CC BY
71УДК 577.21:575.22:581.6 http://dx.doi.Org/10.21498/2518-1017.13.2.2017.105394
Технология генотипування KASPTM
та ii' використання в генетико-селекфйних програмах
(на приклад! кукурудзи)
Н. Е. Волкова*, В. М. Соколов
Селекцтйно-генетичний институт - Нац'ональний центр нааннезнавства та сортовивчення, вул. 0в1дюпольська дорога, 3, м. Одеса, 65036, Украина, *e-mail: natavotki@ukr.net
Мета. Зд1Йснити огляд публкафй щодо суп' технолога генотипування - конкурентно! алель-специф1'чно'1 пол1'меразнсл ланцюговоТ реакцп'Т (англ. competitive allele-specific PCR, нин1' мае назву Kompetitive ALLeLe Specific PCR, KASPTM) та ТТ використання в р1'зних генетико-селекц1'йних напрямах досл1'джень (на приклад1' кукурудзи). Результати. Висв1'тлено суть технолога KASP-генотипування, його переваги. Представлено вимоги до матричноТ ДНК, оск1'льки усп'х KASP-анал''зу залежить в1'д якост й юлькосп. Наведено приклади глобальних проеклв у сфер1' селекцiТ рослин для тдвищення врожайност', в яких використовують технолоп'ю KASP-генотипування. На приклад1 кукурудзи представлено результати KASP-генотипування та Тх впровадження в селекцш й нас'нництво, зокрема, для визначення генетичноТ 1'дентичност1, генетичноТ чистоти, перев1рки походження, маркер-допом1жного добору та 1'н. Продемонстровано, як геномний доб1р за технолопею KASP-генотипування може сприяти швидкому генетичному посиленню посухотолерантносп у кукурудзи. Шляхом пор1'вняння ефективносп створення л1н1й з певними ознаками (наприклад, поеднання високоУ врожайност зерна та посухотолерантносп) з використанням п1дход1в традицiйноТ селекцш (доб1р за фенотипом) та молекулярно-генетичних метод1'в (доб1'р за маркерами) доведено: для того, щоб розкрити потенц'ал генотипу рослини у раз1' використання звичайного самозапилення, тест-кросингу й оц'нки, необх1'дно чотири сезони (два роки за наявносп теплиць), тод1' як у раз1' застосування маркер1'в популяц1'ю збагатили ц1'льовими алелями за один сезон. При цьому не було потреби в стресовому чиннику. Висновки. Технолопя KASP-генотипування е високоточним i ефективним 1'нструментом сучасноТ генетики та селекцш, який усп1'шно використовують для досл1'дження генетичноТ р1'зномат'тносп, генетичноТ спор1'дненост1', структури популяц1'й, визначення генетичноУ 1'дентичност1', генетичноТ чистоти, перев1'рки походження, картування локус1'в кiлькiсноТ ознаки, визначення алел1'в, маркер-допом1'жного добору, маркер-допом1'жно1 селекцiТ. Доц1'льним i своечасним е впровадження технологiТ KASP-генотипування в наш™ краТнi для вирiшення широкого кола завдань сучасноТ генетики, селекцш, наанництва.
Ключов! слова: однонуклеотидний пол1'морф1'зм, технология KASPTM, генотипування, кукурудза, молекулярний маркер.
Вступ
Однонуклеотидний пол1морф1зм (англ. single nucleotide polymorphism, SNP) e 3Mi-ною одного нуклеотиду в послвдовносп ДНК 3i звичайною альтернативою з двох можли-вих нуклеотидiв у цьому положенш. Отже, полiморфiзм виникае тодi, коли один нуклео-тид (А, Т, С або G) у геномi або iншiй посл^ довностi вирiзняeться м1ж членами одного виду або мiж парними хромосомами в шди-вiдуума. Технологiчний прогрес у сиквену-ваннi та наявшсть шформаци щодо посл^
Nataliia Volkova
http://orcid.org/0000-0002-9333-4872
довностей геномiв призвели до виявлення й розроблення SNP-маркерiв для ильськогос-подарських культур. SNP-маркери значною мiрою замiнили маркери на основi послвдов-ностей простих повторiв (англ. simple sequence repeats, SSR) для сиквенованих видiв ильськогосподарських культур, зокрема кукурудзи. Очшуеться, що SNP-маркери зам^ нять iншi типи молекулярних маркерiв для генотипування б1льшосп видiв у найближ-чому майбутньому у зв'язку з дедалi шир-шим використанням технологiй сиквенуван-ня наступного поколшня [1].
Завдяки низькш вартостi, широкiй пред-ставленостi в геном^ локусспецифiчностi, ко-домiнантностi, простому облшу (документу-ванню), потенцiалу для аналiзу з високою
пропускною здатшстю й вГдносно низькому рГвню помилки генотипування [2, 3], SNP-маркери стали потужним шструментом для багатьох генетичних i селекцшних програм, включаючи характеристику зародково! плаз-ми (дослГдження генетично! рiзноманiтностi, генетично! спорiдненостi, структури популя-цiй), аналiз контролю якостi (англ. quality control analysis) (визначення генетично! Гден-тичносп, генетично! чистоти, перевiрка по-ходження), картування локусГв кГлькГсно! ознаки (англ. quantitative trait loci, QTL), визначення алелiв (англ. allele mining), маркер-допомГжний беккросинг (англ. marker-assisted backcrossing, MABC), маркер-допомiжний ре-курентний добГр (англ. marker-assisted recurrent selection, MARS), геномний доб1р (англ. genomic selection, GS).
Безперервний прогрес у геномних техно ло-ггях високо! пропускно! здатностi призвГв до появи численних платформ SNP-генотипу-вання, як: комбшують рiзноманiтнi хГмГчт технiки й техшки дискримшаци алелГв (роз-щеплення ендонуклеазами рестрикци, сикве-нування, габридизащя з алель-специфГчними зондами, алель-специфГчна амплГфшащя, олГ-гонуклеотидне лиування та in.), методи детек-ци (колориметрГя, спектрометрГя, флуоресцен-цгя, флуоресцентне резонансне перенесення енерги, флуоресцентна поляризащя, хемГлю-мшесценщя) i формати реакцГ! (рГдиннофазш, твердофазш, гель-електрофорез, сиквенуван-ня наступного поколшня).
Одюею з найчасташе використовуваних уш-плексних платформ SNP-генотипування е конкурентна алель-специфГчна ПЛР (англ. competitive allele-specific PCR) (ниш мае назву Kompetitive Allele Specific PCR, KASPTM) [4].
Мета дослгджень - огляд публшацш щодо суп технологи KASP-генотипування та и використання в рГзних генетико-селекцш-них напрямах дослГджень (на приклад: ку-курудзи).
Результати досл1'джень
Технолопя KASP-генотипування, розробле-на та запатентована компанГею «LGC Genomics» (Велика Бриташя) для внутрГшнього використання, перетворилася на глобальну еталонну технолоию. Вона ^рунтуеться на по-довженш алель-специфГчних олионуклеоти-дГв та флуоресцентному (ФорстерГвському) резонансному перенесенш енерги (англ. Forster resonance energy transfer, FRET) для генераци сигналу [5]. FRET - процес, в якому вггдбува-еться перенесення енерги вгд одного флуоро-фора до шшого: збуджуючи одну молекулу (донор), можна спостериати флуоресценщю
шшо! (акцептора). Докладно принцип KASP-генотипування викладено на сайт: компани «LGC Genomics» [6].
