CC BY
12
с. б—13. — Трахтенберг И. М., Бартенев В. Д., Шефтель В. О.— В кн.: Гигиена и токсикология высокомолекулярных соединений и химического сырья, используемого для их синтеза. Л., 1969, с. 19.
Поступила 12/VIII 1974 г.
УДК 816-056.3-02:541-07
Проф. О. Г. Алексеева, канд. мед. наук А. И. Петкевич, А. Д. Черноусое, Н. А. Шамсутдинова, JI. Н. Черноусова
ОЦЕНКА НЕКОТОРЫХ МЕТОДОВ IN VITRO ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АЛЛЕРГИИ К ХИМИЧЕСКИМ ВЕЩЕСТВАМ
Научно-исследовательский институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР, Москва I Ленинградский медицинский институт им. И. П. Павлова
Для выявления аллергии к химическим веществам как в клинике, так и в эксперименте повсеместно используют кожные пробы. Однако общепризнано, что кожные пробы могут сенсибилизировать организм и вызывать генерализацию процесса. В связи с этим международная группа экспертов-иммунологов1 высказала мнение о насущной необходимости разработки методов аллергодиагностики in vitro.
Следует отметить, что за последние 10 лет неоднократно пытались использовать химические гаптены в аллергологических диагностических реакциях in vitro — пассивной гемагглютинации (О. Г. Алексеева и соавт.), помутнения плазмы (Р. Уанье; О. Г. Алексеева и соавт.; Е. С. Брусиловский и А. М. Фиалковский; Л. А. Дуева), связывания комплемента (В. М. Баранова), высаливания непреципитирующего комплекса антиген — антитело (Е. С. Брусиловский и А. М. Фиалковский), непрямой деграну-ляции тучных клеток (Н. Р. Поляк; Е. С. Брусиловский и А. М. Фиалковский), термистограммы реакции антиген — антитело (В. П. Казначеев и соавт.), специфического подавления ретракции кровяного сгустка (И. Е. Сосонкин, 1967; Н. Р. Поляк), специфического лейколиза (Л. А. Дуева), специфической задержки лизиса лимфоцитов (Matsuo и Ofuji), повреждения нейтрофилов (Ш. 3. Загидуллин2; А. В. Мысляе-ва и соавт.), агглютинации тромбоцитов (И. М. Линдгрен), специфического гашения флюоресценции (А. В. Мысляева и соавт.), специфической агломерации лнйкоцитов (А. Е. Сосонкин, 1968; А. В. Мысляева и соавт.; Е. С. Брусиловский и А. М. Фиалковский), специфической бласт-трансформации лимфоцитов (Geczy и Baumgarten; Forman и Alexander), розеткообразования (Arnold и соавт.) и подавления миграции макрофагов (Polak и Frey; Arnold и соавт.). Однако большинство из этих методов достаточно сложно, для их качественного выполнения требуются специалисты-иммунологи, поэтому в практике токсикологии и клиник, не имеющих иммунологической лаборатории, в дополнение к кожным пробам чаще применяют неспецифические методы обнаружения аллергии.
Учитывая это обстоятельство, мы при экспериментальном изучении различных аспектов аллергии к химическим веществам провели апробацию 3 технически простых методов аллергодиагностики in vitro — реакции специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) по И. Е.-Сосонкину и 2 неспецифических методов, используемых при изучении аллергии к химическим веществам,— агломерации лейкоцитов, т. е. лейкергии по Fleck (контрольный препарат РСАЛ) и латекс-оседания эритроцитов (ЛОЭ) по Л. И. Израйлету 3. Апробацию проводили в опытах с замасливателями стекловолокна и их ингредиентами (3 марки замасливателя № 30, эпок-сидированный триэтиленгликоль, дициандиамидформальдегидуксусная смола, винилтриэтоксисилан, дибутилсебацинат, смеси из данных ингредиен-
1 Серия технических'докладов ВОЗ, 1973, № 496.
а Автореферат кандидатской диссертации. М., 1970.
* Автореферат докторской диссертации. М., 1970.
тов, в отдельных опытах с добавлением эмульгатора ОС-20), фурановыми соединениями (мономер ФА-смесь моно- и дифуранового ненасыщенного соединения, 5-амино-2фуранкарбоновая кислота, бисфурилиденгексаме-тилендиамин, N, Nl-дифурфураль-р-фенилендиамин), пломбировочными материалами в отвержденном виде и водными вытяжками из них, содержащими метилметакрилат, эпихлоргидрин или оба эти соединения (норакрил-65, акрилоксид, эндодент, жидкость НА № 1 и жидкость АО, состоящие на 97 и 85% из метилметакрилата), исходными продуктами синтеза синтетических волокон (гексаметилендиаминовая соль адипиновой кислоты, диметилтерефталат, капролактам, гексаметилендиамин). Все эти вещества относились к умеренным и слабым аллергенам и обладали (кроме отверж-денных пломбировочных материалов) раздражающим действием различной интенсивности. Для сравнения были взяты еще и неаллергены: умеренный раздражитель — адипиновая кислота и сильный раздражитель — акрилнитрил.
