Аналіз тварин великої рогатої худоби за ISSR маркерами Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 575.113:636.03

Стефаненко М.С. ©, м.н.сп.,астрант, [email protected] 1нститут розведення i генетики тварин УААН, с. Чубинське, Бористльський р-

н, Кигвська обл

АНАЛ1З ТВАРИН ВЕЛИКО1 РОГАТО1 ХУДОБИ ЗА ISSR МАРКЕРАМИ

Аналiз генетичноi структури трьох nopid великог рогатоi худоби (червоноi польськог, бiлoгoлoвoí украгнськог, украгнськог чорно-рябог молочног) за ISSR маркерами показав можливкть гх використання для оцтки характеру мiжnopoднoí диференщацп.

Ключовi слова: велика рогата худоба, ISSR-ПЛР, праймер, мжросателти

Вступ. Останшм часом у роботах з дослщження мшливосп геному сшьськогосподарських тварин значний штерес викликають високопол1морфш дшянки ДНК, що представлен нуклеотидними тандемними повторами (з коровою одиницею повтору 2-4 нуклеотиди). Так зваш мшросателпш (SSR) послщовносп дисперговаш впродовж усього геному еукарют у склад1 гетерохроматину. Функщя мшросателтв до тепершнього часу залишаеться невстановленою, проте вщомо, що прост нуклеотидш повтори не несуть шформацп про структуру бшюв, але беруть участь в компактизацп хромосом i е «гарячими точками» кросинговеру та мутацшних подiй, що i визначае ix полiморфiзм.

1снуе декiлька молекулярно-генетичних методiв дослiдження мжросателтв, якi здебiльшого грунтуються на ix мультикопiйному синтезi в полiмеразнiй ланцюговiй реакцп (ПЛР). Генотипування тварин за мжросателпними локусами використовуеться для контролю ixнього походження [1], при цьому обов'язковим е знання первинноi послщовносп обраного мiкросателiта для пiдбору специфiчниx праймерiв i сучасних секвенаторiв, що дозволяють встановлювати розмiр амплiфiкованиx мжросателпних послiдовностей з точнiстю до 2 пар нуклеотидiв.

У 1994 рощ був запропонований новий методичнш пiдxiд:ISSR- InterSimple Sequence Repeat (швертоваш простi повторюванi послiдовностi), який належить до методiв полiлокусного типування бюлопчних об'ектiв [2]. Основу цiеi методики складае ПЛР, що проводиться з використанням як праймера мiкросателiтноi послщовносп з довшьним нуклеотидом на 5'- або 3'-кшщ. При цьому вщбуваеться амплiфiкацiя ДНК-фрагментiв, розташованих мiж швертованими послiдовностями мiкросателiта (як правило, це структурш i регуляторнi дiлянки гешв).

© Наук. кер1вник - к.с.-г.н. Метлицька О.1., 1нститут свинарства ím. О.В.Квасницького УААН Стефаненко М.С., 2009

205

Специфiчнiсть i висока вщтворюванють такого пщходу забезпечуеться великою довжиною використаного праймера (16-20 п.н) i точнiстю пiдбору температури його випалу (як правило, 54-620С) [2, 3].

ISSR-ПЛР маркери мають домшантний тип спадкування, проявляються на електрофореграмах у виглядi спектру смуг-амплiконiв (ISSR-профшь або фiнгерпринт), дозволяють одночасно оцшювати полiморфiзм десяткiв локусiв (до 30 i бiльше) за присутнiстю-вiдсутнiстю смуг певного розмiру i, таким чином, вважаються бiльш iнформативними для оцшки рiвня генетичного рiзноманiття генофондiв, шж локус-специфiчнi маркери.

Метод ISSR-ПЛР широко використовусться в роботах по таксономи i фшогени видiв, особливо в рослинницга [4], але вивченню особливостей генетично'1 структури рiзних видiв сшьськогосподарських тварин як на мiж-, так i на внутрiшньовидовому рiвнях присвячена обмежена кшькють наукових публiкацiй [5, 6, 7].

