CC BY
40
в 20-25 летнем возрасте (интенсивность изреживания 15-20 %) и в 40-50 лет (интенсивность изреживания не более 15 %). Рубки ухода должны носить, прежде всего, санитарный и селекционный характер.
Литература
1. Парниковый эффект, изменение климата и экосистемы: пер. с англ./ Болин Б., Десс Б.Р., Ягер Дж., Уоррик Р.// Л.: Гидрометеоиздат, 1989. - 560 с.
2. Уткин А.И. Углеродный цикл и лесоводство// Лесоведение. - 1995, № 5. - С. 3-20.
3. Писаренко А.И. Глобальное управление бореальными лесами: целесообразность или неизбежность// Устойчивое развитие бореальных лесов. - М.,1997. - С. 3-16.
4. Brown S. Present and potential roles of forests in the global climate change debate// Unsylva. - 1996. - 47, № 185. - P. 3-10.
5. Кобак К.И., Кукуев Ю.А., Трейфельд Р.Ф. Роль лесов в изменении содержания углерода в атмосфере (на примере Ленинградской обл.). - Лесное хозяйство. - 1999, № 2. -С. 43-45.
6. David Brand The combined challenge of forestry and terrestrial carbon management// XXI IUFRO world congress, 2000. - Kuala-Lumpur. - P. 558-564.
7. Zasada M. The growth model for fir (Abies alba Mill.)// Folia forestalia polonica. - Series A - Forestry. - 1999, № 41. - P. 37-46.
8. Ермаков В.Е., Севастьянов В.Д. Моделирование хода роста чистого соснового древостоя// Лесоведение и лесное хозяйство. - Мн.: Высшая школа. - 1979, вып. 14. - С. 65-69.
9. Никитин А.Н. Имитационная модель накопления углерода древесными компонентами сосновых насаждений искусственного происхождения// Материалы межд. науч. конф. "Мониторинг и оценка состояния растительного покрова". - Минск, 2003. - С. 78-80.
10. Фрей Т.Э.-А. Вопросы и ответы по сводным докладам// Моделирование и контроль производительности древостоев: Тез. Докл. - Каунас: ЛитСХА, 1983. - С. 130-131.
11. Усольцев В.А. Рост и структура фитомассы древостоев. - Новосибирск: Наука, 1988. - 254 с.
УДК 630*165.6 Доц. Р.Т. Гут1, канд. бюл. наук - УкрДЛТУ;
Ю. Новаковська2, канд. наук - НД1ЛГ
ВИКОРИСТАННЯ ГЕН-СПЕЦИФ1ЧНИХ STS-МАРКЕРIВ ДЛЯ ДОСЛ1ДЖЕННЯ ГЕНЕТИЧНОГО ПОЛ1МОРФ1ЗМУ ПОПУЛЯЦ1Й ХВОЙНИХ ВИД1В РОСЛИН3
Ген-специфiчнi БТБ-маркери е новою i перспективною системою молекуляр-них маркерiв, яка базуеться на використанш ПЛР. Ген-специфiчнi маркери мають ряд важливих властивостей, до яких належать кодомшантний характер успадкуван-ня, застосування простих методiв виявлення полiморфiзму та висока вщтворюва-нють результат дослвдв, i тому можуть ефективно використовуватись для ощнки генетичних параметрiв хвойних видiв рослин. У цщ робот висв^лено переваги та недолши використання ген-специфiчних STS-маркерiв порiвняно з шшими системами молекулярних маркерiв, а також описано принципи створення та застосування цих маркерiв.
1 Украшський державний люотехшчний ушверситет, Львiв (Ukrainian State University of Forestry and Wood Technology, Lviv)
2 Науково-дослвдний шститут лкового господарства, (Forest Research Institute, Warszawa)
3 Написания статп стало можливим шд час перебування доцента Укранського державного лiсотехнiчного унiверситету Р. Гута в Науково-дослвдному iнститутi люового господарства (IBL, Warszawa) при сприянш Народного Фонду Охорони Середовища i Водного Господарства (Польща)
Doc. R.T. Gout1 - USUFWT; dr. J. Nowakowska2-FRI
Application of gene-specific STS-markers for studies of population genetic
polymorphisms in conifers
Gene-specific STS-markers represent new and prospective PCR-based system of molecular markers. Gene-specific STS-markers display a number of important advantages, including co-dominant mode of inheritance, usage of simple methods to reveal polymorphisms, and high reproducibility, and therefore, can be used effectively for evaluation of genetic parameters in conifer plant species. This review focuses on advantages and disadvantages gene-specific STS-markers usage compared to other systems, as well as describes the principles of design and utilization of these markers.