Морских свинок белой масти весом 220—250 г сенсибилизировали внутрикожно (в ухо 10—40 мкг в 0,02 мл ацетона или нестериального физиологического раствора или в подушечки лапок 500 мкг в 0,2 мл полного
35,-
«о
I 30
ö g
25
«.
51
120
о
!
15
5 10 I
++
о о о о
о о о
++
о
о» а
• •
+ + + + +
А
м--
А Д А А А А Ад
6 t-
25
^ 3 а «а
о а а
3t
S
£ S
4 5 6 7 Номера групп
д
А
А А &
А А
-4.—1-S*.
л л
10 11
Рис. 1. Выраженность агломерации лейкоцитов (лейкергии по Fleck) и ЛОЭ при сенсибилизации различными химическими аллергенами.
1 — контроль на введение ацетона: 2 — введение ацетоновых растворов аллергенов; 3 — контроль на введение полного адъюванта (ПАФ): 4 — введение аллергенов в ПАФ; 5 — введение неаллергенов в ацетоне (коуги) ил* ПАФ (квадраты): б — контроль на введение физиологического раствора: 7 — введение аллергенов в физиологическом растворе: 8 — интактиый контроль; 9 — имплантация: 10 — аппликации аллергенов на кожу или слизистую ротовоП полости; // — комплексная сенсибилизация. Прерывистая линия указывает уровень М ±т наивысшего контрольного показателя{
адъюванта Freund), эпикутанно (20 апликаций 10—50% водных "растворов на бок), через слизистую оболочку полости рта (25 ежедневных смазываний в течение 2—3 нед), путем имплантации под кожу отвержденных полимеров или комплексно (имплантация в сочетании с 3 циклами смазываний слизистой оболочки с интервалами 2 мес). Выраженность сенсибилизации оценивали по результатам кожных капельных проб по шкале О. Г. Алексеевой и А. И. Петкевич с одновременной постановкой апробируемых реакций при внутрикожной сенсибилизации через 10—14 дней, при эпикутан-ной и через слизистую оболочку полости рта сразу или через 2 нед после окончания цикла, при имплантации и комплексной в разные сроки начиная с 7-го дня и до 6 мес. Опытные и контрольные группы состояли из 8— 18 животных. Анализ проводили по среднегрупповым показателям (М±т), для большей демонстративности приводимых в статье рисунков величину т на них не указывали.
Как видно из рис. 1, уровень лейкергии по Fleck (процент агломерации лейкоцитов) сенсибилизированных животных лишь в 5 из 49 опытов достоверно превышал верхнюю границу колебаний, наблюдаемую в соответствующих контрольных группах: при введении 20 и 40 мкг бисфурили-денгексаметилендиамина в ацетоне и 15 мкг дициандиамидформальдегид-уксусной смолы в физиологическом растворе в кожу уха, а также при эпикутанных аппликациях и введении со стимулятором Freund гексамети-лендиаминовой соли адипиновой кислоты. Показатель ЛОЭ достоверно был выше верхней границы контрольного уровня в 16 из 45 опытов (в 14 опытах при сенсибилизации эпикутанно, через слизистую оболочку полости рта, комплексно и в 2 опытах при введении в кожу уха физиологических
растворов). При введении раздражителей — неаллергенов — интенсивность агломерации лейкоцитов и ЛОЭ была в пределах колебаний соответствующих контролей. Из рис. 1 видна также зависимость уровня ЛОЭ и особенно
0.5 (0 1.5 Баллы кожных реакций
<5 -
<0 -
3.5 -
3.0 - т •
2.5 -
2.0 О
15 - о о • ° о •
1.0 - • о о
0.5 о о в * е л
Q ;* »а 1 ® А .. А » 1 |
0.5 10 f.5
Баллы ножных реакций
го
Рис. 2. Зависимость интенсивности агломерации лейкоцитов (лейкергии по Fleck) и ЛОЭ
от уровня реакций кожи на гаптен. Белые круги — введение аллергенов в ацетоне; черные круги — введение аллергенов в физиологическом растворе; черный квадрат — введение аллергенов в ПАФ; белый треугольник — аппликация аллергенов на кожу или слизистую ротовоЯ полости: черный треугольник —имплантация; черно-белый треугольник — комплексная сенсибилизация.
