CC BY
75
УДК 616.008.6
В.В. Кацалуха, Ю.В. Юркевич, В.П. Федонюк, С.П. Сидоров
ФОРМИРОВАНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ТОКСИКАНТАМ АЛКИЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ1
Научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия,
vvkatsalukha@rambler.ru
Длительный профессиональный контакт работников химических предприятий с токсическими соединениями может вызвать формирование ряда аллергических заболеваний - бронхиальную астму, круглогодичный ринит, контактный аллергический дерматит и др. [1]. Данное обстоятельство обусловлено тем, что соблюдение гигиенических нормативов содержания промышленных токсикантов в рабочей среде не гарантирует безопасность в отношении развития аллергозов, поскольку концентрации аллергенного действия многих химических веществ практически всегда ниже пороговых токсическихдоз [2]. Способность низкомолекулярных соединений (гаптенов) вызывать сенсибилизацию связана с их способностью ковалентносвязываться с белками в организме, образуя иммуногенные, а, следовательно, и потенциально аллергенные комплексные (конъюгированные) антигены [3]. Токсиканты с алкилирующими свойствами также реагируют с активными центрами белковых молекул, изменяя их антигенную структуру [4, 5]. Можно предположить, что аутологичные белки с измененными антигенными свойствами способны вызвать сенсибилизацию организма, проявляющуюся различными типами аллергических реакций. Убедительных доказательств аллергизирующего действия алкилирующих токсикантов и их аддуктов с белками крови при острых и хронических интоксикациях пока не получено. В связи с проводимым в нашей стране уничтожением запасов химического оружия изучение аллергизирующего действия алкилирующих токсикантов, типов и механизмов гиперчувствительности остается актуальной задачей.
1Katsalukha V.V., Jurkevitch J.V., Fedonjuk V.P., Sidorov S.P.Forming of hypersensitivity to toxic agents of alkylating action.
Целью настоящей работы являлась оценка аллергизирующих свойств ал-килирующего агента дихлордиэтилсульфида и модифицированного им гомологичного сывороточного альбумина в экспериментах на лабораторных животных.
Материалы и методы. Исследования выполнены на 8 кроликах-самцах породы «шиншилла» массой 3-3,5 кг и 28 морских свинках обоего пола массой 300-350 г. Кроликов сенсибилизировали кроличьим сывороточным альбумином (КСА)дозе 1 мг/кг трижды внутрикожно / подкожно с интервалом 7 суток в область спины и подушечки задних лап после алкилирования дихлордиэтилсуль-фидом. Модификацию антигенной специфичности КСА дихлордиэтилсульфи-дом проводили по ранее разработанному методу, взяв за основу данные [6]. Для этого к 3,6 мл 1% раствора КСА в боратном буфере рН 8,4 добавляли 0,4 мл 0,01% водно-спиртового раствора дихлордиэтилсульфида. Смесь белка с ди-хлордиэтилсульфидом инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре и 20 ч - при 40С, после чего использовали в работе.Выявление сенсибилизации проводили внутрикожным введением разрешающей дозы алкилированного КСА в дозе 0,2 мг/кг в предварительно выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища животных через 10 суток после последней сенсибилизирующей инъекции. Аналогичную дозу немодифированного КСА (контроль) вводили в противоположную боковую область. Кожно-аллергические реакции
учитывали в течение 24-48 ч путем определения площади инфильтрата по сле-
2 2 дующей шкале: 0 - 0,12 см - реакция отрицательная; 0,28 - 0,78 см - сомни-
22 тельная; 1,13 - 2,54 см - слабоположительная; 3,14 - 11,34 см - положительная; больше 12,5 см - сильно положительная. Общий сенсибилизирующий эффект оценивали по числу животных с указанными проявлениями аллергической реакции.
Кожные тесты in vivo дополнялись лабораторными тестами оценки сенсибилизации, выбор которых основывался на возможности определения аллергических реакций немедленного и замедленного типов invitro при инкубации тест-аллергена с клетками крови [7]. Состояние повышенной чувствительности замедленного типа выявляли в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) [8], иммунокомплексные - в реакциях специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) [9] и специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) [10]. В качестве тест-аллергена использовали модифицированный дихлордиэтилсульфи-дом и немодифицированный КСА в конечной концентрации 2,5 мкг/мл.
Сенсибилизирующее действие дихлордиэтилсульфида оценивали в опытах на морских свинках. Основной группе из 12 животных сенсибилизацию проводили 0,1% водно-спиртовым раствором дихлордиэтилсульфида в дозе 0,33 мкг/кг в объеме 0,1 мл подкожно в разные участки тела 12 раз с интервалом 7 - 10 суток. Морским свинкам контрольных групп (8 животных в каждой) в эти сроки вводили аналогичные объемы спиртово-водного и физиологического солевого раствора. Выраженность аллергических реакций оценивали через 5 и 10 суток после трех сенсибилизирующих введений и завершения сенсибилизации по тестам РТМЛ, РСЛЛ, РСАЛ. В качестве тест-аллергена использовали свежеприготовленную сыворотку морских свинок, инкубированную in vitro с дихлордиэтилсульфидом в конечной концентрации 2,5 мкг/мл при температуре 370С в течение 1 ч [11].