Вступ
На сьогодш особлива увага придшяеться питанню охорони бюлопч-ного рiзноманiття, зокрема видового i внутршньовидового складу деревних рослин люових екосистем, що тюно пов'язано з генетико-селекцшними роботами. Останш характеризуются певними методами дослщжень i прийомами здшснення селекцшного процесу.
Як вщомо, рiзноманiтнi комбшаци генiв у межах кожного виду ство-рюють великий набiр ознак, таких, як забезпечують виживання i стiйкiсть у певних умовах середовища. Цi комбшаци генiв успадковуються в наступних поколшнях, перехресному запиленнi, формуються також новi генетичнi комбшаци, якi забезпечують адаптащю видiв до умов навколишнього середовища, що постiйно змшюеться. Тому основною метою лiсоводiв на даному ета-пi мае бути не тшьки створення мiнiмальних умов для виживання деревних порщ, але i збереження популяцiй з генетичним рiзноманiттям, яке б забезпе-чило !х виживання в стресових умовах навколишнього середовища.
Висока генетична полiморфнiсть деревних рослин, велика варiабель-шсть впливiв середовища на генотип зумовлюють значну внутрiшньовидову мiнливiсть за енерпею росту та iншими ознаками, що зумовлюе значнi труд-нощi при ощнщ материнських деревостанiв. Основною причиною цього е вщсутшсть простих i надiйних методiв отримання об'ективно! шформаци про генетичну рiзноманiтнiсть популяцiй.
Поряд з традицшним селекцiйним напрямком вщбору дерев за фенотипом, на основi морфометричних показникiв, для виршення генетико-се-лекцiйних проблем набувають широкого використання методи молекулярно-генетичних маркерiв. Вони дають змогу швидше i надiйнiше iдентифiкувати генотип i дають змогу ефектившше проводити генетичну ощнку популяцiй та iнших селекцiйних об'екпв.
Протягом останнiх трьох десятилiть основним методом ощнки гене-тичного рiзноманiття деревних порiд було дослiдження полiморфiзму iзофер-ментiв [5]. 1зоферменти i надалi е порiвняно простим i недорогим методом оцiнки генетичного рiзноманiття, проте !х використання iстотно обмежене кшьюстю доступних систем та низьким рiвнем полiморфiзму в окремих видiв рослин [5]. Останнiм часом створення нових систем молекулярних маркерiв стало одшею з найдинамiчнiших галузей прикладно! молекулярно! генетики. Новi пiдходи, яю основанi переважно на розщепленнi ДНК специфiчними ен-
донуклеазами рестрикцiï або рiзних модифiкацiях методу полiмеразноï лан-цюгово1 реакцiï (ПЛР), дають змогу здiйснювати безпосередню оцшку поль морфiзмiв ДНК [5].
Безперечно, yci iснуючi на цей час системи молекулярних маркерiв (табл. 1) мають як переваги, так i недолiки, якi значною мiрою визначаються ïx застосуванням.