Рис. 3. Зависимость интенсивности РСАЛ от уровня реакции кожи на гаптен. Обозначения те же, что на рис. 2.
агломерации лейкоцитов у контрольных животных от выраженности неспецифической воспалительной реакции: наименьшая интенсивность наблюдалась у интактных животных и максимальная — при введении в кожу 0,02 мл ацетона, вызывающего некроз тканей вплоть до прободения уха.
Дальнейший анализ выявил, что интенсивность изучаемых показателей не зависит от выраженности аллергических реакций кожи на гап-тен (рис. 2). Слабая положительная корреляционная связь (г=+0,25) выявлена только между интенсивностью реакции кожи и ЛОЭ при сенсибилизации через слизистую оболочку полости рта или эпикутанно. Следует отметить, что корреляция была более четкой при использовании аллергенов, раздражающее действие которых . было слабо выражено или полностью отсутствовало.
Для оценки РСАЛ была разработана 8-балльная шкала: 0 — изменение процента агломерации, в опытной пробе (ОП) менее 1/3 процента контрольной пробы (КП), 1 балл — ОП больше КП в 1*/г раза, 2 балла — ОП больше КП в 2 раза, 3 балла — ОП больше КП в 3 раза, 4 балла — ОП больше КП в 4 раза, 5 баллов — ОП меньше КП в I1/2 раза, 6 баллов — ОП меньше КП в 2 раза, 7 баллов — ОП меньше КП в 3 раза и 8 баллов — ОП меньше КП в 4 раза. У всех контрольных животных РСАЛ была отрицательной, а у сенсибилизированных, как показано на рис. 3, ее интенсивность хорошо коррелировала с выраженностью реакций кожи на гаптен (/"=+ 0,75 при Р=99%, лш1п=+0,449). В зависимости от силы аллергена и метода сенсибилизации средний балл кожных реакций колебался от 0 (имплантация нор-акрила-65, акрилоксида и эндодента) до 2,1 ±0,3 (введение 40 мкг замас-ливателя стекловолокна № 30 на физиологическом растворе в кожу уха), а средний балл РСАЛ — также от 0 (имплантация акрилоксида и эндодента и в 3 из 4 опытов по сенсибилизации через слизистую оболочку полости рта вытяжкой из норакрила-65) до 4,5±2,6 (тот же опыт с замасливателем № 30).
Выводы
1. Определение спонтанной агломерации лейкоцитов (лейкергии по Fleck) не может быть рекомендовано для выявления аллергии к химическим веществам.
2. Показатель ЛОЭ можно применять для выявления, но не для определения интенсивности сенсибилизации, не сопровождаемой неспецифической воспалительной реакцией на инъекции или раздражение кожи и слизистых оболочек.
3. РСАЛ по чувствительности и специфичности не уступает кожным пробам на гаптен и может быть рекомендована для широкого использования при изучении аллергии к химическим веществам, поступающим в организм различными^путямн.
ЛИТЕРАТУРА. Алексеева О. Г. и др. — «Вести, дерматол.», 1971. № 9, с. 33 — 36. — Алексеева О. Г., П е т к е в и ч А. И. — «Гиг. и сан.», 1972, № 3, с. 64—67. — Баранова В.М. — В кн.: «Дерматология и венерология». Вып. 8. Киев, 1973, с. 47. — Б р у с и л о в с к и й Е. С., Ф и а л к о в с к и й А. М. — «Гиг. труда», 1973, № 10, с. 52—64. — Дуева Л. А. — « Бюлл. экспер. биол.», 1974, № 2, с. 67—69. — Казначеев В. П. "и др. — Тезнсы пленума Правления Всероссийского научного мед. о-ва терапевтов. «Побочное действие лекарств». М., 1968, с. 29. —Мысля е в а А. В. и др. — «Тер. арх.», 1972, № 3. с. 90—92. — Поляк Н. Р. — «Гиг. и сан.», 1973, № 11, с. 72—74. — С о с о н к и н И. Е. — «Лабор. дело», 1967, № 10, с. 613. — Он же. Там же, 1968, № 12, с. 707—709. — Уанье Р. — В кн.: Аллергия к лекарственным веществам. М., 1962, с. 176—186.— Arnold J., Mosse R., Rou-daut M. M. e. a. — «Arch. Méd. Ouest», 1973, v. 6, p. 531. — F о г m a ri L., Alexander S. — «Brit. J. Derm.», 1972, v. 87, p. 320. —Geczy A. F., Baumgarte n A. — «Immunology», 1970, v. 19, p. 189. —MatsuoT, OfuiiS. — J. invest. Derm.», 1967, v. 49. p. 430. — P о 1 a k L., Frey J. R. — «Int. Arch. Allergy», 1973, v. 44, p. 51.
Поступила 4/VI I 1974 г.