Застосовуючи технологгю KASP-генотипу-вання, можна точно Гдентифшувати алель-ний полГморфГзм типу SNP та вставки/деле-ци (26-200000 п.н.) будь-яких тишв зразкгв (людина, тварини, рослини, мшрооргашзми). До переваг вГдносять швидкий робочий процес - отримання результату протягом 1-2 годин, висока точнГсть Гдентифшаци SNP (> 99,8%), можливГсть легкого масштабуван-ня (1-1536000 точок на добу), варГювання кГлькГстю зразкГв та SNP-маркерГв.
ТехнологГя KASP-генотипування е доступною як продукт у виглядГ валГдованих та/ або невалГдованих наборГв реагентГв, а та-кож як послуга генотипування (аутсорсшг) через сервГснГ лаборатори компани «LGC Genomics» в Америщ та бврош. Витрати на один KASP-аналГз становлять близько 15 до-ларГв США, узагальнення результатГв може бути представлено наступного дня (для по-рГвняння: аналГз за допомогою платформи GoldenGate™ (Illumina) коштуе близько 42 доларГв США i тривае близько шести тиж-шв).
Усшх KASP-аналГзу залежить вГд якостГ й кГлькостГ матрично! ДНК, яку можна екс-трагувати зГ зразкГв листя (свГжого, заморо-женого, люфГлГзованого, висушеного) або на-сшня з використанням «домашнього» (звич-ного) протоколу та «hand made» розчишв або одного з декГлькох комерцшно доступних наборГв екстракцГ! ДНК (наприклад, Qiagen DNeasy plant DNA extraction kit, Nucleon PhytoPure system, Promega Wizard genomic DNA purification kit, Zymo Research ZR plant/ seed DNA kits, Norgen genomic DNA isolation kit, Bioneer ExiPrep plant genomic DNA kit).
Для проведення реакцГ! необхгдно 5-50 нг ДНК. Оскгльки KASP нормалГзоваш на ДНК людини (розмГр ядерного геному 3000 Мп.н.), для аналГзу кожного SNP необхгдно мшГмум 5 або 10 нг матрично! ДНК (визначено за до-помогою флуороспектрометра безкюветного типу NanoDrop або спектрофотометрично на основГ абсорбцГ! вГдповгдно). Для геномГв ш-ших оргашзмГв потрГбно розраховувати кон-центращю за формулою: концентращя ДНК = (геном оргашзму в п.н. / 3000 п.н.) X 5,5. Наприклад, для KASP-аналГзу цибуи необ-хгдна така концентращя ДНК: 16400 Мп.н. / 3000 Мп.н. X 5,5 = 27,5 нг.
Чистота ДНК мае важливе значення, оскгльки наявтсть домшок у ДНК може негативно впливати на проходження полГме-разно! ланцюгово! реакцГ! (ПЛР), тобто ви-
моги до чистоти ДНК е стандартними для ПЛР. Джерелом ДНК можуть бути геномна, м1тохондр1альна ДНК, ПЛР-амплшони, пов-ногеномш амплшони.
Залежно ввд мети дослвдження, ДНК може бути екстрагована з одне! рослини або сум1-mi шлькох рослин. Для шбредних лшш, иб-рид1в одиничного схрещування i двобатьшв-ських картованих популяцiй зазвичай зм^ шують еквiвалентнi фрагменти листя 10-15 рослин на зразок для екстракци ДНК. Для MARS використовують ДНК, видшен з ш-дивiдуальних рослин. Шд час KASP-генотипування зразкiв перехреснозапиле-них культур i мiсцевих рас необхщно або генотипувати ДНК, вид1лену з шдиввдуаль-них рослин, або генотипувати щонайменше чотири повтори сумшей ДНК, або виконува-ти шльксне SNP-генотипування [7].
Щоб мiнiмiзувати помилки, необх1дно анал^ зувати мiнiмум 24 зразки й два негативш (без матрищ) контролi. Рiзниця в штенсив-ностi флуоресцентного сигналу м1ж наявшс-тю й вiдсутнiстю матрично! ДНК дае змогу пiдвищити впевненiсть у достовiрностi резуль-татiв генотипування. Рекомендовано також включати позитивнi контрольнi зразки ДНК ведомого генотипу.
Залежно ввд ступеня перевiрки й випуску до використання маркери KASP-генотипування потрапляють в одну з трьох категорш пере-вiрки компанieю «LGC Genomics»: (1) «Тшь-ки in silico дизайн». Ви дослiдження вико-нують in silico за допомогою запатентованого програмного забезпечення проектування праймерiв (Primerpicker). (2) «Функщональ-но шдтверджено». Маркери розроблено на замовлення для використання «ззовш». Вну-трiшню (In-house) оптимiзацiю не проводять. Ефектившсть оцiнено на основi зовнiшнього тестування, яке виконуе замовник. (3) «Пов-нiстю пiдтверджено». Ефектившсть ощнено внутрiшньою перевiркою, умови оптим^ зовано для кожного маркера кожного локусу. На основi бiльш як Ю^чного досвiду ком-панiя гарантуе, що навiть на найнижчому рiвнi перевiрки (in silico дизайн) значна бшьшкть KASP-маркерiв буде добре пра-цювати без необхiдностi в подальшш оп-тимiзацïï.
Технологiя KASP-генотипування може бути використана для широкого спектра ви-дiв рослин, тварин i людини для рiзних потреб. Так, частковий перелш органiзмiв, що генотиповано за допомогою ще! технологи, мгстить 78 видiв, серед яких - так важливi сiльськогосподарськi культури, як ячмшь, рис, кукурудза, буряк, виноград, перець, кар-
топля, соя, соняшник, томат. Створено бiблi-отеку з майже 14 тис. маркерiв сiльськогос-подарських рослин, яка постшно поповню-еться як новими видами, так i новими маркерами.
Компашя «LGC Genomics» пропонуе комп-лексне ршення поставленого завдання й за-безпечуе наборами для збору зразшв рослин, екстракцïï ДНК i генотипування. Послуги аутсорсшгу компанïï «LGC Genomics» дають змогу селекцiонерам навiть у ввддалених районах застосувати маркер-допомiжний добiр (англ. marker-assisted selection, MAS). При цьому немае обмеження мiнiмального замовлення, можна замовити будь-яку шль-кiсть маркерiв з бiблiотеки.