Табл. 1. Поширет системи молекулярних MapKepie для оцтки _генетичних napaмeтpiв популяцш_
Система Використовуват методи Переваги i недол1ки Поси-лання
1зо-фер- менти Електрофоретичне роздь лення та або г1стох1м1чне забарвлення кл1тинних фермеиив Кодомшантт. Однозначнi результати визначення час-тоти алелей. Необхвдт свiжi, i часто спе-цифiчнi тканини [5]
RFLP Розщеплення геномно1 ДНК ендонуклеазами рес-трикци з наступним Са-узерн-блот анал1зом з ви-користанням специф1чних зонд1в Кодомiнантнi. Однаковi методи та зонди придатт для використання у рiзниx таксонах. Часто потребуе застосування радiоактивно мь чених зондiв. Вимагае значних кшькостей ДНК. [1, 3]
RAPD ПЛР ампл1ф1кащя випадко-вих локусш геному за допо-могою коротких (як правило, 10 основних) праймерш з ви-падковими послiдовностями Домiнантнi. Випадковий аналiз одночасно кодуючих та некодуючих послiдовностей усix трьох геномiв рослинних органiзмiв. Часто низька вiдтворюванiсть. [2, 3, 5]
AFLP Розчеплення геномно1 ДНК двома ендонуклеазами рес-трикци з наступним приед-нанням адаптерних посль довностей на кшцях та наступним ПЛР Домшантт. Бiльша вiдтворюванiсть результатов по-рiвняно з RAPD. Можлива автоматична оцшка результатiв. Дорожчi порiвняно з RAPD. [3]
STS ПЛР ампл1ф1кащя окремих локушв геномно1 ДНК з ви-користанням специф1чних праймертв Кодомшантт. Аналз специфiчниx локусш геномш рослин. Порiвняно дорогий та трудомшткий про-цес пiдбору праймерiв. [4, 8-11, 15, 16]
Найширшого розповсюдження у генетичних дослщженнях рослинних видiв набули RELP-маркери (restriction fragment length polimorphisms - поль морфiзми довжини рестрикцiйниx фрагментiв), RAPD (randomly amplified polymorphic DNAs - довшьно ампшфжоваш полiморфнi ДНК) [3] та AFLP-маркери (amplified fragment length polymorphisms - полiморфiзми довжини ампифшованих фрагментiв). Серед цих трьох систем маркерiв найшвидшою i найдешевшою е RAPD, оскiльки методика створення цих маркерiв е порiв-няно простою i не потребуе шформаци стосовно нуклеотидноï послiдовностi ДНК [3]. Проте, при застосуванш диплощного матерiалу, 1'х домiнантна природа може призводити до неточних ощнок генетичних параметрiв популяцiй [3]. Крiм цього, RAPD часто не виявляють менделiвського характеру успад-кування [2]. Натомють, RELP виявляють кодомiнантний характер успадку-вання (найпридатнiший для оцiнки генетичних параметрiв популяцiй), проте
вимагають застосування тривалих та трудомiстких методiв, а також великих кшькостей ДНК [1]. AFLP, що поеднуе у собi методики RELP та RAPD дае змогу уникнути недолтв, а також сумуе переваги цих двох систем маркерiв. Загалом, порiвняно з RAPD, AFLP е бiльш вiдтворюваними, проте водночас дорожчими у застосуванш [5].
Описаш у цьому оглядi ген-специфiчнi STS-маркери на основi кДНК (EST клошв) на цей час вважають одними з перспективних методiв ощнки ге-нетичних параметрiв популяцiй рiзних (i зокрема хвойних) видiв рослин
[9-11, 15, 16].
STS-маркери - пор1вняльна характеристика
STS (sequence tagged sites) являють собою ушкальш однокопшш ко-роткi дiлянки геному з вщомою нуклеотидною послiдовнiстю, якi можна спе-цифiчно амплiфiкувати з використанням ПЛР [6]. Якщо такi STS е полiмор-фними за довжиною, вони стають щнними генетичними маркерами, зокрема для картування геномiв та ощнки генетичних параметрiв популяцiй рослин.
1снуе кiлька типiв STS-маркерiв (табл. 2). Найпоширенiшi серед них -SSR (simple sequence repeats - повтори простих послщовностей) [12]. До ш-ших типiв STS-маркерiв належать SCAR (sequence characterized amplified regions - амплiфiкованi дшянки з описаною послщовшстю) [13], CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences - розщеплет амплiфiкованi полiморфнi пос-лiдовностi) [5], а також ген-специфiчнi маркери на основi EST (expressed sequence tags - експресоваш мiтки послщовностей) [9].
