CC BY
87
УДК 664, 648, 18, 579
Т. Ю. Гумеров, Д. И. Валеева, Э. З. Ильясова, О. А. Решетник
ПРИМЕНЕНИЕ НИНГИДРИНОВОЙ РЕАКЦИИ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ НЕЗАМЕНИМЫХ АМИНОКИСЛОТ ЭКСТРАКТА ФИЗАЛИСА
Ключевые слова: аминокислоты, физалис, водные экстракты.
Обеспечение безопасности продовольственного сырья, пищевых продуктов и готовых блюд - одно из основных направлений, определяющих здоровье населения. Правильно организованный и осуществленный технологический процесс приготовления блюд и изделий позволяет сохранить пищевую ценность, сохранить наиболее ценных компоненты пищи, легкоусвояемые углеводы, витамины и минеральные вещества.
Keywords: amino acids, physalis, aqueous extract.
Safety offood raw materials, foodstuff and ready dishes - is one of the basic directions defining health of population. Properly organized and carried out technological process of cooking and selling preserves the nutritional value, save the most valuable food components, digestible carbohydrates, vitamins and minerals.
Введение
Одним из распространенных видом деятельности в сельском хозяйстве, во всех странах мира, является плодоводство. Хозяйственное значение плодоводства определяется высокой ценностью плодов и ягод в питании человека. Плоды и ягоды содержат в большом количестве витамины, сахара, аминокислоты, органические кислоты, белки, жиры, минеральные соли, дубильные, пектиновые, ароматические, биологически активные соединения - всего более 60 элементов. Эти вещества находятся в плодах в виде соединений, легкоусвояемых организмом человека, и играют важную роль в обмене веществ. Плоды - сырье для перерабатывающей промышленности, из них изготовляют натуральные соки, повидла, джемы, цукаты и др. Плодовые и ягодные растения относят к различным ботаническим семействам, родам и видам. Всего в мире насчитывается около 40 семейств, объединяющих 200 родов и более 1 тысячи видов плодовых растений [1].
Одним из ярких представителей многолетних двудольных спайнолепестных растений рода Паслён (Solanum), семейства Паслёновых (Solanaceae) является физалис.
Физалис обыкновенный (Physalis alkekengi) - это травянистое растения с одревесневающим у основания стеблем и крупными, красно-оранжевыми плодами. Среди множества форм и видов физалиса имеются две его съедобные формы - овощной (Physalis philadelphica) и земляничный (Hysalis pubescens).
Плоды овощного и земляничного физалиса - это мясистые ягоды желто-зеленого или желто-оранжевого цвета, похожие на томаты, на вкус от очень приятного до жгуче-горького. Полезные свойства физалиса заключены в его витаминном составе, наличии органических кислот и пектиновых веществ. Плоды физалиса содержат: витамин С и каротин, сахара, пектин, ликопин, лимонную и другие органические кислоты, макро- и микроэлементы, дубильные вещества.
Пектин придает физалису желирующие свойства, которые можно использовать для приготовления желе и мармеладов.
Плоды физалиса применяются при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, при хронических холециститах, при гипертонии, в качестве поливитаминного средства.
Растение обладает противовоспалительным, кровоостанавливающим и болеутоляющим воздействием.
Овощной физалис содержит малое количество сухих веществ, горьковатым привкусом и в переработанном виде используется для приготовления маринадов, солений и варенья. К овощному физалису относится мексиканский физалис, самые известные сорта которого - Кондитер, Московский ранний и Королек [1].
Физалис земляничный имеет характерный кисло-сладкий вкус, плоды содержат гораздо больше сахаров, сухих веществ и аскорбиновой кислоты [2].
Целью работы являлось количественное определение незаменимых а -аминокислот в экстракте физалиса с помощью нингидриновой реакции и метода спектрофотометрии.
В связи с этим, в задачи входило изучение спектральных характеристик продуктов нингидриновой реакции и оптимизирование условий проведения реакции с целью получения стабильных результатов анализа.
Нингидриновая реакция основана на проведение цветных реакций нингидрина с экстрактами исследуемых образцов. В результате нагревания, в щелочной среде исследуемые образцы, содержащие первичные и вторичные аминогруппы (—NH2; ^Н), образуют окрашенные комплексы с трикетогидрин-денгидратом (С9НбО4 - нингидрин). Данные продукты реакции образуют устойчивую интенсивную сине-фиолетовую окраску с максимальным поглощением от 380 до 600 нм. Поглощение при этой длине волны линейно зависит от числа свободных аминогрупп. Нингидриновая реакция является основой для количественного определения методами колориметрии или спектрофотометрии. Чувствительность данной реакции составляет до 0,01%.