Технологiю KASP-генотипування використовують у 312 глобальних проектах у галузi селекци рослин для пiдвищення врожайнос-тi. Серед партнерiв - таш вiдомi мiжнароднi органiзацïï, як Продовольча i сшьськогоспо-дарська органiзацiя Об'еднаних Нацiй (англ. Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO), М:1жнародний центр по-кращення пшенищ та кукурудзи (англ. International Maize and Wheat Improvement Center, CIMMYT), М:жмродний науково-дос-л:дний шститут сiльськогосподарських культур для нашвпосушливих троп:к:в (англ. International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, ICRISAT), французський Нацiональний :нститут сшьськогосподарсь-ких дослiджень (фр. Institut national de la recherche agronomique, INRA), Консорщум з питань релiктових африканських сшьсько-господарських культур (англ. African Orphan Crops Consortium, AOCC), М:ж^родний центр сiльськогосподарських дослiджень у посушливих регiонах (англ. International Center for Agricultural Research in the Dry Areas, ICARDA) та ш.
KASP-маркери кукурудзи. ^6:р з бшьш шж 1200 функцiонально перевiрених KASP™ SNP-маркерiв для генотипування кукурудзи розроблено для програм CIMMYT: Глобально! програми кукурудзи (англ. Global Maize Program) i Програми виклишв поколшня (англ. Generation Challenge Programme) [8]. Щ KASP™ SNP-маркери були застосованi у бшьш н:ж 500 проектах CIMMYT i Консультативно! групи з м:ж^родних сшьськогос-подарських дослiджень (англ. Consultative Group for International Agricultural Research, CGIAR) у всьому свш. Тепер через компашю «LGC Genomics» щ маркери е доступними для сшвтовариства генетикiв та селекцiоне-р:в кукурудзи, щоб прискорити розроблення полiпшених сорт:в шляхом MAS. KASP-мар-
кери кукурудзи призначен для анал1зу таких ознак, як посухотолерантшеть, ефек-тивтсть використання азоту, стшксть про-ти бютичних стресв, толеранттсть до алю-мшю та ш.
SNP-маркери кукурудзи створено на осно-Bi даних картування проти еталонного генома B73 i дослвдження щодо визначення SNP в експресованих послвдовностях (англ. expressed sequence tag, EST). SNP картоваш з ви-користанням 284 популяцiй рекомбшантних iнбредних лiнiй кукурудзи - IBM (B736xMo17) i LHRF (F26xF252), 24 патентованих сортiв компанй' «Pioneer» i 60 елггних сортiв, шв-тчноамериканських i европейських лiнiй, тропiчних лшш. Серед KASP-маркерiв е так, що детектують SNP у генах, наприклад, ae1 (amylose extenderl), bt2 (brittle endosperm2), fea2 (fasciated ear2), glbl (globulinl), kipl (knotted interacting proteinl), sh1-sh2 (shrunken!), wxl (waxyl) та ш. Незважаючи на м^ьйони ввдкритих в геномi кукурудзи SNP, ввдносно невелика кiлькiсть цих полiморфiз-мiв е достатньою для молекулярно-генетич-них дослiджень та селекцшних програм, що дае можливiсть добрати «гнучкий» набiр ви-сокоефективних маркерiв для виконання рiзнопланових завдань. Наприклад, серед майже 130 тис. опублшованих маркерiв об-рано набiр з 695 високополiморфних SNP (значення частоти мшорного алеля > 0,3), вдентифшованих в екзонах, 5' та 3' нетранс-льованих регiонах генiв та конвертованих у проби чотирьох високопропускних технологш, у т. ч. i KASP [9]. «Гнучкий» набiр 162 SNP, за якими в уо.х чотирьох подходах отримано до-сконалi результати генотипування, можна ви-користовувати для виконання рiзнопланових завдань.
На в1дмшу вiд чипових систем з фшсовани-ми маркерними наборами, бiблiотека KASP-маркерiв кукурудзи компанй' «LGC Genomics» дае можливють здiйснювати гнучкий вибiр iнформативних маркерiв i легку адаптащю до рiзних колекцiй зародково! плазми в дея-ких селекцiйних програмах. Kрiм того, KASP-генотипування е економiчно високо-ефективним, забезпечуючи використання тих самих SNP-маркерiв протягом вие! се-лекцшно! програми.
Аналгз контролю якостЬ е важливим компонентом селекци кукурудзи та системи на-сшництва й включае визначення генетично! вдентичносп, генетично! чистоти, перевiрку походження [10].
Шдтримка генетично! чистоти (гомогенности шбредно! лши й пiдтвердження генетично! iдентичностi пе! само! шбредно! лши,
що шдтримуеться в рГзних мГсцях, е важли-вими функщями контролю якостГ в програмах селекци кукурудзи. 1нбредш лши ма-ють бути чистими й повинш мати всГ тГ озна-ки, як: добирав селекщонер. Невелик: змши в частотах алелГв можуть вгдбуватися в про-цесГ насшництва, шдтримання лши в рГзних мГсцях, змГшування шд час шдтримання та розмноження лши або вгд забруднення на-сшням чи пилком шших зразкгв. Але Гстот-m змши в генетичнш структур: тако! лши можуть негативно позначитися на продук-тивностГ, а також призвести до появи «не-правильних» ггбридГв або сортГв.
АналГз контролю якост: може бути реал: зований на рГзних етапах селекцшно! програми (зокрема, в перюд створення та розмноження лшш, перед використанням як батькГвських форм) для оцшки однородности гомозиготностГ та ГдентичностГ. Якщо ресур-си е обмеженими, аналГз контролю якостГ можна вггдкласти, поки лши не будуть роз-множеш у достатнш кГлькостГ. БатькГвськ форми в усГх селекцшних проектах з новими родоводами рекомендовано генотипувати за високо! шдльностГ, тому отриман лши можна порГвняти з батькГвськими генотипами для шдтвердження !х походження.
Для картованих популяцш аналГз контролю якостГ мае бути зроблений шляхом генотипування батькГвських форм i F1 тими самими SNP-маркерами з двох причин: (1) шдтверди-ти, що F1 мГстять «астинш» (англ. true-to-type) алелГ вгд сво!х батьшв, i (2) перевГрити гене-тичну чистоту шбредних батькгвських форм. Зразки F1 з гстинними батькГвськими алелями щонайменше для 90% SNP-маркерГв, як: були полГморфними мГж батьками, мають бути ви-користат в подальшому, тодГ як решта (10%) з небатькГвськими алелями мае бути видалена. 1нбредш батькГвськг форми, як: використову-ють у розробленш популяцГ!, що картують, мають бути генетично чистими, тому очшу-еться, що майже за всГма маркерами будуть виявлен гомозиготи.
