,7 15,2
10 000 32,3 30,5
40 000 17,7 16,7
Можно предположить, что экстремальная зависимость, наблюдаемая при воздействии озона с концентрацией 10 000 мг/л, в условиях in vitro обусловлена тем, что при этих условиях образуется максимальное количество комплекса аминокислот с АФК. При большей концентрации озона 40 000 мг/л срабатывают дезадаптационные механизмы, приводящие к уничтожению АФК и их комплексов с аминокислотами.
Полученные нами результаты подтверждены данными ВЭЖХ-анализа.
При сравнении влияния озона и кислорода на цельную кровь больного нами было установлено, что количество комплексов аминокислот с АФК при воздействии озона (R(O3) = 105 %) намного превышает количество комплексов аминокислот с АФК при воздействии кислорода (R(O2) = 69 %) (рис. 6).
Рис. 6. Электронные спектры аминокислотной фракции цельной крови больного (кривая 1) после обработки: кислородом (кривая 2) и озоном (кривая 3) после нингидринной пробы в разной концентрации
2) Зависимость отклика системы (Я) по сахарам от концентрации озона при насыщении им 0,9% раствора КаС1, вводимого в систему на примере 5 % раствора глюкозы.
В качестве отклика системы (Я) по сахарам в качестве свойства системы была использована концентрация глюкозы. Данные представлены в таблице 2:
Таблица 2. Влияние озонированного №СЬ в 5% растворе глюкозы на отклик
системы
С (озона), мкг/л, Я, %
насыщающие 0,9%
раствор КаС1
3 000 23,5
10 000 17,6
40 000 15,7
Полученные результаты, вероятно, могут свидетельствовать о том, что при концентрации озона в 3 000 мг/л образуется максимальное количество активированных комплексов с глюкозой. При дальнейшем добавлении озона в систему запускаются дезадаптационные механизмы метаболических окислительно-восстановительных реакций, способствующие уничтожению АФК и их комплексов с глюкозой.
Заключение
Разработанный метод позволит ближе подойти к интегральной оценке механизмов взаимодействия озона с биологическими субстратами и может быть полезен при разработке персонифицированных методик индивидуального выбора доз озона при системной озонотерапии.
Список литературы
1. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ. / Бауер Г., Энгельгард Х., Хеншен А. и др.; Под ред. А. Хеншен и др. М.: Мир, 1988.- 688с
2. Сильверстейн Р. Спектрометрическая идентификация органических соединений [Текст] / Р. Сильверстей, Ф. Вебстер, Д. Кимл. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. - 557 с.
3. Воловенко Ю.М. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для химиков. Учебник для химических специальностей вузов [Текст] / Ю.М. Воловенко, В.Г. Карцев, И.В. Комаров, А.В. Турова, В.П. Хиля. - М.: Издано Международных благотворительным фондом "Научное Партнерство", 2011. -704 с.