Экспериментальный материал обрабатывали методами вариационной статистики. Различия значений считали достоверными при р < 0,05.
Результаты и обсуждение. Исследования показали, что у всех кроликов через 10 суток после завершения сенсибилизации алкилированным КСА выявлялись положительные кожные пробы различной интенсивности на специфический тест-аллерген. Частота положительных реакций на разрешающую инъекцию модифицированного КСА составляла 50%, слабо- и сильно положительных - соответственно по 25%. В ответ на внутрикожное введение контрольного тест-аллергена («немодифицированный» КСА) у 75% сенсибилизированных кроликов кожная реакция не развивалась. У 25% животных отмечены сомнительные реакции. Кожные проявления регистрировались не ранее 24 - 48 ч после введения разрешающей дозы тест-аллергена, что свидетельствует о развитии у кроликов, сенсибилизированных «модифицированным» КСА, различной выраженности аллергической реакции замедленного типа.
Положительные результаты кожной пробы были подтверждены постановкой РТМЛ. Миграционная активность лейкоцитов периферической крови сенсибилизированных животных существенно усиливалась при добавлении в среду «модифицированного» КСА. Индекс стимуляции миграции лейкоцитов составлял 5,23 ± 0,3, тогда как при инкубации клеток крови с немодифициро-ванным КСА данный показатель не превышал 1,12 ± 0,02 (р <0,05).
Сенсибилизирующее действие «модифицированного» гомологичного альбумина отчетливо проявлялось также в РСЛЛ и РСАЛ. Специфический лизис лейкоцитов достигал 29,9± 4,3%. При инкубации проб крови с немодифи-
цированным КСА, количество лизированных лейкоцитов не превышало 4,03 ± 0,7% (р <0,05). Специфическая агломерация у кроликов опытной группы равнялась 11,3 ± 0,9%, причем наблюдались преимущественно крупные (более 7 лейкоцитов) и среднего размера (5-7 лейкоцитов) агломераты. При использовании немодифицированного КСА в контрольных тестах образование агломератов лейкоцитов не превышало 3,3 ± 0,3% (р <0,05), а их структура была представлена мелкими скоплениями клеток (3-4 лейкоцита).
Таким образом, специфические аллерготесты in vitro позволили выявить у животных сенсибилизацию к модифицированному дихлордиэтилсульфидом белку, проявляющуюся аллергическими реакциями гиперчувствительности замедленного типа и формирования иммунных комплексов. Данное обстоятельство явилось основанием изучения возможности развития сенсибилизации к алкилированным белкам сыворотки крови непосредственно при кратковременном и субхроническом ведении животным дихлордиэтилсульфида в пороговых дозах.
Эксперименты на морских свинках показали, что после трехкратного введения дихлордиэтилсульфида с интервалом 7 суток факт формирования повышенной чувствительности к модифицированной дихлордиэтилсульфидом гомологичной сыворотке крови в аллерготестах РСЛЛ и РСАЛ установить не удалось. Положительные результаты получены только в РТМЛ при тестировании образцов крови через 10 суток после третьей инъекции токсиканта. В этом случае происходило умеренное увеличение индекса миграции лейкоцитов при добавлении в среду инкубации модифицированной дихлордиэтилсульфидом сыворотки морских свинок по сравнению с контролем (1,09 ± 0,2 до 1,98 ± 0,3; р < 0,05).
Отчетливые признаки сенсибилизации к дихлордиэтилсульфидувыявлены в аллерготестах при субхроническом введении этого токсиканта(12 инъекций с интервалом в 7-10 суток). В частности, наблюдалась стимуляция миграции лейкоцитов в ответ на инкубацию проб крови с модифицированной сывороткой. На протяжении всех сроков наблюдения индекс стимуляции миграции лейкоцитов в тесте РТМЛ превышал значения в контроле (инкубация с немодифици-рованной сывороткой) в среднем в 3,1 - 3,4 раза (р < 0,05).
Субхроническое введение морским свинкам дихлордиэтилсульфида приводило к формированию гиперчувствительности, характеризующейся также более интенсивными, по сравнению с контролем, реакциями специфического
лизиса и агломерации лейкоцитов. Количество лизированных лейкоцитов в РСЛЛ при инкубации крови животных с сывороткой крови, модифицированной токсикантом, возрастало по сравнению с контрольным тест-аллергеном с 3,8 -3,9% до 15-17% (р < 0,05). Содержание агломерированных лейкоцитов в РСАЛ увеличивалось с 2,2% до 8,7 - 9,9% (р < 0,05) с преобладанием средних и крупных агломератов.