У дослГдженш [11] оцшювали генетичну Гдентичтсть серед 2-4 джерел насшня од-те! й пе! само! шбредно! лши кукурудзи, оцшювали ступшь генетично! однорГдностГ в межах шбредних лшш, визначали шдгрупи високошформативних SNP-маркерГв для рутинного й маловитратного генотипування. Використовували 28 шбредних лшш для вив-чення генетично! ГдентичностГ серед рГзних джерел насшня шляхом генотипування 532 i 1065 SNP-маркерами платформ KASPar i GoldenGate вГдповГдно. Додатковий набГр 544 шбредних лшш використано для вивчення
генетично! однородности Частка алелiв, як вiдрiзнялися мiж джерелами насiння пе! само! шбредно! лши, коливалася ввд 0,1 до 42,3%. Джерела насшня, що проявляли висок рiвнi генетичних вiдстаней, були неправильно марковаш, тодi як джерела з нижчи-ми рiвнями рiзницi були забрудненi або про-довжували розщеплюватися. Генетична од-норiднiсть варивала вiд 68,7 до 100% з 71,3% шбредних лiнiй, якi вважають одно-рiдними. На основi наборiв даних, отрима-них для широкого дiапазону розмiрiв вибгр-ки й рiзних генетичних фонiв, автори реко-мендували пiдгрупу 50-100 SNP для рутинного й недорогого генотипування, перевгри-ли ¿х в шшому наборi подвiйних гаплощних та шбредних лшш i розробили протокол, який може бути використаний для зведення до мiнiмуму помилок у генетичних аналiзах i селекцй. Таким чином, розроблено простий протокол KASP-генотипування для контролю якосп з використанням шдгрупи 50-100 SNP-маркерiв, обраних серед 532 i 1065 SNP-платформ, для визначення однорвдносп зразка i для встановлення генетично! вден-тичносп рiзних партiй насiння одше! й пе! само! шбредно! лши. Кореляци мiж шдгру-пою 50-100 SNP-маркерiв, обраних для рутинного контролю якосп, та платформами 532 i 1065 SNP-маркерiв коливалися вiд 0,90 до 0,98.
Завданням дослвдження [12] було оцшити рiвень генетично! чистоти та вдентичносп мiж 2-8 джерелами насшня 16 шбредних л^ нш з використанням 191 KASP-маркера i 257268 маркерiв, отриманих за допомогою генотипування через сиквенування (англ. genotyping by sequencing, GBS), та порiвняти кореляцiю мiж KASP-маркерами низько! щiльностi i GBS-маркерами високо! щшь-ностi в аналiзi контролю якосп. Встановле-но, що генетична чистота в межах кожного джерела насiння варiювала ввд 49 до 100% пiд час використання KASP-маркерiв i вiд 74 до 100% - для GBS-маркерiв. Ви iнбреднi лши, отриманi з CIMMYT, крiм одше'1', показали 98-100% однорвдносп незалежно вiд типу маркера. Навпаки, лише 16 i 21% зраз-кiв, отриманих з Ефюпського iнституту сiльськогосподарських дослiджень (англ. Ethiopian Institute of Agricultural Research), продемонстрували чистоту > 95% у разi використання KASP- i GBS-маркерiв ввдповвд-но. Генетична ввдстань мiж кiлькома джерелами пе! само! лши варiювала вiд 0 до 0,295 для KASP-маркерiв i вiд 0,004 до 0,230 - для GBS-маркерiв. У п'яти лшш CIMMYT ввд-стань кiлькома джерелами пе! само! лши
становила < 0,05; в шших 11 шбредних л1-н1й, включаючи дв1 CIMMYT i дев'ять з Ефю-пи, генетичнi вiдстанi для двох або бшьше джерел насiння були бшьшими, нiж очшу-валося. Kореляцiя мiж 191 KASP- i 257268 GBS-маркерами становила 0,88 пiд час визначення чистоти i 0,93 - у разi встановлення вдентичносп. Зменшення кiлькостi GBS-маркерiв до 1343 знижувало коефщ1ент кореляци тiльки на 0,03. Отже, виявлено висо-ку невiдповiднiсть у генетичнш чистотi та iдентичностi за походженням джерел насшня (установ) незалежно ввд типу платформи генотипування й кшькосп маркерiв, вико-ристаних для аналiзy. Хоч i були деяк ввд-мiнностi мiж даними, отриманими за допомогою KASP- i GBS-маркерiв, загальш вис-новки, зроблеш за результатами використання обох методiв, в основному були схожими. Це чiтко доводить, що менший сyбнабiр по-передньо обраних i високояксних маркерiв е достатнiм для аналiзy контролю якостi, аналiз можна легко зробити за допомогою платформ генотипування з маркерами низь-ко! щшьносп, такими як KASP.
Як вщомо, в селекцй рослин шформащя про генетичнi вiдстанi мiж окремими зраз-ками необхiдна пiд час добору батьшвських генотипiв для забезпечення ефектившшого використання генетично! мiнливостi. В до-слiдженнях з асоцiативного картування е важливою поправка на структуру популяци, щоб контролювати iдентифiкацiю хибних асощацш мiж фенотипом i генотипом (по-милка I типу). В дослвдженш [13] вивчено генетичне рiзноманiття й структуру популяцй' в наборi 132 iнбредних лiнiй кукурудзи в рамках Програми селекцй' сорго та кукурудзи Корпораций сшьськогосподарських досл^ джень Бразили (порт. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropec^ria, Embrapa). Геномну ДНК цих лiнiй генотиповано за 1250 SNP з використанням технологи KASP-генотипу-вання (аутсорсшг компани «LGC Genomics»). Загалом для 719 SNP встановлено менше нiж 20% невщповвдних даних. Комплексний аналiз сввдчить, що цей набiр лiнiй кукурудзи складаеться з чотирьох субпопуляцш: група лiнiй кременисто! кукурудзи, повяза-них з лiнieю L3, група лшш зyбоподiбноi' кукурудзи, пов'язаних з лш1ею L228-3, група недавно розроблених зразшв зyбоподiбноi' кукурудзи, пов'язаних з лш1ею L371101-2, i велика група, утворена рештою лiнiй. Це трупу вання добре узгоджуеться з даними ро-доводiв. Результати аналiзy можуть бути безпосередньо використанi в селекцшних програмах для дослiдження генетично! мш-
ливоси. в межах гетерозисних груп з розроб-лення нових лшш i Miœ групами - для ство-рення перспективних гiбридiв. ^iM того, отримана iнформацiя е корисною для ви-правлення помилки типу I в асощативному картуваннi.
Генетичне рiзноманiття iнбредних лiнiй кукурудзи за KASP-маркерами оцiнено в до-слвдженнях [14, 15].
Картування QTL включае iдентифiкацiю пiдгрупи маркерiв, якi значною мiрою пов'я-занi з одним або б^ьше локусами, що впли-вають на прояв цьльово!' ознаки. CIMMYT у спiвпрацi з нащональними дослiдницькими системами сiльського господарства 14 кра!н субсахарно! Африки, Miжнародним шститу-том тропiчного сiльського господарства (англ. International Institute of Tropical Agriculture, IITA), Фондом аграрних технологiй Африки (англ. African Agricultural Technology Foundation, AATF) i компашею «Monsanto» вико-нуе проекти зi створення посухотолерантно! кукурудзи для Африки (англ. drought tolerant maize for Africa, DTMA) i водозбериаючо! кукурудзи для Африки (англ. water-efficient maize for Africa, WEMA) з використанням традицшно! селекци, MARS i/або транс-генно! технологи. Для MARS-компонента DTMA-проекту CIMMYT провiв широко-масштабну мультилокацiйну польову пере-вiрку, KASP-генотипування кожно! популя-ци й мета-аналiз QTL кiлькох популяцш [16]. Платформа KASP дала змогу генотипу-вати будь-яку кiлькiсть зразк1в з будь-якою кiлькiстю полiморфних SNP без необхщнос-тi розроблення конкретних мультиплексних наборiв. Також важливим моментом проекту е проведення етапiв генотипування так, щоб мати можливмть добору рослин до цвггшня для прискорення циклiв рекомбшаци.
