CC BY
107
УДК 637.52/055:636.086(577.213.3)
Назар Б. I., к. вет. н © E-mail: [email protected]
Державный науково-досл1дний контрольный incmumym ветеринарных npenapamie та кормовых добавок, м. Льв1в, Украгна
ОЦ1НКА МЕТОД1В ВИД1ЛЕННЯ ДНК 13 БЮЛОГ1ЧНОГО МАТЕР1АЛУ
У cmammi наведено основт методичт nidxodu та крытерИ' щодо екстракцИ' й очыщення ДНК iз б1олог1чного матер1алу для анал1зу методом пол1меразно-ланцюговог реакцИ'. Опысано метод видтення ДНК гз выкорыстанням протегнази К котрый дозволяе отрыматы ДНК без домШки бтюв, однак е довол1 трудом1сткым та складаетъся з дектькох emanie. А також метод выдыення ДНК з выкорыстанням л1зуючых буфер1в, у якых е сильт хаотропт агенты, а саме гуамдынт1оцыанат, якый выкорыстовуетъся за досл1дження незначных ктькостей ДНК. Остантй метод е зручным, технолог1чным, проте widoei KrnbKOcmi zvamduHmiouuaHamv можуть inzi6veamu реакит aMmiAimuii. Высока чутлыв1сть ПЛР-анал1зу eucveae жорстю вымогы до Memodie екстракиИ' й очышення ИНК iз б1оматео1алу. через ые выныкае необх1дмстъ Шдыв1дуалъно добирати eidnoeidny методыку, залежно eid досл1джуваного об'екту i його початкового стану.
УДК 637.52/055:636.086(577.213.3)
Назаю Б. И., к. вет. н.
Государственный научно-ысследователъскый контрольный ынстытут ветерынарных препаратов ы кормовых добавок, г. Львов, Украына
ОЦЕНКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК НЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА
В статье приведены основные методыческые подходы ы крытерыы экстракыыы ы очысткы ДНК ыз быологыческого материала для анализа методом полымеразной ыепной реакыыы. Опысано метод выделения ДНК с использованием протеиназы К позволяющий получить ДНК без примеси белков, однако он довольно трудоемкий и состоит из нескольких этапов. А также метод выделения ДНК с использованием лизуючих буферов в которых есть сильные хаотропные агенты, а именно гуанидинтиоиианат, используемый при исследовании незначительных количеств ДНК. Последний метод является удобным, технологичным, однако следовые количества гуанидинтиоиианата могут ингибировать реакиию амплификаиии. Высокая чувствительность ПНР-анализа выдвигает жесткие требования к методам экстракиии и очистки ДНК из биоматериала, поэтому возникает необходимость индивидуально подбирать соответствующую методику, в зависимости от исследуемого объекта и его исходного состояния.
UDC 637.52/055:636.086(577.213.3)
Nazar B. I.
State Scientific-Research Control Institute of Veterinary Medical Products
and Fodder Additives
ESTIMATION OF METHODS OF DNA SELECTION FROM BIOLOGICAL
MATERIAL
In the article basic methodical approaches and criteria are shown in relation to extraction and cleaning of DNA from biological material for an analysis by a method of
©НазарБ. I., 2015
133
volvmerase-chained reaction. The method of DNA selection is described with the use of K-Droteinase. that allows to receive DNA without the admixture of proteins, however is sufficiently labor intensive process and consists of a few stages. Also a method of DNA selection with the use of lvsis buffers that consists of strong chaotrovic agents. namelv. that is used for research of negligible quantities of DNA. The last method is comfortable and technological however the track amounts of guanidintiocianate can inhibit reaction of amplification. The high sensitiveness of PCR-analvsis vulls out hard reauirements to the methods of extraction and cleaning of DNA from biomaterial. because of what there is a necessity to individually gather additionally corresponding methodology, depending on the investigated object and its initial state.