Табл. 2. Системи STS-MapKepie для ощнки генетичних napaMempie популяцш
Система Використовуват методи Переваги i недол1ки Поси-лання
SSR ПЛР ампл1ф1кац1я мшросате-л1тних послвдовностей з використанням специф1чних праймер1в Розповсюджет, високопол1морфт ба-гатоалельт маркери. Пор1вняно легкий процес створення праймер1в. Потребують складних методав роздален-ня та виявлення продуктов амплхфшацИ. [9, 12]
SCAR Секвенування фрагменив RFLP або продукив ампл1ф1ка-цп RAPD з наступним пвдбо-ром специф1чних праймер1в та ПЛР ампл1ф1кащею Легке створення на основ1 RAPD та RFLP. Часто виявляються недостатньо по-л1морфними. [7, 13]
Ген-специ-ф1чн1 STS ПЛР ампл1ф1кащя послвдовностей окремих гетв з використанням специф1чних праймер1в, пвд1браних до послвдовностей ввдповвдних кДНК Висока вщтворюватсть результатов. Можливе використання для близькос-порщнених видав рослин. Застосування простих методав роздшення та виявлення продуктов ампл1ф1каци. Пор1вняно складний процес створення праймергв. [9, 10 15, 16]
CAPS ПЛР ампл1ф1кащя послвдов-ностей STS (як правило, окремих гетв) з використанням специф1чних праймер1в з наступним розщепленням продук-т1в ендонуклеазами рестрикцп Те ж саме, що й для генспециф1чних STS-маркерхв. Бшьш трудомшткий i дорожчий процес створення. [4]
У випадку SSR-MapKepiB мiшенню для ПЛР ампшфшаци е тандемнi мультикопiйнi повтори ди-, три- та тетрануклеотидних послщовностей (вiдомi також як мiкросателiти) [12]. Мшросателгги вважаються розповсюдженими, чисельними та високо полiморфними маркерами, швидко ощнюються за допо-могою ПЛР, що робить привабливим ïx застосування для картування, а також ощнки генетичних параметрiв популяцш дерев. Оскiльки нуклеотидш посль довностi, якi оточують мжросател^и, е консервативними, SSR-специфiчнi праймери можна легко створювати. Крiм цього, SSR-маркери потенцiйно е ба-гатоалельними i тому бшьш шформативними. Системи SSR-маркерiв створенi для значноï кiлькостi видiв дерев, зокрема для кiлькоx видiв сосни [14], модри-ни [12] та багатьох шших видiв хвойних. Проте, ощнка алельного рiзноманiття SSR-маркерiв часто вимагае застосування трудомiсткиx методiв з високою роздiльною здатнiстю, таких як електрофорез продуктiв амплiфiкацiï у полiак-риламiдному гелi з наступним забарвленням срiблом [9].
STS-маркери можуть бути створеш також шляхом секвенування фраг-ментiв RFLP або продукпв амплiфiкацiï RAPD. В останньому випадку секве-нованi нуклеотиднi послщовност RAPD, названi амплiфiкованими дiлянками з описаною послiдовнiстю або SCAR, використовуються для пiдбору специ-фiчниx праймерiв [7]. Цей метод дае змогу швидко i легко створювати новi STS-маркери на основi продуктiв амплiфiкацiï RAPD, i водночас уникнути проблем, пов'язаних з вiдтворюванiстю RAPD аналiзiв. Проте, створенi таким методом SCAR-маркери можуть виявитись недостатньо полiморфними [13].
Ген-специфiчнi STS-маркери на основi кДНК отримують шляхом шд-бору праймерiв для специфiчноï амплiфiкацiï окремих гетв, використовуючи для цього нуклеотиднi послщовност вiдповiдниx 1'м кДНК (EST клошв) [11]. Створеш таким чином кДНК мютять переважно кодуючi дiлянки гешв, тому ген-специфiчнi STS-маркери е найпридатшшими для генетичного картування та ощнки генетичних параметрiв популяцiй [15]. До переваг ген-специфiчниx STS-маркерiв належать висока вщтворюватсть результат, кодомiнантний характер успадкування, а також можливють виявлення алельного рiзноманiт-тя за допомогою простого методу електрофорезу ДНК в агарозному гелi i без додаткових маншуляцш з продуктами амплiфiкацiï [11]. Крiм цього, рiвень рiзноманiття, що вдаеться виявити з використанням ген-специфiчниx STS-маркерiв е щонайменше таким же, як при використанш iзоферментного ана-лiзу [11]. Водночас перевагою ген-специфiчниx STS-маркерiв, порiвняно з iзоферментами, е вщсутшсть тканиноспецифiчностi та вiдмiнностей на рiз-них стадiяx розвитку рослин, а також практично необмежена кшьюсть [11]. Як i у випадку будь-яких систем маркерiв, в яких застосовуеться ПЛР ампль фжащя специфiчниx послiдовностей, створення праймерiв е порiвняно тру-домiстким та дорогим [10]. Крiм цього, ген-специфiчнi STS-маркери, розроб-ленi для одного виду рослин, часто виявляються придатними для ощнки генетичних параметрiв в шших близьких видiв (переважно приналежних до одного роду), що дае ютотну економш часу та ресурЫв пiд час проведення дос-лщжень з цими видами [9-11].