Для S-типу цитоплазматично! чоловiчо! сте-рильностi (ЦЧС-S) кукурудзи характерним е часткове вiдновлення фертильносп, що ускладнюе !! комерцiйне застосування в се-лекцiйних програмах зi створення гiбридiв. Явище нестабiльностi фертильносп CMS-S контролюеться не основним геном-ввдновни-ком ядерно! фертильностi Rf3, а кшькома мiнорними QTL. Проведено сиквенування РНК та щентифшовано шiсть потенцшно асоцiйованих генiв у QTL з мшорними ефек-тами, що зумовлюють нестабiльнiсть фер-тильностi [17]. Результати сввдчать, що цi гени можуть бути залученi в такi бюлоичт процеси, як диференцiацiя органiв i регулю-вання розвитку квiтки, енергетичний мета-болiзм i бiосинтез вуглеводiв, що сприяе ввд-новленню фертильносп пилку в частинi рос-
лин. За допомогою KASP-маркерГв валгдова-ш SNP Гдентифшовано в двох потенцшних генах, асоцшованих з вГдновленням фер-тильностГ. Отримаш даш сприяють розумш-ню молекулярного мехашзму часткового вгд-новлення фертильностГ CMS-S у кукурудзи i, таким чином, дають можливГсть корегувати програми селекци.
Заболочування е важливим абютичним стресом, що призводить до значних втрат врожаю кукурудзи, вирощено! в швденнш та швденно-схГднш АзГ! через нерГвномГрний розподГл опадГв. Щоб компенсувати збитки, завдаш заболочуванням, найекономГчшшим варГантом е генетичне «додавання» толерант-ност: в сорти, як: широко культивують у щ-льових агроекологГчних зонах. У дослГджент [18] оцшено генетичну мшливгсть у популя-цГ! рекомбшантних шбредних лшш (Р1Л), отриманих вГд схрещування лшГ! CAWL-46-3-1, толерантно! до заболочування, та елино'!, але сприйнятливо! лшГ! CML311-2-1-3. Було ви-явлено значний дГапазон варГацГ! ознаки «врожайшсть зерна» шд впливом стресу заболочування. Р1Л генотипували, використо-вуючи KASP-маркери 331 SNP. Виявлено п'ять QTL на хромосомах 1, 3, 5, 7 i 10, як: разом пояснювали приблизно 30% фенотипо-во! дисперсГ! для ознаки «врожайтсть зерна». Серед 22 гешв-кандидапв з вгдомими функ-щональними доменами для шгстьох встанов-лено асощащю з анаеробними реакщями i для кукурудзи, i для шших модельних видГв. Для кожного з QTL була визначена пара флан-куючих SNP-маркерГв i розроблено маркерш тести високопропускно! здатност: для швид-ко! штрогресГ! толерантностГ до заболочування в програми селекци трошчно! кукурудзи.
За використання технологи KASP-гено-типування також дослгджено гени bm2 [19] та bm4 [20] ензимГв, пов'язаних з акумулящею та складом линшу, QTL, асоцшованих з мор-фолоиею корешв, акумулящею бюмаси та вмГстом фосфору в проростках [21].
Широкомасштабне визначення алелЬв е перспективним шдходом до «препарування» (розсГчення) природно! алельно! варГаци ге-шв-кандидапв, що контролюють основн аг-рономГчш ознаки. За допомогою широко геномного асощативного аналГзу (англ. genome-wide association study, GWAS) та шших тех-юк картування можна виявити функцю-нальн полГморфГзми [22]. CIMMYT викорис-товуе KASP-платформи для систематично! оцшки великих колекцш зародково! плазми щодо конкретних функцюнальних полГмор-фГзмГв. SNP або невелик шделГ (вставки-де-лецГ!), що були або дгагностичними, або тгс-
но зчепленими з такими полiморфiзмами, можуть бути використаш в KASP-платформi для оцшки велико! колекци зародково! плаз-ми, щоб вдентифшувати зразки зi сприятли-вими алелями в локуи(ах)-мшеш. Такий пiдхiд е особливо корисним, коли фенотипу-вання е або трудоммтким, або занадто дорогим для велико! шлькосп зразкiв, що рутинно скринуються в прикладних селекцш-них програмах.
Проведено GWAS для виявлення алелiв, пов'язаних з пiдвищеною стшшстю проти фузарюзно! гнилi, збудником яко! е гриб Fusarium verticillioides, у наборi 854 шбред-них лшш кукурудзи, оцiнених в трьох се-редовищах [23]. Виявленi 45 SNP та 15 гап-лотипiв, асоцшованих зi стiйкiстю, розташо-ванi всередиш або поряд з 38 генами-кандидатами, серед яких 21 був геном-кандидатом, пов'язаним з толерантшстю рослин до стре-сiв, включаючи стiйкiсть проти хвороб. Для перевiрки результатiв GWAS проведено кар-тування з використанням KASP-маркерiв 1250 SNP в чотирьох двобатьшвських попу-ляцiях та вдентифшовано QTL, пов'язанi з толерантнiстю до F. verticillioides. 1нтегращя результатiв обох аналiзiв показала вiсiм ло-куив на хромосомах 2, 3, 4, 5, 9 i 10. QTL на хромосомах 2 i 9 е новими. Цi результати сввдчать, що стiйкiсть проти F. verticillioides е складною ознакою, яка обумовлена дieю кiлькох генiв з незначними ефектами. Вне-сок добору за виявленими маркерами для посилення стшкосп е обмеженим; ^шмовГр-нiше, добiр для об'еднання «стшких» алелiв з малими ефектами в поеднанш з геномним добором на полненному фош як для ознаки штересу, так i ознак загально! адаптаци може бути плвдним для пiдвищення стшкос-ri кукурудзи проти F. verticillioides.
Результати дослвджень генiв стiйкостi проти збуднишв хвороб з використанням KASP-маркерiв представлено також у роботах [24-26].
У публшацп поточного року [27] проде-монстровано, як геномний добiр за техноло-гieю KASP-генотипування може привести до швидкого генетичного посилення посухото-лерантносп у кукурудзи. Бiлозерну лiнiю кукурудзи CML444, яку культивують в Аф-рищ, оскiльки вона е високопосухотолерант-ною, схрещено з двома елггними жовтозер-ними лiнiями, розробленими в Ази, -CML470 i VL1012767. Проведено генотипу-вання популяцiй з використанням 1214 KASP-SNP-маркерiв, за результатами якого створено двi посухотолерантнi лши зi збшь-шеною врожайнiстю зерна. Дуже показовим
результатом ще! роботи е також порiвняння ефективностi створення лшш з певними ознаками (зокрема поеднання високо! вро-жайностi зерна та посухотолерантност!) за використання пiдходiв традицшно! селекци (добiр за фенотипом) та молекулярно-гене-тичних методiв (добiр за маркерами). Для того, щоб розкрити потенщал генотипу рос-лини у разi використання звичайного само-запилення, тест-кросингу та оцiнки, необ-хiдно чотири сезони (два роки за наявносп теплиць). Використовуючи маркери, автори збагатили популяцiю щльовими алелями за один сезон. При цьому не було необхвдносп в стресовому чиннику. Отже, дослвдники об-^рунтували потенцiал швидкого генетичного полшшення сiльськогосподарських культур шляхом використання молекулярних маркерiв i довели !хню ефективнiсть у «зби-ранш» корисних генiв як альтернативу тра-дицiйнiй практицi селекцiонерiв.