Проводячи видову щентифшащю м'яса, м'ясно! продукци, ix похщних у сухих та консервованих кормах для м'ясощних тварин, а також наявшсть-вщсутшсть генетично модифшованих оргашзм1в у рослиннш продукци, висока яюсть розчину видшено! ДНК впливае на яюсть продукпв ампл1ф1кацп, забезпечуе здобуття в1ропдшших i збалансованих результата, незалежно вщ методу анал1зу, що використовуеться.
Метою наших дослщжень було дати пор1вняльну оцшку р1зних метод1в видшення ДНК i3 отриманням високо! якосп та максимально можливого виходу ДНК, враховуючи юльюсть, вид та стан матер1алу, що дослщжувався (терм1чну обробку чи довготривале заморожування продукци) та усунути вплив iHri6iTopiB.
В основу метод1в видшення покладено загальний принцип екстракцп, який полягае в руйнуванш плазматично! i ядерно! мембран кттин, звшьненш вщ бшюв, видаленш або нейтрал1зацп кттинних компонента i домшок, з метою отримання ДНК, придатно! для ампл1ф1кацп у пол1меразно-ланцюговш реакцп (ПЛР). Методики умовно можна роздшити на юлька груп, кожна з яких об'еднуе методи, що передбачають застосування р1зних вар1анта депроте!шзаци (отримання ДНК, очищено! вщ бшюв).
До першо! групи належать методи, засноваш на використанш л1зуючих буфер1в, до складу яких входять aHioHHi або неюнш детергенти (додецилсульфат натрда, тритон Х-100), а також протеол1тичний ензим протешаза К, що спричинюють швидку денатуращю бшюв й шактиващю нуклеаз. Остаточна депроте!шзащя проводиться сумшшю хлороформу й ¿зоамшового спирту; осадження ДНК ¿з розчину здшснюеться ¿зопропанолом або етанолом.
До друго! групи належать методи, основою л1зуючих буфер1в яких е сильш хаотропн1 агенти (гуанщинтюцюнат, сечовина), що руйнують кттинш мембрани i денатурують кттинш бшки. 1з розчину ДНК осщае на нуклеосорбент, з подальшим !! елююванням.
До третьо! групи належать методи, засноваш на використанш анюнообмшно! смоли Челекс-100. Процедура видшення ДНК мютить тривалу шкубащю i кип'ятшня об'екта, що дослщжуеться в розчиш Челекс-100, та забезпечуе очищения вщ металовмюних сполук i проте!шв. Метод не пов'язаний ¿з великими витратами часу, використанням агресивних речовин. Видшення ДНК здшснюеться в однш npo6ip4i, що знижуе ризик забруднення зразюв.
До четверто! групи належать методи, засноваш на властивостях деяких солей у високих концентращях утворювати комплекси ¿з бшками i полюахаридами. Наприклад, за використання у л1зуючому буфер! анюнного детергенту додецилсульфату натрда i протеол1тичного ензиму проте!нази К вщбуваеться денатуращя бшюв, внаслщок чого руйнуються мембрани кттин i ДНК виходить у розчин. Бшки i частина полюахарид1в теля додавання до л1зату ацетату калда за температури 0 °С утворюють комплекси ¿з додецилацетатом калда i видаляються
134
центрифугуванням; ДНК i3 розчину осаджуеться ¿зопропанолом. Метод дозволяе провести депротешзащю без оргашчнихрозчинниюв.