CAPS-маркери, B^OMi також пiд назвою PCR-RFLP, отримують шляхом специфiчноl амплiфiкащl фрагмент ДНК (найчастiше кДНК) з наступним розщепленням продуктiв амплiфiкащl ендонуклеазами рестрикцп [4]. В останньому випадку CAPS можна вважати модифжащею методу ген-специ-фiчних STS-маркерiв, який дае змогу крiм полiморфiзму довжини амплiфiко-ваних фрагментiв виявляти полiморфiзм довжини продуклв рестрикцп цих фрагментiв. Порiвняно з iншими системами молекулярних маркерiв CAPS на основi кДНК, оскшьки i ген-специфiчнi STS-маркери, мають ряд переваг, до яких зокрема належить кодомшантний характер успадкування i висока вщ-творюванiсть результатiв [4].
Дотепер створено кшька систем ген-специфiчних STS-маркерiв та CAPS-маркерiв для дослщження генетичного полiморфiзму у хвойних видав (табл. 3).
Методика створення ген-специф1чних 8Т8-маркер1в
Отримання ген-специфiчних STS-маркерiв потребуе специфiчноl ПЛР амплiфiкацil кДНК, тому для створення праймерiв необхiдно мати шформа-цiю стосовно послiдовностей цих кДНК (EST-клошв). Таку iнформацiю, як правило, отримують шляхом секвенування окремих випадково вибраних кло-шв з бiблiотеки кДНК вiдповiдного виду рослини [9, 15]. Проте для окремих видiв рослин, ця шформащя може бути отримана також iз баз даних нукле-отидних послiдовностей, доступних в штернет (наприклад GenBank), що дае змогу зберегти час i ресурси та iстотно спростити створення маркерiв.
Пiсля секвенування кДНК, до отриманих нуклеотидних послщовнос-тей шдбираються специфiчнi праймери. Працездатнiсть пiдiбраних пар праймерiв перевiряють за допомогою ПЛР амплiфiкацil вщповщно! кДНК, а також геномно! ДНК, видшено! з рослини того самого генотипу, з якого була отримана бiблiотека кДНК [9]. Аналiз та порiвняння продуктiв амплiфiкацil проводять шляхом електрофоретичного роздiлення в 1-2 %-ному агарозному гелi з наступним забарвленням бромистим етидiем [9, 15].
По^м пари праймерiв, як успiшно пройшли перевiрку на працездат-нiсть, використовують для подальшо! ощнки. Для цього, з використанням цих пар праймерiв, проводять ПЛР амплiфiкацiю зразкiв геномно! ДНК 15-45 дерев, що мають рiзне походження в межах ареалу виду [8-10, 15]. Ана-лiз отриманих продуктiв амплiфiкацil, як i у попередньому випадку, проводять шляхом роздшення в агарозному гель Загалом, оцiнку проводять за кшь-кома параметрами, найважлившими з яких е наявнiсть та стушнь полiмор-фiзму продуктiв амплiфiкацil, а також характер успадкування маркеру. Для подальшого використання вiдбирають, як правило, маркери iз значним рiв-нем полiморфiзму та кодомiнантним характером успадкування [9, 15].
Для ощнки полiморфiзму, зразкiв дипло1дно1 геномно! ДНК, видь лено! з гшок, можуть бути використанi додатково зразки гапло!дно1 геномно! ДНК, видiленi з мегагаметофтв вiдповiдних рослин [9]. Використання гапло-1дних зразкiв дае змогу полегшити визначення характеру успадкування марке-рiв (як домiнантного, так i кодомiнантного) шляхом порiвняння розподшу але-лей серед гапло!дних мегагаметофтв гетерозиготних дерев [10], а також провести аналiз наявностi зчеплення маркерiв шляхом 1х попарного порiвняння i вилучити з подальшого використання одну з пар зчеплених маркерiв [9].