В качестве образцов исследования были взяты плоды физалиса овощного (Physalis philadеlphica). Приготовление экстракта осуществлялось следующим образом: 10,0 г сырья (точная навеска), измель-
чали и шестикратно экстрагировали горячей водой в течение 1 ч при температуре 80-90 °С. Полученные извлечения фильтровали, объединяли, переносили в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводили водой до метки (далее образец А).
С целью изучения влияния балластных веществ на количественное содержание незаменимых а-аминокислот в экстракте физалиса, было приготовлено водное извлечение, очищенное от балластных веществ (образец Б). Для этого к 20 мл исходного извлечения (образца А) добавляли тройной объем 96 % этанола для осаждения балластных высокомолекулярных соединений и отстаивали 12 ч при температуре 3-4 °С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, после чего извлечение сгущали до полного удаления спирта, переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили водой до метки.
Подробная методика количественного определения незаменимых а-аминокислот представлена в работе [3]. На основании данной методики была проведена оптимизация условий реакции с водным раствором нингидрина. К 2,4 мл исследуемых экстрактов (образцы А и Б) добавляли 2,1 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревали при температуре 120 °С в течение 25 мин. После полного охлаждения отбирали по 2,5 мл каждого из продуктов реакции и разбавляли их водой: до 10 мл (образец А) и до 5 мл (образец Б), спустя 1 ч после начала реакции определяли оптическую плотность на длине волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Изучение спектральных характеристик проводилось на спектрофотометре ПЭ-5300 ВИ в лаборатории биохимического анализа кафедры ТПП КНИТУ.
В результате исследования водных растворов образцов на спектрофотометре, были получены следующие результаты в виде спектров поглощения оптической плотности (рис.1).
А, нм
Рис. 1 - Видимая область спектра продуктов взаимодействия экстрактов физалиса с 0,2% раствором нингидрина в воде: где D - оптическая плотность, А - длина волны, нм; 1 - Образец А; 2 - Образец Б
По результатам диаграмм установлено что, спектры поглощения характеризуются наличием двух максимумов в диапазонах длин волн 380-400 и 560580 нм, что соответствует видимой области. Данная закономерность наблюдается для всех исследуемых образцов и объясняется наличием первичных аминогрупп а-аминокислот в структуре плодов физалиса.
Таким образом, большинство продуктов реакции а-аминокислот с раствором нингидрина в воде харак-
теризуется единым максимумом поглощения при длине волны 400 нм, что обусловливает целесообразность использования данной длины волны в качестве аналитической.
Далее в работе было определено количественное содержание аминокислот в исследуемых образцах. На рисунке 2 представлена диаграмма количественного содержания а-незаменимых аминокислот.
□ ОбразецА иОбразецБ
Рис. 2 - Количественное содержание незаменимых а-аминокислот в образцах
По данным рисунка необходимо отметить, что существует разница в количественном содержании незаменимых а-аминокислот. В образце, очищенном от балластных веществ (Образец Б) содержание незаменимых аминокислот больше, чем в исходном (Образец А). При этом в наибольшем количестве содержаться моноаминомонокарбоновые незаменимых аминокислот - L-валин (3,865 мг/л) и L-изолейцин (3,828 мг/л). Содержание всех остальных аминокислот отличается незначительно. Полученные данные свидетельствуют о том, что анализируемые экстракты физалиса, характеризуются набором всех незаменимых аминокислот, которые являются наиболее ценными компонентами пищи и должны поступать в организм человека.
С целью оптимизации условий проведения исследований и получения стабильных результатов анализа, на следующем этапе работы был изучен аминокислотный состав физалиса после кислотного гидролиза. К 5 г физалиса добавляли 35 мл воды и оставляли на 30 мин. Затем к сырью добавляли 65 мл HCl в концентрации от 0,5М до 5М и проводили гидролиз при температуре 80-90 °С в течении 2ч. Затем гидролизат отделяли фильтрованием, а сырье, для его более полного истощения, четырехкратно экстрагировали водой (в соотношении 1:6) по 30 мин в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтровали и объединяли с гидролизатом.
К объединенному гидролизату добавляли натрий гидрокарбонат до нейтральной реакции, переносили в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводили водой до метки (Образец В). Водное извлечение, очищенное от балластных веществ методом центрифугирования, соответствует Образцу Г. Результаты проведения нингидриновой реакции представлены в виде диаграммы на рис.3.
Установлено, что проведение кислотного гидролиза экстракта физалиса 1 М раствором HCl способствует увеличению содержания незаменимых а-
аминокислот по сравнению с аналогичным показателем для исходного сырья.