Встановлення кшькосп видшено! ДНК проводиться для оптим1заци концентрацп ДНК, яка вноситься у ПЛР. Ампл1ф1кащя мшросателпних локус1в, як правило, здшснюеться при значениях концентрацп ДНК у д1апазонах вщ 0,5 до 2,0 нг, внесения незбалансовано! кшькосп ДНК у реакщю призводить до зниження И чутливосп i неотримання неспециф1чних продукпв, або до ix повно! вщсутносп. Для встановлення кшькосп видалено! ДНК у розчиш широко використовуються три методи. Найбшьш простим i точним е спектрофотометричний метод, однак вш мае дуже малу чутливють. Концентращю ДНК експертних об'екпв i3 низьким ум1стом ДНК часпше встановлюють за штенсивнютю флюоресценцп И комплексе з бромистим етид1ем або Hoechst 33258 з допомогою флюорометр1в. Концентрашю видшено! ДНК у розчиш визначають за допомогою ДНК-флюориметра. У наявносп ДНК у бю-бензимщу (барвник Hoechst 33258 або бромистий етидш) змшюються параметри флюоресценцп, штенсившсть яко! пропорцшна концентрацп ДНК. 1нтеркалюючий барвник Hoechst 33258 або бромистий етидш специф1чно взаемод1е, зв'язуючись тшьки з дволанцюговою ДНК, що дозволяе коректно вим1рювати концентращю ДНК у присутносп бшкових i РНК-контамшант1в.
Матер1али i методи. Для пор1вняльно! оцшки метод1в видшення нами було використано два методичних шдходи — це видшення ДНК i3 використанням протешази К та видшення ДНК з використанням л1зуючих буфер1в, у склад1 яких е сильш хаотропн1 агенти (гуашдинтюцюнат).
В основ! першого методу лежить л1зис клпин додецилсульфатом натрда (SDS) i деградащя бшюв протешазою К. Клпинний л1зат очищують оргашчними розчинниками, ДНК висаджували холодним спиртом i3 подальшим розчиненням в ТЕ(Трис-ЕДТА) буферг У 1,5-мл м1кро-центрифужнш проб1рц1 розмщають подр1бнений бюматер1ал, 100-200 мкл рщко! кров1, додають 300-600 мкл л1зуючого буферу TENS, до складу якого входить 10 мМ Трис-HCl, 5мМ Na2E,flTA, 0,1М NaCl, 2 % SDS. Додають 2-8мкл (до kIctok i внутр1шшх оргашв 10-25 мкл) водного розчину протешази К (20 мг/мл), умют проб1рки перемшують. Зразок шкубують за температури 56 °С протягом вщ 1-2 год. до 24-48 год. (для юсток, внутршшх оргашв). Пюля довготривало! шкубацп в проб1рку додають дробино по 10-25 мкл розчину протешази К (20 мг/мл). Предмет-носш видаляють, перемютивши в чисту проб1рку та максимально вщбравши з нього залишки розчину. Пюля дослщження твердого бюматер1алу в чисту проб1рку переносять надосадову рщину. Додають 1/5 (2/5 для KicTOK, внутр1шн1х оргашв) частину вщ загального об'ему 3М ацетату амошю або ацетату кал1ю та помщають на кшька хвилин в холод. Центрифугують 5хв. при 10 тис. об/хв. Супернатант вщбирають у чисту проб1рку. Екстракщю та очистку ДНК проводять двома шляхами: 1) До надосадово! рщини додають р1вний об'ем хлороформу (або cyMimi хлороформ-1зоамшового спирту 24:1). Акуратно перемшують протягом 3-5 хвилин. Центрифугують 20 хв. за max об/хв. Верхню водну фазу акуратно вщбирають у нову проб1рку, додають 2,5 об'ему 96° етилового спирту. 2) До надосадово! рщини додають р1вний об'ем ¿зопропшового спирту. Пюля процедури 1 або 2 проб1рку помщають у морозильну камеру на 1-18 год., центрифугують 15-30 хв. за max об/хв. Супернатант видаляють декантуванням. Осад просушують, промивають 200-500 мкл 75° етилового спирту (перевертаючи в руках), центрифугують 5 хв. при max об/хв. Супернатант видаляють декантуванням, осад просушують на фшьтрувальному nanepi (можна шдсушити в
135
термостат! при 56 °С) та додають до нього 60-120 мкл ТЕ-буферу, перемшують. Для кращого розчинення можна розмютити проб1рки в термостат за температури 56 °С на 5—10 хв. Зразок зберк-ають за 4 °С. Для тривалого збер1гання зразок заморожують.
