CC BY
25
УДК 630* 165.6 Доц. Р. Т. Гут, канд. бюл. наук;
1НЖ. Ю.В. Вербовицька - НЛТУ УкраХни
ПОР1ВНЯЛЬНИЙ АНАЛ1З Р1ЗНИХ МЕТОД1В ВИД1ЛЕННЯ ДНК З ХВО1 СОСНИ ЗВИЧАЙНО1 (PINUS SYLVESTRIS L.)
Наведено результати nopiB^Hra pi3HHx методiв видiлення ДНК на 0CH0Bi спектро-фотометричного, pестpикцiйнoгo аналiзу та методу ПЛР i3 застосуванням ISSR -пpаймеpiв, що використовуються пiд час вивчення генетичного пoлiмopфiзму у рослин.
Ключов1 слова: гетерозиготшсть, пoлiмopфiзм, ПЛР, праймери, мoлекуляpнi маркери, секвенування, клонування.
Doc. R.T. Gout; eng. Y.V. Verbovytska-NUFWTof Ukraine
The comparative analyses of DNA extraction methods from needles of Scots Pine (Pinus Sylvestris L.)
The results of DNA extraction analyses from needles of Scots pine by different methods are presented. These methods were used from nucleotide polymorphism.
Keywords: heterozygosity, polymorphism, PCR, primers, molecular markers, sequencing, cloning.
Висока генетична пол1морфшсть деревних рослин, велика вар1абель-шсть вплив1в середовища на генотип зумовлюють значну внутршньовидову мшливють, тому основною метою лшвниюв на даному еташ мае бути не тшьки створення мш1мальних умов для виживання деревних порщ, але й збе-реження популяцш з генетичним р1зномашттям, яке б забезпечило ix вижи-вання у стресових умовах навколишнього середовища.
Поряд з традицшним селекцшним напрямком вщбору дерев за фенотипом, для виршення генетико-селекцшних проблем широкого використан-ня набувають молекулярно-генетичш методи. Велике значення мае вивчення гетерозиготност та анашз пол1морф1зму ДНК, що дае змогу виявити м1ж- та внутршньовидову мшливють. Високий р1вень пол1морф1зму виявлений шд час вивчення невщомих локушв. Для цього використовуються ISSR-прайме-ри з випадковою нуклеотидною послщовшстю, як сконструйоваш на основ1 простих внутр1шшх повтор1в нуклеотидних послщовностей геному [4, 5]. За шформащею про ix мшливють геному можна визначити генетичш вщдаш м1ж дослщжуваними видами, формами та встановити фшогенетичний зв'язок. Отже, молекулярно-генетичш методи дають змогу швидше i надштше щен-тифжувати генотипи та дають змогу ефектившше проводити генетичну оцш-ку популяцш.
Високомолекулярна ДНК необхщна для отримання геномних б1бль отек, щентифшаци та видшення гешв у процес генно-шженерних маншуля-цш, а також для вивчення оргашзаци та експресп гешв [3]. Методи видшення ДНК та ii анашзу служать невщ'емною частиною багатьох молекулярно-гене-тичних дослщжень деревних рослин.
Метою нашoi роботи було провести пор1вняльний анал1з р1зних мето-д1в видшення ДНК з xвoi сосни i вщбрати серед них такий, який би забезпе-чив отримання добре очищених препарат1в ДНК з достатньо довгими молекулами i з невеликими затратами часу та кошт1в.
Матер1али та методи
Об'ектом дослiдження слугувала сосна звичайна (Pinus sylvestris L.). MaTepianoM для видiлення сумарно1 ДНК була свiжа хвоя сосни. Сумарну ДНК видшяли з використанням таких комерцшних нaбopiв фipми DNeasy plant mini kit "Qiagen" та Nucleón PhytoPure plant DNA extraction kit "Nucleón Bioscience", а також модифжованим методом Делапорта [3], СТАВ-методом Дж. Дойла [1, 2].
Модифжований метод Делапорта
100 млг хво! пoдpiбнювaли в рщкому aзoтi, додаючи для зв'язування пoлiфeнoлiв 5-6 %-й Polyclar AT ("Serva" Нiмeччинa), а також буфер, який тетив 0,1 М трис-HCl з рН 8,2; 0,05 М EDTA ("Sigma" США); 0,15 М NaCl; 0,1 М аскорбшову кислоту, 5 %-у пapaaмiнoсaлiцилoву кислоту ("Sigma"), 1 % ß-меркаптоетанол ("Ferak" Нiмeччинa); 1 0%-й дieтилдитioкapбoмaт та 23 % SDS ("Sigma").