Висновки
За даними огляду рiзноманiтних джерел шформаци, технологiя KASP-генотипування е, безумовно, високоточним та ефективним шструментом сучасно! генетики та селекци. Понад 200 видiв рослин i тварин генотипо-вано за щею технологieю. Опублiковано бшьш нiж 2 тис. наукових статей. Цю тех-нологiю успiшно використовують для досл^ дження генетично! рiзноманiтностi, генетич-но! спорiдненостi, структури популяцш, ви-значення генетично! iдентичностi, генетично! чистоти, перевiрки походження, карту-вання локусiв кiлькiсноi ознаки, визначення алелiв, маркер-допомiжного добору, маркер-допомiжноi селекцГ!. Доцiльним i своечас-ним е впровадження технолог11' KASP-генотипування в нашш кра!нi для виршен-ня широкого кола завдань сучасно! генетики, селекци, насшництва.
Використана литература
1. Semagn K., Babu R., Hearne S., OLsen M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement (Review). Mol. Breed. 2014-. Vol. 33, No. 1. P. 1-14. doi: 10.1007/s11032-013-9917-x
2. Mammadov J., Aggarwal R., Buyyarapu R., Kumpatla S. SNP markers and their impact on plant breeding. Int. J. Plant Genomics. 2012. Vol. 2012. Article ID 728398. doi: 10.1155/2012/728398
3. Melo A., Bartaula R., Hale I. GBS-SNP-CROP: a reference-optional pipeline for SNP discovery and plant germplasm characterization using variable length, paired-end genotyping-by-sequencing data. BMCBioinformatics. 2016. Vol. 17, Iss. 29. doi: 10.1186/s12859-016-0879-y
4. He C., Holme J., Anthony J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol. Biol. 2014. Vol. 1145. P. 75-86. doi: 10.1007/978-1-4939-0446-4_7
5. CLegg R. Förster Resonance Energy transfer - FRET what is it, why do it, and how it's done. FRET and FLIM Techniques. Series: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology / T. GadeLLa (Ed.). 2008. VoL. 33. P. 1-57.
6. How does KASP work. URL : https://www.Lgcgroup.eom/kasp/#. WQmLKkgVzcs
7. HenshaLL J., Hawken R., Dominik S., Barendse W. Estimating the effect of SNP genotype on quantitative traits from pooLed DNA sampLes. Genet. Sel. Evo I. 2012. Vol. 44. P. 1-12. doi: 10.1186/1297-9686-44-12
8. Maize genotyping Library. URL : https://www.Lgcgroup.com/ maize/#.WME_WEgVzcs
9. Chen W., Mingus J., Thompson S., KumpatLa S. DeveLopment of versatiLe gene-based SNP assays in maize (Zea mays L.). Mol. Breed. 2012. VoL. 29, No. 3. P. 779-790. doi: 10.1007/s11032-011-9589-3
10. Chen J., ZavaLa C., Ortega N. et aL. The deveLopment of quaLity controL genotyping approaches: A case study using eLite maize Lines. PLoS ONE. 2016. VoL. 11(6): e0157236. doi: 10.1371/ journaL.pone.0157236
11. Semagn K., Beyene Y., Makumbi D. et aL. QuaLity controL genotyping for assessment of genetic identity and purity in diverse tropicaL maize inbred Lines Theor. Appl. Gen. 2012. VoL. 125, No. 7. P. 1487-1501. doi: 10.1007/s00122-012-1928-1
12. Ertiro B., Ogugo V., Worku M. et aL. Comparison of Kompetitive ALLeLe Specific PCR (KASP) and genotyping by sequencing (GBS) for quaLity controL anaLysis in maize. BMC Genomics. 2015. VoL. 16:908. doi: 10.1186/s12864-015-2180-2
13. Ribeiro C., Pastina M., Guimaraes L. et aL. Genetic diversity and popuLation structure assessed by SNP markers in a paneL of maize inbred Lines. Resumos do 59 Congresso Brasileiro de Genética, 16-19.09.2013, ^guas de Lindóia, BrasiL.
14. Dao A., Sanou J., MitcheLL S. et aL. Genetic diversity among INERA maize inbred Lines with singLe nucLeotide poLymorphism (SNP) markers and their reLationship with CIMMYT, IITA, and temperate Lines. BMC Genetics. 2014. VoL. 15. P. 127-141. doi: 10.1186/s12863-014-0127-2
15. Tandzi L., Ngonkeu E. MoLecuLar characterization of seLected maize (Zea mays L.) inbred Lines. Maize Genom. Genet. 2015. VoL. 6, No. 2. P. 1-5. doi: 10.5376/mgg.2015.06.0002
16. Semagn K., Beyene Y., Warburton M. et aL. Meta-anaLyses of QTL for grain yieLd and anthesis siLking intervaL in 18 maize popuLations evaLuated under waterstressed and weLL-watered environments. BMC Genomics. 2013. VoL. 14, Iss. 313. doi: 10.1186/1471-2164-14-313
17. Su A., Song W., Xing J. et aL. Identification of genes potentiaLLy associated with the fertility instability of S-type cytopLasmic maLe steriLity in maize via buLked segregant RNA-Seq. PLoS ONE. 2016. VoL. 11, Iss. 9. e0163489. doi: 10.1371/journaL. pone.0163489
18. Zaidi P., Rashid Z., Vinayan M. et aL. QTL mapping of agronomic waterLogging toLerance using recombinant inbred Lines derived from tropicaL maize (Zea mays L.) germpLasm. PLoS ONE. 2015. VoL. 10, Iss. 4. e0124350. doi: 10.1371/journaL.pone.0124350
19. Tang H., Liu S., HiLL-Skinner S. et aL. The maize brown midrib2 (bm2) gene encodes a methyLenetetrahydrofoLate reductase that contributes to Lignin accumuLation. Plant J. 2014. VoL. 77, Iss. 3. P. 380-392. doi: 10.1111/tpj.12394
20. Li L., HiLL-Skinner S., Liu S. et aL. The maize brown midrib4 (bm4) gene encodes a functionaL foLyLpoLygLutamate synthase. Plant J. 2015. VoL. 81, Iss. 3. P. 493-504. doi: 10.1111/tpj.12745
21. Azevedo G., Cheavegatti-Gianotto A., Negri B. MuLtipLe intervaL QTL mapping and searching for PSTOL1 homoLogs associated with root morphoLogy, biomass accumuLation and phosphorus content in maize seedLings under Low-P. BMC Plant Biology. 2015. VoL. 15, Iss.172. doi: 10.1186/s12870-015-0561-y
22. Beissinger T., Hirsch C., Sekhon R. et aL. Marker density and read-depth for genotyping popuLations using genotyping-by-sequencing. Genetics. 2013. VoL. 193, Iss. 4. P. 1073-1081. doi: 10.1534/genetics.112.147710
23. Chen J., Shrestha R., Ding J. et al. Genome-wide association study and QTL mapping reveal genomic loci associated with Fusarium ear rot resistance in tropical maize germplasm. 3G: Genes. Genomes. Genetics. 2016. Vol. 6, Iss. 12. P. 3803-3815. doi: 10.1534/g3.116.034561
24. Jamann T., Poland J., Kolkman J. et al. Unraveling genomic complexity at a quantitative disease resistance locus in maize. Genetics. 2014. Vol. 198, Iss. 1. P. 333-344. doi: 10.1534/ genetics.114.167486/-/DC1
25. Horn F., Habeku A., Stich B. Linkage mapping of Barley yellow dwarf virus resistance in connected populations of maize. BMC Plant Biol. 2015. Vol. 15, Iss. 29. doi: 10.1186/s12870-015-0420-x