Друга методика використовуеться за наявносп незначних кшькостей ДНК, забрудненш, вплив1 предмету-нос1я. Процедура видшення ДНК складаеться ¿з еташв руйнування кттин за допомогою л1зуючого буферу, що мютить гуанщинтющанат, подальшо! екстракцп ДНК на сорбент SiO2 та и елюацп в TE-буфер теля нагр1вання. У 1,5-мл мшро-центрифужнш проб1рщ розмщають подр1бнений Marepiar, додають 300-600 мкл л1зуючого буферу, до складу якого входить 10М гуанщинтющанат, 0,1М трис-HCl, 0,2М Na2E,flTA, 2,6 % тритон X-100, перемшують на вортекс1 3-5 сек. Розмщують у термостат! на 10 хв. за температури 65 °С . Предмет-носш видаляють, перем!стивши в чисту проб1рку та максимально вщбравши з нього залишки розчину. Пюля дослщження твердого бюматер1алу в чисту проб1рку переносять надосадову рщину. Сорбент ретельно перемшують на вортекс1 та додають 30-40 мкл у проб1рку з л1затом. Протягом 10 хв. проб1рку перемшують. Центрифугують 15 сек. при 7 тис. об/хв. Супернатант видаляють повшстю та додають 300 мкл вщмиваючого розчину, що мютить 10М гуанщинтющанат, 0,1М трис-HCl, ретельно перемшують на вортекс1, центрифугують 15 сек. при 7 тис. об/хв. Супернатант видаляють повшстю та додають 700 мкл етанолу, ретельно перемшують на вортекс1, центрифугують 15 сек. за 7 тис. об/хв. Супернатант видаляють, додають 700 мкл ацетону, ретельно перемшують на вортекс1, центрифугують 15 сек. за 7 тис. об/хв. Супернатант видаляють повшстю. Вщкрит1 проб1рки розмщують у термостат! за температури 65 °С до повного висихання (осад повинен трюнути). До осаду додають 70-100 мкл ТЕ-буферу, перемшують на вортекс1, розмщують у термостат! за температури 65 °С 5-10 хв. Центрифугують 1 хв. за 7 тис. об/хв. Пюля повторного використання елюату повторюють струшування i центрифугування. Для тривалого збертанш надосадову рщину вщбирають у чисту проб1рку i збертають у морозильнш камер1 (мшус 20 °С).
Вим1рювання концентрацп видшено! ДНК двома методами встановлювали за допомогою флуориметра за штенсивнютю флуоресценцп И комплекшв з бромистим етид1ем.
Пюля вим1рювання концентрацп ДНК були використаш таю розчини :
1. РозчинТЕ (1 мМ Na3EflTA; 10 мМ трис-HCl; рНсередовища - 8,0).
2. Розчин ДНК ¿з вщомою концентращею (контрольна високомолекулярна ДНК ¿з концентращею 10 нг/мл).
3. х TNE буфер (100 мМ трис-HCl; pH 7,4; 10 мМ №3ЕДГА; pH 8,0; 1 М
NaCl).
4. Водний розчин 10 мг/мл штеркалюювального барвника Hoechst 33258.
Флуориметр вмикали за 15 хв. до вим1рювання. Катбрували вщносно зразка
контрольно! ДНК i3 вщомою концентращею в 1xTNE буфер1 за наявносп 10 мг/мл бромистого етид1ею Вим1рювали концентращю одержаних препарата ДНК в IxTNE за наявносп 10 мг/мл бромистого етид1ю.
Отримаш результати.
Методи видшення ДНК ¿з використанням протешази К дозволяють одержати ДНК без домшки бшюв. Однак, вони довол1 праце-мютю, складаються ¿з деюлькох еташв.
136
Методи видшення ДНК Í3 викооистанням л1зуючих 6v4eoÍB v яких е сильш хаотоопш агенти (гуаншинтюшонат) викооистовуеться за незначних кшькостей ДНК. 3ÜV4HÍ. технолопчш, ототе слшов1 кшькосп гуанщинтюшонату можугь шпбувати оеакшю aMnniÜKauii. Внаслшок багатоетапносп noonecv пшвишуеться ймов1ршсть значних втпат ПНК. а також можливють контамшаип 1шж ппобами.