Табл. 3. Праймери для STS-MapKepie у деяких хвойних eudie рослин
Маркер Локус Праймер Розм1р, пн Посилання
Pinus sylvestris (ген-специф1чт STS-маркери до м1тохондр1ально-го штрону nad 1) nad1 F-R GCATTACGATCTGCAGCTCA 2530 [17]
GGAGCTCGATTAGTTTCTGC
nad1 C-D TCCAGGTGCGAATAACCC 1897
GTTGTGTTGCTCTATCTCGGC
nad1E-G TATTTCATAGCAGCAGTCCTGG 1065
GGAGCTGCTCCTATCCTGG
nad1 H-I TTAATCAAAAGGTCCGGAG 248
TGAAGTGACTCGCACTACTG
Picea mariana (ген-специф1чт STS-маркери) SB01 GCGTTCCAGAAATCCTACTAC 1090-2075 [9]
CCAAATGCACCATAAATACAG
SB06 TAAGGCAATTCTTCGGCTCAC 539-609
ACTAAGACAACCATTCTCTCC
SB07 AACAATGGGTTGGAGATCGTC 645-648
CGCTTGACAGGTCTTGGTAAC
SB08 TTCGATGCTAGGTCTTGAGTC 634-653
CAGAAATTGGAAGTAAGAACG
SB11 GTATTACCCAGCTCAAGTTCC 691-695
AACTATCCCACCACTCCTGTC
SB21 CAGATCAGGCACGCATTGTTG 471-474
GTCCATCAGGGCTCATGTTTG
SB24 CAGTATGTGGGTTCATGTTAG 738-771
TTTGATAGCAGAGACCACTTC
SB29 AGCGGCATTGAACAGAGTAAC 553-580
AATGGAAATGAAGGCAGACTC
SB31 TTGGCATCTCTCAGCACATTC 439-449
TAGGTTTCTGGTCACGTCTAC
SB62 GTATTACCCAGCTCAAGTTCC 681-706
ACAGTACGCCGCAGACAAATG
SB70 AAATGGCGGTGTCATCTCTTC 404-417
AAAATGAGTTCCCTGCCAATC
SB72 GCTCAGGAATCACTATCATTG 515-523
C AAAGAT ACC AACCG AT T AAG
Cryptomeria japonica (ген-специф1чт CAPS-маркери) CD657 TCCTGATACTGTGGGCAACT 800 [16]
CCCCGATATGCTCTTCAACT
CD1237 GGAATCGGATGGGTTATCTG 1300
AGAATCCGGGACCAAATCTA
CD526 TCTTGCATGACTTGGTTGCT 1000
GGGGATTTGGAGATTTTCAG
CD1309 AGCAAAACCTTGGGATTCTT 1400
TAGAGCCGCACTATTCAGAT
CD 1894 ACCCTTTCCTCG CCTACATT 800
GCCGACTGAGTAAACAAACC
CD1216 GCCAAGAACCTGAGCAAATC 800
CCTGTGCGAAAGCCAATCAA
CD 1706 ATAGGCGACGCAGGTCAAAA 400
TCTGGGGCTGTAGTTCCAGT
CD 1067 TTTAGGGTTTTGGGTTTTAG 1000
AACATACCATCTGCCCTCTT
CD1091 GCCCTCCCTGGTTTTCTTCA 700
GAAACCCTGGACTGGCATAG
CD41 GAATCCAAAACCACTTGCTA 1900
ACATTCACGACCCTCCGTAT
CD1232 TTTGTTGGACATTGGGTTCT 1500
GCAGAGCCTAAGTGATTTGC
CD1675 AAGATGGGGCTCAATAAGTT 2300
GGCGGTCTCAGGATTCTTAG
CD1195 TCCCACTGAATCTCCTGTGA 2800
ATTGGCAATGGCGTTATTCT
Створеш i вщбраш таким чином ген-специфiчнi STS-маркери можуть в подальшому використовуватись для картування та ощнки генетичних пара-метрiв популяцш дерев даного виду, а також, частково, шших видiв дерев да-ного роду. Необхщно зауважити, що за результатами дослщжень у двох рiз-
ниx видiв xвойниx, для вiдборy 1З-15 полiморфниx мaркерiв з кодомiнaнтним xaрaктером успадкування необxiдно проaнaлiзyвaти 80-100 кДНК [9, 161.