26. Nair S., Babu R., Magorokosho C. et al. Fine mapping ofMsv1, a major QTL for resistance to Maize Streak Virus leads to development of production markers for breeding pipelines. Theor. Appl. Genet. 2015. Vol. 128, No. 9. P. 1839-1854. doi: 10.1007/s00122-015-2551-8
27. Vivek B., Krishna G., Vengadessan V. et al. Use of genomic estimated breeding values results in rapid genetic gains for drought tolerance in maize. Plant Genome. 2017. Vol. 10, No. 1. doi: 10.3835/plantgenome2016.07.0070
References
1. Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., & Olsen, M. (2014). Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement (Review). Mol. Breed., 33(1), 1-14. doi: 10.1007/s11032-013-9917-x
2. Mammadov, J., Aggarwal, R., Buyyarapu, R., & Kumpatla, S. (2012). SNP markers and their impact on plant breeding. Int. J. Plant Genomics, 2012, Art. ID 728398. doi: 10.1155/2012/728398
3. Melo, A., Bartaula, R., & Hale, I. (2016). GBS-SNP-CROP: a reference-optional pipeline for SNP discovery and plant germplasm characterization using variable length, paired-end genotyping-by-sequencing data. BMC Bioinformatics, 17(29). doi: 10.1186/s12859-016-0879-y
4. He, C., Holme, J., & Anthony, J. (2014). SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol. Biol., 1145, 75-86. doi: 10.1007/978-1-4939-0446-4_7
5. Clegg, R. (2008). Förster Resonance Energy transfer - FRET what is it, why do it, and how it's done. In T. Gadella (Ed.), FRET and FLIM Techniques. Series: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, 33, 1- 57.
6. How does KASP work. Retrieved from https://www.lgcgroup. com/kasp/#.WQmlKkgVzcs
7. Henshall, J., Hawken, R., Dominik, S., & Barendse, W. (2012). Estimating the effect of SNP genotype on quantitative traits from pooled DNA samples. Genet. Sel. Evol., 44, 1-13. doi: 10.1186/1297-9686-44-12
8. Maize genotyping library. Retrieved from https://www.lgcgroup. com/maize/#.WM E_WEgVzcs
9. Chen, W., Mingus, J., Thompson, S., & Kumpatla, S. (2012). Development of versatile gene-based SNP assays in maize (Zea mays L.). Mol. Breed., 29(3), 779-790. doi: 10.1007/s11032-011-9589-3
10. Chen, J., Zavala, C., Ortega, N., Petroli, C., Franco, J. Burgueno, J., ... Hearne, S. (2016). The development of quality control genotyping approaches: A case study using elite maize lines. PLoS ONE, 11(6), e0157236. doi: 10.1371/journal. pone.0157236
11. Semagn, K., Beyene, Y., Makumbi, D., Mugo, S., Prasanna, S., Magorokosho, C., & Atlin, G. (2012). Quality control genotyping for assessment of genetic identity and purity in diverse tropical maize inbred lines. Theor. Appl. Gen., 125(7), 1487-1501. doi: 10.1007/s00122-012-1928-1
12. Ertiro, B., Ogugo, V., Worku, M., Das, B., Olsen, M., Labuschagne, M., & Semagh, K. (2015). Comparison of Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) and genotyping by sequencing (GBS) for quality control analysis in maize. BMC Genomics, 16(908). doi: 10.1186/s12864-015-2180-2
13. Ribeiro, C., Pastina, M., Guimarres, L., Guimaraes, P., Pacheco, C., Magalhaes, J., ... Guimaraes, C. (2013). Genetic diversity and population structure assessed by SNP markers in a panel of maize inbred lines. In 59 Congresso Brasileiro de Genética: materials. 16-19.09.2013, Águas de Lindóia, Brasil.
14. Dao, A., Sanou, J., Mitchell, S., Gracen, V., & Danquah, E. (2014). Genetic diversity among INERA maize inbred lines with single nucleotide polymorphism (SNP) markers and their relationship with CIMMYT, IITA, and temperate lines. BMC Genetics, 15, 127141. doi: 10.1186/s12863-014-0127-2
15. Tandzi, L., & Ngonkeu, E. (2015). Molecular characterization of selected maize (Zea mays L.) inbred lines. Maize Genom. Genet, 6(2), 1-5. doi: 10.5376/mgg.2015.06.0002
16. Semagn, K., Beyene, Y., Warburton, M., Tarekegne, A., Mugo, S., Meisel, B., Sehabiague, P., & Prasanna, B. (2013). Meta-analyses of QTL for grain yield and anthesis silking interval in 18 maize populations evaluated under waterstressed and well-watered environments. BMC Genomics, 14(313), 1-15. doi: 10.1186/14712164-14-313
17. Su, A., Song, W., Xing, J., Zhao, Y., Zhang, R., Li, C. ... Zhao, J. (2016). Identification of genes potentially associated with the fertility instability of S-type cytoplasmic male sterility in maize via bulked segregant RNA-Seq. PLoS ONE, 11(9), e0163489. doi: 10.1371/journal.pone.0163489
18. Zaidi, P., Rashid, Z., Vinayan, M., Almeida, G., Phagna, R., & Babu, R. (2015). QTL mapping of agronomic waterlogging tolerance using recombinant inbred lines derived from tropical maize (Zea mays L.) germplasm. PLoS ONE, 10(4), e0124350. doi: 10.1371/journal.pone.0124350
19. Tang, H., Liu, S., Hill-Skinner, S., Wu, W., Reed, D., Yeh, C., Nettleton, D., & Schnable, P. (2014). The maize brown midrib2 (bm2) gene encodes a methylenetetrahydrofolate reductase that contributes to lignin accumulation. Plant J., 77(3), 380392. doi: 10.1111/tpj.12394
20. Li, L., Hill-Skinner, S., Liu, S., Beuchle, D., Tang, H., Yeh, C., Nettleton, D., & Schnable, P. (2015). The maize brown midrib4
(bm4) gene encodes a functional folylpolyglutamate synthase. Plant J., 81(3), 493-504. doi: 10.1111/tpj.12745
21. Azevedo, G., Cheavegatti-Gianotto, A., Negri, B., Hufnagel, B., da Costa e Silva, L., Magalhaes, J., ... Guimaraes, C. (2015). Multiple interval QTL mapping and searching for PSTOL1 homologs associated with root morphology, biomass accumulation and phosphorus content in maize seedlings under low-P. BMC Plant Biol., 15(172). doi: 10.1186/s12870-015-0561-y
22. Beissinger, T., Hirsch, C., Sekhon, R., Foerster, J., Johnson, J., Muttoni, G., ... de Leon, N. (2013). Marker density and read-depth for genotyping populations using genotyping-by-sequencing. Genetics, 193(4), 1073-1081. doi: 10.1534/gene-tics.112.147710
23. Chen, J., Shrestha, R., Ding, J., Zheng, H., Mu, C., Wu, J., & Mahuku, G. (2016). Genome-wide association study and QTL mapping reveal genomic loci associated with Fusarium ear rot resistance in tropical maize germplasm. 3G: Genes. Genomes. Genetics, 6(12), 3803-3815. doi: 10.1534/g3.116.034561
24. Jamann, T., Poland, J., Kolkman, J., Smith, L., & Nelson, R. (2014). Unraveling genomic complexity at a quantitative disease resistance locus in maize. Genetics, 198(1), 333-344. doi: 10.1534/genetics.114.167486/-/DC1