Висновки. Висока чугливють ПЛР-анал1зу висувае жоостю вимоги до метод1в екстоакпп й очишення ДНК Í3 бюматео1алу, чеоез ие виникае необхшшсть шдившуально добиоати в1диов1дну методику. залежно в1д досл1джуваного об'екту i його иочаткового стану.
Л1тература
1. Каверин В. А. Совершенствование методов идентификации примесей ГМО в продуктах. содержащих компоненты животного и растительного происхождения : автореф. дис. на здобуття наук. ст. канд. биол. наук / А. В. Каверин. - М., 2006. -25 с.
2. Симоненко С. В. Контроль за содержанием генно-модифицированных источников (ГМИ) в продуктах детского питания / С. В. Симоненко, С. В. Фелик, Т. А. Антипова // Современные технологии производства и переработки сельскохозяйственного сырья для создания конкурентоспособности пищевых продуктов / Волгогр. науч.-исслед. технол. ин-т мясо-молоч. скотоводства и переработки продукции животноводства. - Волгоград, 2007. - Ч. 1. - С. 52-54.
3. Van Hal N. L., Vorst O., Van Houwelingen A. M., Kok E. J., Peijnenburg A., Aharoni A., Van Tunen A. J., Keijer J. The application of DNA microarrays in gene expression analysis // Journal of Biotechnology. - 2000. - 78. - P. 271-280.
Стаття надшшла доредакци 11.03.2015
УДК 636.4:591.11
Огородник Н. 3., к.вет.н., ст. наук. сшвр.
E-mail: [email protected] Вщур О. I., д.вет.н., професор, Кичун I. В., к.б.н., ст. наук. сшвр. © 1нститут 6ionozii теарин НААН, м. Льв1в, Украгна
КЛ1ТИНН1Й ГУМОРАЛЬШ ФАКТОРИ НЕСПЕЦИФ1ЧН01 РЕЗИСТЕНТНОСТ1 ПОРОСЯТ ЗА ВПЛИВУ ПРЕПАРАТУ «BITAPMIH»
В1длучення поросят eid свиноматок супроеоджуетъся посиленням процеав пероксидного окиснення ninidie, зниженням неспециф1чног резистентностi й тдвищенням ix сприйнятливост1 до захеорюеанъ. BidoMO, що втамти та мтералът елементи здатт тдвищувати сттюстъ теарин, а введения ix у лтосомалънт форм! дозволило б icmomno збыъшити íxhw ефективмстъ.
У зв 'язку Í3 цим, було досл1джено динам1ку змт показниюв неспециф1чног резистентностi у поросят при в^длучент, а також за dii комплексного лтосомалъного препарату «Втармт». Встановлено, що наявм у складi препарату компоненти — жиророзчинш втамти A, D3, Е, Ь-аргтт, Цинк, Селен, Кобальт i Магтй, позитивно впливаютъ на rnimuHHi та гуморалъм фактори захисту в opzani3MÍ поросят теля в1длучення eid свиноматок. Так, на 10-ту добу теля в1длученняу поросят досл1дног групи виявлено зниження фагоцитарног активност1 нейтрофшв Kpoei та зростання комплементарно! активност1 сироватки Kpoei, а також тенденц1ю до зниження впродовж досл1джень eMicmy загалъних ¡муноглобултв i бактерицидно! активност1 сироватки Kpoei. Показано, що парентералъне введения поросятам перед в1длучениям eid свиноматок препарату «BimapMiH» сприяе eipoziduoMy тдвищенню фагоцитарно! aKmuenocmi нейтрофшв Kpoei на 5-ту добу теля вiдлyчeння, a eMicmy загалъних iмyнoглoбyлiнiв та лiзoцuмнo! aKmuenocmi сироватки Kpoei — на 1-шу добу теля eiдлyчeння. При цъому
© Огородник Н. 3., Вщур О. I., Кичун I. В., 2015
137