с, м г/л
■ ОбразецВ НОбразецГ ®ï
Рис. 3 - Количественное содержание незаменимых а-аминокислот в образцах после кислотного гидролиза
Данные результаты позволяют выявить количественное содержание наиболее ценных незаменимых аминокислот и показать необходимость оптимизации условий проведения количественного анализа. Установлено, что в наибольшем количестве содержаться \-валин (5,907 мг/л) и \_-изолейцин (5,878 мг/л).
Проведенный эксперимент показал, что плоды физалиса содержат незаменимые аминокислоты, а, следовательно, могут быть использованы в качестве функциональных и лечебно-профилактических добавок в рацион питания человека.
Необходимо отметить, что выявленные в наибольшем количестве незаменимые аминокислоты \-валин и \-изолейцин могут положительно сказываться на здоровье человека и его функционирование. Так например, \-валин является необходим компонентом для метаболизма в мышцах, восстановления поврежденных тканей и для поддержания нормального обмена азота в организме. Азот может быть использован мышцами в качестве источника энергии. \-изолейцин необходим для нормализации обмена веществ в организме, снижения развития камней в почках, смягчения колебаний уровня глюкозы в крови между приемами пищи, регулирования синтеза гемоглобина, стабилизации и регулировании уровня сахара в крови и процессах энергообеспечения, а также для увеличения выносливости и восстановления мышечной ткани [6].
Кроме того, полезные свойства ягод физалиса заключаются в наличии жаропонижающего эффекта, поэтому настой рекомендован при простудных и воспалительных заболеваниях. В состав физалиса входит лико-пин - вещество с антиоксидантными свойствами и значительное количествопектина, что способствует выведению из организма токсинов и других вредных веществ.
В результате проведенного количественного анализа незаменимых а-аминокислот в экстракте физа-
лиса с помощью нингидриновой реакции, а также оптимизации условий проведения эксперимента с целью получения стабильных результатов анализа, необходимо отметить, что:
- используемый метод характеризуется достаточно высокой точностью определения и воспроизводимостью;
- относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превысила ±3 %;
- метод является простым и доступным в исполнении, не требует дорогостоящего аппаратурного оборудования и адаптирован для количественного определения суммы аминокислот в растительном сырье.
Однако, исходное извлечение физалиса (образец А) и гидролизат (образец В) содержат вещества, реагирующие с нингидрином (пептиды и белки), влияющие на изменения значений оптической плотности. Это приводит к ошибкам результатов количественного содержания а-аминокислот образцах. Поэтому, для получения достоверных результатов, отражающих количественное содержание суммы а-аминокислот, необходимо проводить очистку экстрактов от сопутствующих высокомолекулярных соединений, например, с помощью осаждения этанолом, как описано выше.
Итогом работы явилась разработка доступного и относительно простого способа количественного анализа а-аминокислот в различных плодово-ягодных растениях.
Литература
1. Биологический энциклопедический словарь / Под редакцией М.С. Гиляров. - М.: Сов. энциклопедия, 2006. — С. 670.
2. Большой энциклопедический словарь / Под ред. А.М. Прохорова. Издание 2-е, переработанное и дополненное. М.: Большая Российская Энциклопедия, Науч. Изд-во, 1998. - С. 1456.
3. Симонян, А.В. Использование нингидриновой реакции для количественного определения а-аминокислот в различных объектах: методические рекомендации / А.В.Симонян, Ю.С. Саламатов, Ю.С. Покровская. -Волгоград, 2007. - 106 с.
4. Гумеров, Т.Ю. Применение напитков функционального назначения при работе с вредными условиями труда / Т.Ю. Гумеров, О.А. Решетник // Вестник КГТУ. - №21.-2014.-С. 238-241.
5. Гумеров, Т.Ю. Особенности функциональных компонентов пищи при вредных условиях труда / Т.Ю. Гумеров, Р.Р. Мустафин, О.А. Решетник // Вестник КГТУ. -№22.-2014.-С. 246-250.
6. Рогов, И. А. Химия пищи: в 2 кн. Книга 1: Белки: структура, функции, роль в питании / И. А. Рогов, Л. В. Ан-типова, Н. И. Дунченко. - М.: Колос, 2000. - 384 с.
© Т. Ю. Гумеров - канд. хим. наук, доц. каф. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, [email protected]; Д. И. Ва-леева - студентка той же кафедры; Э. З. Ильясова - магистрант гр. 616-М6 той же кафедры; О. А. Решетник, д-р техн. наук, проф. той же кафедры.
© T. U. Gymerov - Ph.D., Associated Professor of the Department of Technology of Food Productions in KNRTU, [email protected]; D. I. Valeeva - student group 613152 the same Department; E. Z. Ilyasova - Master c. 616-M6 master the same Department; O. А. Reshetnik, Full Professor, the same Department.