n^6ip npaHMepiB та умови ПЛР
Вщ правильного пiдборy прaймерiв пiд час створення ген-специфiчниx STS-мaркерiв залежить не тiльки ефективнiсть ПЛP, але й ефективнiсть вияв-лення полiморфiзмy. В одному з пiдxодiв, застосованому Перрi та Боскетом [91 тд час створення ген-специфiчниx STS-мaркерiв для Picea mariana, було m-дiбрaно обернений праймер у З'-UTR (3,-нетрaнсльовaнiй дiлянцi) секвенова-но1' кДНК, а прямий праймер - у кодуючш дшянщ на 350-600 пар основ вище. Бiльше цього, в окремж випaдкax, на основi aнaлiзy виявлениx за допомогою BLASTX геномнж послiдовностей подiбниx до секвеновaниx кДНК, дослщ-ники виявляли iмовiрне розташування iнтронiв, i пiдбирaли прямий праймер таким чином, щоб продукт aмплiфiкaцiï мiстив один-два iнтрони [91. Оскшьки вщомо, що полiморфiзми загалом, i полiморфiзми довжини зокрема, найчасть ше трапляються у некодyючиx д^нкак ДНК (в тому числi у iнтронax та З'-UTR), застосування такого тдаоду до пiдборy прaймерiв, при якому продукти aмплiфiкaцiï мютитимуть iнтрони та З'-UTR, дae змогу шдвищити ефектив-нiсть створення ген-специфiчниx STS-мaркерiв. Kрiм цього, застосування такого тдаоду дae змогу збшьшити специфiчнiсть прaймерiв за вiдношенням до гешв однieï родини, оскiльки нав^ь дуже подiбнi гени однieï родини часто виявляють ютотт вщмшност у З'-UTR [91. Це значною мiрою стосyeться xвойниx, у якж великi родини генiв трапляються порiвняно часто.
Зауважимо, що застосований рашше Тсумурою та iн. [151 шдазд створення ген-специфiчниx STS-мaркерiв для xвойноï рослини Cryptomeria japónica, при якому обидва праймери тдбиралися до кодуючж дiлянок кДНК, через низький безпосередньо спостережуваний полiморфiзм довжини ампль фiковaниx фрaгментiв потребував додаткового розщеплення продyктiв ампль фiкaцiï ендонуклеазами рестрикцiï (тобто CAPS).
Типовими праймерами для aмплiфiкaцiï ген-специфiчниx STS-марке-рiв e 20-21-основнi олiгонyклеотиди з вмютом G + C наближеним до 50 %, мтмальною вторинною структурою та вщсутньою мiжпрaймерною компле-ментаршстю [9, 151. Пiд час створення та використання ген-специфiчниx STS-мaркерiв ПЛP, як правило, проводять у 15-20 мкл стaндaртниx реак-цiйниx сумшей з 0.1-0.2 мкМ кожного праймера та 5-50 нг ДНК-мшеш (ге-номно1' ДНК), з попереднiм 5^вилинним прогрiвaнням сyмiшей при 94 °С, наступними 30-45 циклами aмплiфiкaцiï (40-60 с при 94 °С, 40-120 с при 50-65 °С та 60-180 с при 72 °С) та завершальною 5-10-xвилинною iнкyбaцieю при 72 °С [4, 9-11, 15, 161.
Вдоновки
Cyчaснi дослiдження показують, що ген-специфiчнi STS-маркери мо-жуть стати зручною системою для ощнки генетичнж пaрaметрiв попyляцiй xвойниx видiв рослин. Незважаючи на те, що створення прaймерiв для цieï системи e порiвняно дорогим та трудомютким процесом, разом з кодомшантним xaрaктером успадкування та високою вщтворювашстю результатов, ген-специ-
фiчнi STS-маркери мають рядом iнших переваг, зокрема теоретично необмеже-ну юльюсть, можливiсть виявлення алельного рiзноманiття за допомогою простого електрофоретичного роздшення продукпв амплiфiкацii в агарозному гел^ а також придатнiсть для проведення дослщжень з близькими видами. Водночас, для подальшого з'ясування придатностi цих маркерiв для оцiнки генетичних па-раметрiв популяцiй iнших видiв хвойних необхiднi наступнi дослiдження. Подальше вдосконалення системи ген-специфiчних STS-маркерiв, а також вдоско-налення вже юнуючих та створення нових модифiкацiй цього методу може ю-тотно спростити та поширити застосування цих маркерiв i зробить 1х викорис-тання доступним для невеликих лабораторiй, а також для прикладного застосування у лiсiвництвi, на розсадниках та станщях розведення деревних рослин.