25. Horn, F., Habeku, A., & Stich, B. (2015). Linkage mapping of Barley yellow dwarf virus resistance in connected populations of maize. BMC Plant Biol., 15(29), 1-13. doi: 10.1186/s12870-015-0420-x
26. Nair, S., Babu, R., Magorokosho, C., Mahuku, G., Semagn, K., Beyene, Y., ... Boddupalli, P. (2015). Fine mapping of Msv1, a major QTL for resistance to Maize Streak Virus leads to development of production markers for breeding pipelines. Theor. Appl. Genet., 128(9), 1839-1854. doi: 10.1007/s00122-015-2551-8
27. Vivek, B., Krishna, G., Vengadessan, V., Babu, R., Zaidi, P., Kha, L., ... Crassa, J. (2017). Use of genomic estimated breeding values results in rapid genetic gains for drought tolerance in maize. Plant Genome, 10(1), 1-8. doi: 10.3835/plantgenome 2016.07.0070
УДК 577.21:575.22:581.6
Волкова H. Э.*, Соколов В. М. Технология генотипирования KASPTM и ее использование в генетико-селекционных программах (на примере кукурузы) // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. 2017. Т. 13, № 2. С. 131-140. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.13.2.2017.105394
Селекционно-генетический институт - Национальный центр семеноводства и сортоизучения, ул. Овидиопольская дорога, 3, г. Одесса, 65036, Украина, "e-mail: natavolki@ukr.net
Цель. Сделать обзор публикаций, касающихся сути технологии генотипирования - конкурентной аллель-специфической полимеразной цепной реакции (англ. Competitive allele-specific PCR, в настоящее время имеет название Kompetitive Allele Specific PCR, KASPTM) и ее использования в различных генетико-селекционных направлениях исследований (на примере кукурузы). Результаты. Освещены суть технологии KASP-генотипирования, его преимущества. Представлены требования к матричной ДНК, так как успех KASP-анализа зависит от ее качества и количества. Приведены примеры глобальных проектов в области селекции растений для повышения урожайности, использующие технологию KASP-генотипирования. На примере кукурузы представлены результаты KASP-генотипирования и их внедрения в селекцию и семеноводство, в частности, для определения генетической идентичности, генетической чистоты, проверки происхождения, маркерного отбора и др. Продемонстрировано, как геномный отбор по технологии KASP-генотипирования может привести к быстрому генетическому усилению засухотолерантно-сти у кукурузы. Сравнением эффективности создания линий с определенными признаками (например, сочетание высокой урожайности зерна и засухотолерантности) при использова-
нии подходов традиционной селекции (отбор по фенотипу) и молекулярно-генетических методов (отбор по маркерам) доказано: для того, чтобы раскрыть потенциал генотипа растения при использовании традиционного самоопыления, тест-кроссинга и оценок необходимо четыре сезона (два года при наличии теплиц), в то время как при использовании маркеров популяцию обогатили целевыми аллелями за один сезон. При этом не было необходимости в стрессовом факторе. Выводы. Технология 1^Р-генотипирования является высокоточным и эффективным инструментом современной генетики и селекции, успешно используется для исследования генетического разнообразия, генетического родства, структуры популяций, определения генетической идентичности, генетической чистоты, проверки происхождения, картирования локусов количественного признака, определения аллелей, маркерного отбора, маркерной селекции. Целесообразным и своевременным является внедрение технологии 1^Р-генотипирования в нашей стране для решения широкого круга задач современной генетики, селекции, семеноводства.
Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм, технология КАБР™, генотипирование, кукуруза, молекулярный маркер.
UDC 577.21:575.22:581.6
Volkova, N. E.*, & Sokolov, V. M. (2017). KASPTM genotyping technology and its use in genetic-breeding programs (a study of maize). Plant Varieties Studying and Protection, 13(2), 131-140. http://dx.doi.Org/10.21498/2518-1017.13.2.2017.105394
Plant Breeding and Genetics Institute - National Center of Seed and Cultivar Investigation, 3 Ovidiopolska doroga Str., Odesa, 65036, Ukraine, "e-mail: natavolki@ukr.net
Purpose. To review publications relating to the key point of the genotyping technology that is competitive allele-specific polymerase chain reaction (which is called now Kompetitive Allele Specific PCR, KASPTM) and its use in various genetic-breeding researching (a study of maize). Results. The essence of KASP-genotyping, its advantages are highlighted. The requirements for matrix DNA are presented, since the success of the KASP-analysis depends on its quality and quantity. Examples of global projects of plant breeding for increasing crop yields using the KASP genotyping technology are given. The results of KASP genotyping and their introduction into breeding and seed production, in particular, for determining genetic identity, genetic purity, origin check, marker-assisted selection, etc. are presented using maize as an example. It is demonstrated how genomic selection according to KASP genotyping technology can lead to rapid genetic enhancement of drought resistance in maize. Comparison of the effectiveness of creating lines with certain traits (for example, combination of high grain
yield and drought resistance) using traditional breeding approaches (phenotype selection) and molecular genetic methods (selection by markers) was proved that it takes four seasons (two years in case of greenhouses) in order to unlock the potential of the plant genotype using traditional self-pollination, test-crossing and definitions), while using markers, the population was enriched with target alleles during one season. At the same time, there was no need for a stress factor. Conclusions. KASP genotyping technology is a high-precision and effective tool for modern genetics and breeding, which is successfully used to study genetic diversity, genetic relationship, population structure, genetic identity, genetic purity, origin check, quantitative locus mapping, allele mapping, marker-assisted selection, marker-assisted breeding. It is expedient and timely to introduce KASP genotyping technology in our country to solve a wide range of modern genetics, breeding, seed production tasks.
Keywords: single nucleotide polymorphism, KASPTM technology, genotyping, maize, molecular marker.
Hadiuuina / Received 10.04.2017 ÏozodœeHO do dpyny / Accepted 17.05.2017