Таким образом, эксперименты на морских свинках позволили установить возможность формирования аллергических реакций замедленного и немедленного типов к дихлордиэтилсульфиду в условиях субхронического воздействия. Сопоставительный анализ сенсибилизирующего эффекта модифицированного дихлордиэтилсульфидом гомологичного альбумина и самого токсикантана чувствительных животных показал сходные типы развития иммунопатологических реакций, ассоциированных с алкилирующим действием этого вещества и образованием устойчивых аддуктов с белками крови. Наиболее вероятным исходом сенсибилизации организма при субхронической (хронической) интоксикации дихлордиэтилсульфидом является формирование гиперчувствительности замедленного типа и системное образование иммунных комплексов, что имеет прогностическое значение в аспекте риска развития аллергических и аутоиммунных реакций. Лимфоцитарная инфильтрация селезенки, лимфатических узлов, экспрессия в них провоспалительных цитокинов (ТНФ-альфа, ИФН-гамма) и хемокинов (ИЛ-8) недавно показана в опытах на морских свинках при супер-кутанном воздействии дихлордиэтилсульфида[12].
В качестве достаточно информативных и доступных тестов, характеризующих иммунокомплексные реакции гиперчувствительности, вполне могут рассматриваться реакции специфического лизиса и агломерации лейкоцитов. Тестом, характеризующим реакции гиперчувствительности замедленного типа, - реакция торможения (стимуляции) миграции лейкоцитов. Данные тесты универсальны, не требуют трудоемкой подготовки и могут быть воспроизведены как в эксперименте на животных, так и у людей. Отличительной их особенностью является также возможность использования в качестве тест-аллергенов продуктов взаимодействия дихлордиэтилсульфида с белками крови, что значительно повышает специфичность метода для выявления факта профессиональной интоксикации.
Выводы.
1. Гомологичный сывороточный альбумин, модифицированный дихлор-диэтилсульфидом, при трехкратном парентеральном введении кроликам с интервалом 7 суток вызывает развитие повышенной чувствительности замедленного и иммуномплексного типов, определяемых кожной пробой и аллерготе-стами in vitro с алкилированным альбумином.
2. Субхроническое (в течение 3 месяцев) подкожное введение морским свинкам дихлордиэтилсульфида приводит к формированию гиперчувствительности, выявляемой при инкубации проб крови с раствором алкилирован-ной дихлордиэтилсульфидом гомологичной сыворотки крови, что свидетельствует о возможности развития аллергических реакций организма при длительном воздействии дихлордиэтилсульфида в низких дозах. В условиях подострой интоксикации морских свинок сенсибилизирующее действие дихлордиэтил-сульфида в аллерготестах in vitro, характеризующих развитие реакций иммунных комплексов, не выявляется.
Литературa:
1.Алексеева, О. Г. Аллергия к промышленным химическим соединениям / О.Г.Алексеева, Л.А.Дуева. - М.: Медицина, 1978. - 272 с.
2. Частная аллергология. Т 2; под ред. Г.Б. Федосеева. - СПб.: «Нордмед-Издат», 2001. - 464 с.
3. Петров, Р.В. Иммуногенетика и искусственные антигены /Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, Р.И. Атауллаханов.- М.: Медицина, 1983. - 256 с.
4. Ковалев, И. Е. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям /И.Е.Ковалев, О.Ю. Полевая.М.: Наука, 1985.-304 с.
5. Yeo, T.-H.Development of a Liquid Chromatography-Multiple Reaction Monitoring Procedure for Concurrent Verification of Exposure to Different Forms of Mustard Agents / T.-H.Yeo, H M.-L.W.-K.Loke// J. Anal. Toxicol.- 2008.- Vol. 32, № 1.- P. 51-56.
6. Noort, D.Alkylation of Human Serum Albumin by Sulfur Mustard in vitro and in vivo: Mass Spectrometric Analysis of a Cysteine Adduct as a Sensitive Bio-marker of Exposure / D.Noort, A.G.Hulst, L.P.A.De Jong, H.P. Ben-Schop// Chem. Res. Toxicol. - 1999. -Vol. 12, № 8.-P. 715-721.
7. Луйк,А.И.Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов /А.И. Луйк,
В. Д. Лукьянчук. М.: Медицина, 1984. - 224 с.
8. Методические рекомендации по проведению иммунологических исследований (методы оценки Т- и В-систем иммунитета)/ В.Г. Морозов, В.Х. Ха-винсон. - Л., ВМА. - 1980. - 43 с.
9. Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы: МУ 1.1.578-96. М., 1997.
10. Фрадкин, В.А. Аллергодиагностика in vitro / В.А. Фрадкин.- М.: Медицина, 1975. - 144 с.
11. Краснов, И. А. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии / И. А.Краснов, Е. П. Подольская, Н. В. Гончаров // Научное приборостроение, 2008. - Т. 18, № 4.- С. 46 - 53.
12.Mishra N. C. Sulfurmustard induces immune sensitization in hairless gui-neapigs / N. C. Mishra, J. Rir-sima-ah, T. Marchetal. // Int. Immunopharmacol. -2010. - Vol. 10, № 2.-P. 193-199.
Ключевые слова: профессиональные аллергозы, дихлордиэтилсульфид, алкили-рованный альбумин, сенсибилизация, гиперчувствительность. Keywords: occupational allergies, dichlorodiethyl, alkylated albumin, sensitization, hypersensitivity.