Одержану гомогенну суспензда пiсля 15-хвилинно! шкубаци на водя-нiй баш при 65 °С центрифугували протягом 20 хв. при 4000 об./хв. Надоса-дову рщину депроте1шзували сумшшю фенол-хлороформ (1:1) протягом 10 хв. i центрифугували за тих самих умов. Нуклelнoвi кислоти осаджували 0,7-1 об'емами iзoпpoпaнoлу (попередньо охолодженого до -20 °С) протягом 30 хв. при -20 °С. Осад нуклешових кислот тpичi промивали 70 %-им етано-лом та розчиняли у ТЕ-буфер^ що мiстить 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) та 1 мМ EDTA. У розчин вносили 100мкг мл РНКази А ("Qiagen") та 0,5 М NaCl. 1н-кубaцiю проводили при 37 °С впродовж одше1 години в термостать Депроте-1тзащю здiйснювaли сумiшшю фенол-хлороформ (1:1), до яко! вносили SDS та ацетат калш ("Sigma") до кшцево1 концентраци 1,1 % та 1,2 М вщповщно. Сумiш шкубували у льoдoвiй бaнi впродовж 30 хв. при 0 °С, а по^м центрифугували 5 хв. при 10000 об./хв. ДНК осаджували iзoпpoпaнoлoм, промивали тpичi 70 %-им етанолом та розчиняли у ТЕ-буферь
СТАВ-метод Дж. Дойла
Розтертий рослинний мaтepiaл додавали до буфера, що мютить 0,1 М трис-HCl з рН 8,0; 0,02 М EDTA ("Sigma"); 1,5 М NaCl; 0,005 М аскорбшову кислоту ("Sigma"), 1 %/о-й меркаптоетанол ("Ferak"); 0,004 M дieтилдитioкap-бомат ("Sigma"), PVP 40 ("Loba" Австpiя) та бромщ цетилтриметиламонш (CTAB) по 2 % та протешазу К 1 млг/мл ("Sigma"). Гомогенну сумш шкубували на водянш баш при 65 °С, центрифугували протягом 30 хв. при 4000 об./хв. Бшки двiчi осаджували сумшшю хлороформ^зоамшового спирту (24:1) протягом 10 хв.. Центрифугували сумш при 13000 об./хв. впродовж 20 хв. Нуклelнoвi кислоти осаджували 0,7-1 об'емами iзoпpoпaнoлу (попередньо охолодженого до -20 °С) протягом 30 хв. при -20 °С. Осад нуклешо-вих кислот тpичi промивали 70 %-им етанолом та розчиняли у ТЕ-буфер^ що мктить 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) та 1 мМ EDTA. Для очищення ДНК вщ РНК у розчин вносили 100мкг/мл РНКази А ("Qiagen"). Депроте1шзащю здшсню-вали сумiшшю фенол-хлороформ (1:1).
Спектрофотометричний аналгз зразк\в ДНК
Яюсть препарат1в ДНК визначали за показниками oптичнoi густини (А) та концентращею на спектрофотометр! Biotech Photometer UV1101/1101T "Biochrom". Вщношення А260/А280 становило 1,7-2,0. Середня молекулярна маса дор1внювала приблизно 20000-25000 пар нуклеотид1в.
Препарати ДНК г1дрол1зували рестриктазами другого класу EcoRI i BamHIII ("Fermentas" Литва). На 1 мкг ДНК припадало 4-10 МО активност рестриктаз. 1нкубацш проводили у вщповщних буферах ("Fermentas") протя-гом 2 годин при 37 °С. Реакщю pестpикцii зупиняли заморожуванням.
Електрофорез тотально!' ДНК здiйснювали у 0,8 %-ному агарозному гелi, а ПЛР продукпв фpакцioнували у 1,7 %-ному агарозному гел! та вико-ристовували 1* ТАЕ-буфер. Агаpoзнi гелi профарбовували бромистим ети-дiем ("Sigma") та фотографували цифровою камерою Samsung 340.
Полгмеразна ланцюговареакцгя (ПЛР)
Для амплiфiкацii застосовувалися такi реактиви ф!рми "Fermentas" (Литва): dNTP mix 2 мМ, MgCl2 25 мМ, 10 x PCR buffer, Taq-DNApolymerase, праймери CR-214, CR-213 "Sigma".
