CC BY
127
УДК 615.1:543
РАЗРАБОТКА ДОСТУПНОГО МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ а-АМИНОКИСЛОТ
А. А. Саламатов, А. В. Симонян, Ю. С. Покровская, А. А. Аванесян
Кафедра фармацевтической технологии и биотехнологии ВолГМУ
Для количественного определения а-амино-кислот в лекарственном растительном сырье, лекарственных препаратах и биологических жидкостях разработаны разные методы [1, 3, 4, 5]. Несмотря на высокую точность, их применение ограничено длительностью приготовления рабочих растворов, их токсичностью (потенциометриче-ское титрование в неводной среде) и дороговизной оборудования (газожидкостная хроматография, аминокислотные анализаторы).
Ранее нами изучены спектральные характеристики продуктов реакции а-аминокислот с растворами нингидрина в различных растворителях (ацетон, диметилсульфоксид, вода) и установлено, что наиболее рационально проводить реакцию с нингидрином в водном растворе с последующим определением оптической плотности при длине волны 400 нм [2].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Разработать точный и доступный метод количественного определения а-аминокислот в лекарственных препаратах и растительном сырье, основанный на нингидриновой реакции в водной среде.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалами для исследований служили а-ами-нокислоты, таблетки глицина, стандартный образец глицина, промышленные отходы яблок (шрот) и бобов какао (какаовелла). В ходе выполнения работы использовались методы экстрагирования, выделения и очистки полученных субстанций. Для разработки методики количественного анализа а-аминокислот в таблетках глицина и растительном сырье использовали 0,2 %-й раствор нингидрина в воде. Спектры поглощения продуктов реакции глицина, водных извлечений из шрота яблок и какаовеллы с раствором нингидрина определяли при длине волны 400 нм на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Нами изучены спектральные характеристики продуктов реакции для 20 а-аминокислот с водным раствором нингидрина в диапазоне 350600 нм. Проведенный анализ показал, что спектры поглощения имеют единый максимум при длине
волны (400±2) нм и в диапазоне длин волн 550560 нм (рис. 1-4). Исключение составляют продукты реакции с цистеином, пролином и гистиди-ном. Максимум поглощения для цистеина в видимой области смещен в 450 нм. Пролин - единственная а-аминокислота, в структуре которой отсутствует первичная аминогруппа, этим объясняется отсутствие характерного (при 400 нм) максимума поглощения в видимой области спектра. Однако в диапазоне 395-402 нм отмечается четкое плечо с достаточно интенсивным поглощением. Продукт реакции с гистидином имеет недостаточную интенсивность поглощения в видимой области спектра.
На основании анализа спектральных характеристик продуктов нингидриновой реакции установлено, что оптимальными условиями ее проведения являются: проведение реакции в водном растворе с последующим определением оптической плотности продукта реакции при длине волны 400 нм.
Нами проведена оптимизация условий нингид-риновой реакции в водной среде: к 1 мл 0,1%-го водного раствора а-аминокислоты прибавляют 1,1 мл 0,2%-го свежеприготовленного водного раствора нингидрина и нагревают при температуре 120 °С в течение 20 мин (для лизина продолжительность реакции составляет 3-5 мин, т. к. более длительное нагревание приводит к разложению продукта реакции). Следует отметить, что наибольшая стабильность образующихся продуктов во времени наблюдается спустя 1 ч после начала реакции, а за последующие 30 мин интенсивность светопоглощения снижается на 2,9 %. Поэтому после полного охлаждения продукт реакции разбавляют водой до 100 мл и спустя 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность при длине волны 400 нм.
С целью изучения аналитических возможностей реакции нами проведено количественное определение глицина в таблетках.
На основании оптимизированных условий проведения реакции было подтверждено подчинение законам светопоглощения продукта взаимодействия стандартного образца глицина с 0,2 %-м водным раствором нингидрина в концентрации аминокислоты 0,005-0,025 мг/мл при длине волны 400 нм (г = 0,999). Стандартный образец глицина получен многократной дробной кристаллизацией фармакопейного глицина из спирто-водной смеси.
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
ОД
1 1 1
\ л 2
V
уг- ' ? \ '
ЧМ'Т^Х 4
Л'/ 5 \ # х- \ у > \ ■у/5 Ч V.
/ 1 \
\~-J-' \\
\ р. \
*
* -----
1.Тр(
1еонин Мегионин Лизин Прелин Фенил апанин
330
400
450
500
550
600
Рис 1. Спектры поглощения продуктов реакции а-ами-нокислот с 0,2 %-м водным раствором нингидрина
Рис 2. Спектры поглощения продуктов реакции а-ами-нокислот с 0,2 %-м водным раствором нингидрина
а?
а®
а?
аб
аэ
а4
аз
Ц2
а1
14 14
,17 /
\ / /\- Г / '-Л / \
\ / /У16
Л / 18 / ■ > \
у /А-у^18 ч
14. Лейцин
15. Алании
16. Валнн
17. Аспарагиновая кислота
18. Глугаминовая
Рис 3. Спектры поглощения продуктов реакции а-ами-нокислот с 0,2 %-м водным раствором нингидрина
Рис 4. Спектры поглощения продуктов реакции а-ами-нокислот с 0,2 %-м водным раствором нингидрина
Для количественного анализа 0,1 г (точная навеска) порошка из 20 растертых таблеток помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в горячей воде, после охлаждения раствор доводили водой до метки и фильтровали через стеклянный фильтр № 3. К 1 мл полученного раствора прибавляли 1,1 мл 0,2 %-го водного раствора нингидрина и нагревали при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения раствор разбавляли водой до 100 мл и через 1 ч после начала реакции определяли оптическую плотность при длине волны 400 нм.