Лггература
1. Devey ME, Bell JC, Smith DN, Neale DB, Moran GF. A genetic linkage map for Pinus ra-diata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers// Theor Appl Genet. - 1996. - 92. - P. 673-679.
2. Echt CS, Erdahl LA, McCoy TJ. Genetic segregation of random amplified polymorphic DNA in diploid cultivated alfalfa// Genome. - 1992. - 35. - 1. - P. 84-7.
3. Isabel N, Beaulieu J, Bousquet J. Complete congruence between gene diversity estimates derived from genotypic data at enzyme and random amplified polymorphic DNA loci in black spruce// Proc Natl Acad Sci U S A. - 1995. - 92. - 14. - P. 6369-73.
4. Iwata H, Ujino-Ihara T, Yoshimura K, Nagasaka K, Mukai Y, Tsumura Y. Cleaved amplified polymorphic sequence markers in sugi, Cryptomeria japonica D. Don, and their locations on a linkage map// Theor Appl Genet. - 2001. - 103. - P. 881-895.
5. Newton AC, Allnutt TR, Gillies AC, Lowe AJ, Ennos RA. Molecular phylogeography, intras-pecific variation and the conservation of tree species// Trends Ecol Evol. - 1999. - 14. - 4. - P. 140-145.
6. Olson M, Hood L, Cantor C, Botstein D. A common language for physical mapping of the human genome// Science. - 1989. - 245. - 4925. - P. 1434-5.
7. Paran, I. and Michelmore, R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce// Theor. Appl. Genet. - 1993. - 85. - P. 985-993.
8. Perron M, Perry DJ, Andalo C, Bousquet J. Evidence from sequence-tagged-site markers of a recent progenitor-derivative species pair in conifers// Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. - 97. - 21. - P. 11331-6.
9. Perry DJ, Bousquet J. Sequence-tagged-site (STS) markers of arbitrary genes: development, characterization and analysis of linkage in black spruce// Genetics. - 1998 a. - 149. - 2. - P. 1089-98.
10. Perry DJ, Bousquet J. Sequence-tagged-site (STS) markers of arbitrary genes: the utility of black spruce-derived STS primers in other conifers// Theor Appl Genet. - 1998 b. - 97. - P. 735-743.
11. Perry DJ, Isabel N, Bousquet J. Sequence-tagged-site (STS) markers of arbitrary genes: the amount and nature of variation revealed in Norway spruce// Heredity. - 1999. - 83. - 3. - P. 239-48.
12. Rungis D, Berube J, Zhang J, Ralph S, Ritland CE, Ellis B, Douglas K, Bohlmann J, Ritland K. Robust simple sequence repeat markers for spruce (Picea spp.) from expressed sequence tags// Theor Appl Genet. - 2004. - у друцг
13. Scotti I, Vendramin GG, Matteotti LS, Scarponi C, Sari-Gorla M, Binelli G. Postglacial recolonization routes for Picea abies K. in Italy as suggested by the analysis of sequence-characterized amplified region (SCAR) markers// Mol Ecol. - 2000. - 9. - 6. - P. 699-708.
14. Smith D, Devey ME. Occurrence and inheritance of microsatellites in Pinus radiata// Genome. - 1994. - 37. - 6. - P. 977-83.
15. Tsumura Y, Suyama Y, Yoshimura K, Shirato N, Mukai Y. Sequence-tagged-sites (STSs) of cDNA clones in Cryptomeria japonica and their evaluation as molecular markers in conifers// Theor Appl Genet. - 1997. - 94. - P. 764-772.
16. Tsumura Y, Tomaru N. Genetic diversity of Cryptomeria japonica using co-dominant DNA markers based on sequenced-tagged sites// Theor Appl Genet. - 1999. - 98. - P. 396-404.
17. Soranzo N, Alia R, Provan J, Powell W. Patterns of variation at a mitochondrial sequence-tagged-site locus provides new insights into the postglacial history of European Pinus sylvestris populations// Mol Ecol. - 2000. - 9. - P. 1205-1211.