Амплiфiкацiю сумаpнoi ДНК з даними праймерами проводили за таких умов: dNTP mix 0,2 мМ, MgCl2 2,0 мМ, 1 x PCR buffer, Taq-DNApolyme-rasе 0,13 од., праймера 1 мкМ, ДНК 20 нг у кшцевому oб,емi 20 мкл. Програ-ма для амплiфiкацii: первинна денатуращя - 5 хв. при 95 °С; 30 цикшв у режима денатуpацiя 94 °С - 1 хв., вщжиг - вщ 34 до 51 °С - 1хв., елoнгацiя -72 °С 1 хв.; oстаннiй цикл елонгацп - 72 °С 10 хв. ус! результати ампл!фжа-ци пеpевipяли тричь
Результати та обговорення
Основоположними методами в чисельних молекулярно-генетичних шдходах, що використовуються тд час вивчення рослинних оргашзм!в i як! визначають усшх дослщжень, е методи видшення ДНК. Розроблено ряд ме-тод!в, щоб забезпечити яюсть, легюсть та ефектившсть видшення i чистоту видшено' сумарно' ДНК.
Видшення ДНК з рослинного матер!алу е складшшим процесом, шж з тканин тварин, оскшьки рослинш екстракти мютять бшьшу кшьюсть полюа-харид!в та тгменпв, вщ яких досить складно очистити ДНК. Деяк полюаха-риди пригшчують актившсть ферменпв, що модифжують ДНК, зокрема фер-менлв рестрикци. 1стотним негативним фактором тд час видшення ДНК е руйнування китинних стшок. Багато метод!в, як! використовують для одер-жання ДНК, призводять до ii фрагментаци.
Основним завданням даного пор!вняльного анал!зу метод!в було знайти найефектившший i водночас недорогий метод видшення ДНК. У таблиц! представлено пор!вняльну характеристику використаних нами метод!в. Комерцшш набори забезпечують високий вихщ ДНК, але у зв'язку з дороговизною 'х доступшсть е обмеженою. СТАВ-метод передбачае використання дорогих реагенпв, зокрема проте'наза К, тому ми зупинились на модифжова-нш метод! Делапорта, оскшьки, цей метод не потребуе використання проте-
1нази К, внесли певнi модифшаци. Оскшьки i у СТАВ-методi i в методi Дела-порта усунення РНК РНКазою А вщбуваеться пiсля стади осадження нукле-1нових кислот, витрати часу на екстракцш ДНК досягають до 2-2,5 годин. Тому в буфер для лiзису ми вносили РНКазу А у концентрацп 100 млг/мл, яка досить ефективно усувае РНК i при 65 °С, що зменшуе затрати часу на екстракцш ДНК. Депроте1шзацш здiйснювали, додаючи ацетат калiю, який ефективно осаджуе комплекси БББ з бiлками та полюахаридами i тим самим виключае застосування фенолу. Оскiльки фенол е дуже токсичним реагентом, застосування його е не бажаним. Наступш стади екстракци ДНК зали-шилися без змiн.
Табл. Порiвняльна характеристика pÍ3Hux Memodie видтення ДНК
Параметры Комерцшт набори СТАВ-метод Метод Делапорта, модифш. Тищенко Метод Де-лапорта, модифш. нами
DNeasy plant mini kit "Qiagen" Nucleon PhytoPure plant DNA extraction kit "Nucleon Bioscience"
Зручтсть методу висока середня середня середня середня
Можлившть використання для велико! к-ст вид1в так Залежить ввд виду рослин Залежить вiд виду рослин Залежить вiд виду рослин Залежить вiд виду рослин
Час отримання зразюв ДНК Близько 1 го-дини 1-2 години 2-3 години 2-3 години 1-2 години
Збернання зразюв ДНК Довготермшо-ве Довготермшо-ве Довготер-мiнове Довготер-мiнове Довготер-мiнове
Яшсть препа-рапв ДНК висока висока середня середня середня
Застосування фенолу m Hi m так m
Використання зразшв ДНК у по-дальшш робота ПЛР, RAPD, AFLP, RFLP аналзи, бло-тинг, мшроса-телiтний аналiз, секвенування ПЛР, RAPD, AFLP, RFLP аналiзи, секве-нування ПЛР, RAPD, AFLP, RFLP ана-лiзи, секвенування ПЛР, RAPD, AFLP, RFLP ана-лiзи, секвенування ПЛР, RAPD, AFLP, RFLP ана-лiзи, секвенування
На рис. 1 представлений електрофорез сумарно! ДНК, видшено! pÍ3H^ ми методами, як видно, вихщ ДНК е досить високим у bcíx випадках.