Параллельно проводили реакцию свежеприготовленного 0,1%-го раствора стандартного образца глицина с 0,2 %-м водным раствором нингидрина и определяли оптическую плотность.
На основании проведенных испытаний (шесть определений) установлено, что содержание глицина в таблетках составляет 99,13% (см. табл.). Полученный результат укладывается в допустимые нормы отклонений по содержанию глицина в таблетках (±10 %) [3].
В следующем эксперименте нами разработан метод определения суммы аминокислот в растительном сырье - промышленных отходах яблок и бобов какао (какаовеллы), основанный на нин-гидриновой реакции.
Установлено, что продукт взаимодействия про-лина с нингидрином при длине волны 400 нм характеризуется наибольшей стабильностью спустя 1 ч после реакции (за 20 мин интенсивность свето-поглощения снижается на 0,2 %). Кроме того, установлено, что 1,0 г шрота яблок и какаовеллы после кислотного гидролиза содержат 0,0314 и 0,083 ммоль пролина соответственно, что незначительно превышает среднее мольное содержание а-аминокислот в исследуемом сырье (0,027 и 0,066 ммоль соответственно). Нами установлено, что продукт реакции пролина с 0,2 %-м водным раствором нингидрина подчиняется законам светопоглощения в концентрации пролина 0,016-0,072 мг/мл (г = 0,997). На этом основании количественное определение суммы аминокислот в исследуемых объектах можно проводить относительно пролина.
Статистическая обработка метода количественного определения а-аминокислот в таблетках и растительном сырье
Образец f <x>, % s2 s Р, % Дх Е, %
Таблетки глицина 5 99,13 0,93575 0,9673 95 2,49 2,51
Шрот яблок 5 0,1703 3,06-10-6 1,75-10-3 95 0,0045 2,64
Какаовелла 5 0,1907 4,69-10-6 2Д6-10-3 95 0,0056 2,9
Нами разработаны оптимальные условия выделения и очистки суммы аминокислот из растительного сырья. Кроме того, оптимизированы условия проведения нингидриновой реакции для количественного анализа а-аминокислот в исследуемых объектах.
Исходное сырье (шрот яблок, какаовелла) экстрагируется горячей водой. К полученному извлечению добавляется трехкратный объем 96 %-го этанола для осаждения балластных высокомолекулярных соединений и затем отстаивается в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяется центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления спирта, перенося в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводя водой до метки. К 1,5 мл полученного водного извлечения добавляется 1,7 мл 0,2 %-го водного раствора нингидрина и нагревается при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения продукт реакции необходимо разбавлять водой (2:1) и спустя 1 ч после начала реакции определять оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 400 нм. Параллельно проводится реакция свежеприготовленного 0,02 %-го раствора пролина с 0,2 %-м водным раствором нингидрина, после охлаждения продукт реакции разбавляется водой (2:1) и определяется оптическая плотность в аналогичных условиях. Следует отметить, что водные извлечения шрота яблок и какаовеллы
с нингидрином образуют стабильные продукты (за период 1-1,5 ч после начала реакции интенсивность светопоглощения снижается на 0,4 и 1,4% соответственно).
Количественное содержание суммы аминокислот в образцах шрота яблок составило 0,17 %, какаовеллы - 0,19 % в пересчете на пролин.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, на основании изучения спектральных характеристик продуктов нингидрино-вой реакции и последующей оптимизации условий ее проведения разработан простой, доступный и точный метод количественного определения а-аминокислот в лекарственных препаратах и растительном сырье.
ЛИТЕРАТУРА
1. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У. и др. Справочник биохимика. - М., 1991. - 544 с.
2. Симонян А. В., Саламатов А. А, ПокровскаяЮ. С. и др. // Бюлл. ВНЦ РАМН и АВО. - 2004. - № 2. -С. 27-29.
3. ФСП 42-0025265-02-99. Глицин таблетки суб-лингвальные 0,1 г. - 07.06.2002.
4. Шилова И. В., Краснов Е. А., Пяк А. М. // Хим.-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 11. - С. 36-38.
5. Kuryt T., Sawnor-Corszynska D. // Acta chroma-togr. - 2000. - № 10. - Р. 97-103.
УДК:546.46:541.48:616-092.4
ОСОБЕННОСТИ ТРЕВОЖНОГО ПОВЕДЕНИЯ У КРЫС В УСЛОВИЯХ АЛИМЕНТАРНОГО ДЕФИЦИТА МАГНИЯ
И ИХ КОРРЕКЦИЯ
М. В. Харитонова, М. С. Кравченко, А. А. Желтова
НИИ фармакологии и кафедра фармакологии ВолГМУ
Существует мнение, что нарушение гомеоста-за магния в организме играет немаловажную роль в патогенезе многих психических заболеваний, симптомами которых являются депрессия и повышенная тревожность [5, 9, 10]. Более того, после терапии магнием наблюдается стабилизация настроения у пациентов с биполярными расстройствами [2].
Согласно литературным данным, различные соли магния обладают разной биодоступностью [4, 8], которая может повышаться при комбинации солей с пиридоксином. При исследовании скорости компенсации алиментарного дефицита магния неорганическими и органическими солями магния [7] было показано, что наиболее активными в этом отношении из органических со-