Рис. 1. Електрофорез сумарноХ ДНК видтеноХ pi3HUMU методами:
1 - сумарна ДНК, видыена DNeasy Plant Mini Kit; 2 - сумарна ДНК, видыена Nucleón Phyto Pure plant mini kit; 3 - сумарна ДНК, видыена СТАВ-методом; 4 - сумарна ДНК, видыена методом Делапорта, модифжованим и я Тищенко; 5 - сумарна ДНК, видыена методом Делапорта, модифжованим нами; М- Gene 2 3 4 5 M Ladder mix
На основi спектрофотометричного аналiзу показано, що концентращя ДНК видiлена iз 100 мг хво! сосни при А2б0, становить вщ 250 мкг/мл до 500 мкг/мл (рис. 2). Як видно з даних, представлених на рис. 2, комерцшш набори забезпечують вихщ ДНК у межах вщ 340 мкг/мл до 500 мкг/мл, а методи Делапорта та СТАВ-метод у межах вщ 280 до 420 мкг/мл. Однак, чистота препара^в ДНК видшено! уЫма зазначеними методами е досить високою 1,8-2,0 (рис. 3) i знаходиться на однаковому рiвнi. Проте максимальнi величи-ни виходу i чистоти ДНК досягаються комерцiйними наборами.
Рис. 2. Концентращя ДНК, видтена pÍ3HUMU методами (див. рис. 1)
90 РЧ
«5 ЧО
РЧ <
2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
методи
Рис. 3. Чистота ДНК (А260 /А280), видтена рЬними методами (див. рис. 1)
2
4
M
Рис. 4. Продукти амnлiфiкацu сумарноК ДНК з праймером CR-213:
1 - продукти ПЛР сумарног ДНК, видыеног
DNeasy plant mini kit; 2 - продукти ПЛР сумарног ДНК, видыеног Nucleón PhytoPure plant DNA extraction kit; 3 - продукти ПЛР сумарног ДНК, видыеног СТАВ методом; 4 - продукти ПЛР сумарног ДНК, видыеног
методом Делапорта, модифжованим Тищенко; 5 - ПЛР продукти сумарног ДНК,
видыеног методом Делапорта, модифжованим нами; M - Gene Ladder mix
1
3
5
Щоб вивчити можливост використання сумарно! ДНК, видшено! pi3-ними методами, ми провели ан^з сумарно! ДНК ендонуклеазами рестрикци другого класу. Як показав анашз, усi зразки ДНК, видшено! рiзними методами, розщеплюються однаково добре.
Для анашзу даних зразюв сумарно! ДНК, видiлено! вказаними вище методами, був використаний метод ПЛР з ISSR-праймерами, що використо-вуються пiд час вивчення генетичного полiморфiзму у рослин. Результати амплiфiкацi! представлен на рис. 4. Як видно з рисунка, продукти ампшфжа-ци е однотипними, !х можна чггко iдентифiкувати.
Висновки. Комерцiйнi набори забезпечують високий вихiд ДНК, але у зв'язку з дороговизною !х доступшсть е обмеженою. А модифiкований нами метод Делапорта забезпечуе швидке, легке та яюсне видiлення ДНК з мшь мальними затратами коштiв. Таким чином, на основi спектрофотометрично-го, рестрикцшного та ПЛP-аналiзу з ISSR-праймерами встановлено, що метод Делапорта, модифжований нами, можна усшшно застосовувати в роботах з вивчення генетичного полiморфiзму у хвойних порщ.
Лггература
1. Doyle J.J. Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue// Phytochem. Bull. - 1987. - Vol. 19, - P. 11-15.
2. Doyle J.J. Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue// Focus. - 1990, № 12. -
P. 13-15.
3. Дрейпер Дж. Скотт Р. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений// Генная инженерия растений: Лаб. руководство: пер. с англ./ Под ред. Дрейпера. - М.: Мир. -1991. - С. 248-252.
4. Fang D.Q. Rose M.L. Identification of closely related citrus cultivar with inter-simple sequences repeat mercers// Theor. Appl. Genet. - 1997. - Vol. 95. - P. 408-417.
5. Arcade A. Anselin F. Faivre Rampant P. Aplication of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese larch// Theor. Appl. Genet. - 2000. - Vol. 100. -P. 299-307.
УДК630*5 Ст. викл. В.М. Куриляк -НЛТУ Украти
ФОРМУВАННЯ СКЛАДУ У Р1ЗНИХ ТИПАХ БУКОВИХ Л1С1В
НА ПРИКАРПАТТ1
Охарактеризовано особливост формування складу насаджень в межах вшових nep^ÏB за останш 50 роюв. Наведено середш формули складу у рiзних групах титв люу i пpоаналiзовано причини, що впливають на 3mï^ складу бучин на Прикарпатп. Ключов1 слова: бук, змша складу, типи люу.
V.M. Kurylyak - NUFWT of Ukraine
Shaping a composition in different types of beech woods in Prykarpattya region
In the article given feature particularities of shaping a composition beech woods within ancient periods for last 50 years. Brought average formulas of composition in different groups of types a wood and analysed reasons, which influence upon changing a composition of beech staunds in Prykarpattya region.
Keywords: beech, changing a composition, types a wood.