З метою вивчення особливостей генетичноi структури трьох порщ велико' рогатоi худоби (укра'нсько' чорно-рябо' молочно' з господарства «Шевченювське» Кшвсько' обл., бiлоголовоi укра'нсько' з господарства «Антонши» Хмельницько' обл. та червоно' польсько' з «ТараЫвки» Тернопiльськоi обл.) був проведений аналiз полiморфiзму фрагмешгв ДНК за ISSR - маркерами з використанням як праймерiв 2-х послщовностей тринуклеотидних мiкросателiтних повторiв.

Матер1али та методи

Для дослiдження використовували зразки венозноi кровi та сперми бугаiв украiнськоi чорно-рябо' молочно' (n=10), украiнськоi бiлоголовоi (n=21), червоноi польсько' (n=20) порiд. Видiлення ДНК проводили з використанням стандартного комерцшного набору «ДНК-сорб В» (для видiлення ДНК з кров^ i «ДНК-сорб А» (для видшення ДНК зi сперми) виробництва фiрми «Амплiсенс» (НД1 Епщемюлогп, Москва, Росiя), згiдно з рекомендащями виробника. Генотипування тварин проводили методом ISSR-ПЛР з використанням праймерiв (ACC)6G i (GAG)6C.

Для проведення полiмеразноi ланцюгово' реакци в роботi використовували реакцшну сумiш об'емом 10 мкл: H2O - 4.7 мкл, 5х буфер (15м Mg-1.0 мол) - 2.0 мкл; 10-х dNTP сумш (по 2мМ кожного) - 0.8 мкл; праймер (по 70 нг кожного) - 0.4 мкл; Taq-полiмераза (1мол/1000 U) - 0.1 мкл; ДНК 50-100 нг - 2.0 мкл.

Температурний режим ПЛР-амплiфiкацii був наступний: початкова денатуращя - 10 хв. при 95°С; 30 ци^в: денатурацiя - 30 с при 95 °С, випал праймерiв - 30 с при 60 °С, синтез - 30 с при 72 °С; термшальна елонгацiя - 20 хв. при 72 °С.

ПЛР-продукти роздшяли в пластинах 2% агарозного гелю методом електрофорезу в 1х ТВЕ- буфера Вiзуалiзацiю проводили на трансiлюмiнаторi в УФ свiтлi при довжиш хвилi 380 нм тсля забарвлення гелю етидieм бромiдом. Розмiри ДНК - продуктiв визначали за допомогою маркера молекулярних мас

206

GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder («Fermentas», Литва), детекщю результата проводили шляхом фотографування гел1в на цифрову камеру «Canon».

Результати дослщження.

Анал1з електрофоретичних спектр1в продукпв ампл1фжащТ посл1довностей ДНК, як1 фланковаш м1кросател1тними посл1довностями з р1зними тринуклеотидними повторами, дозволив ощнити Тх розм1р, а також в1дм1нн1сть i схожють розпод1лу цих посл1довностей у трьох порщ великоТ рогатоТ худоби. Отримаш спектри амплiконiв характеризували вiд 7 до 12-ти локусiв, залежно вщ використаного праймеру, а Тх довжина вартовала вiд 1950 до 200 п.н. Сумарно при використанш (GAG)6C i (ACC)6G праймерiв у трьох дослщжуваних породах iдентифiковано 53 амплжони.

У всiх дослiджуваних порiд спектри амплжошв, отриманих з рiзними праймерами, значно вiдрiзнялись один вiд одного (рис.1). Використання праймера (GAG)6C дозволяло отримати бшьш широкий спектр амплжошв порiвняно з праймером (ACC)6G.

За праймером (GAG)6C сумарний спектр амплжошв становив у трьох дослiджуваних порщ 33 ДНК-фрагменти, а за (ACC)6G праймером лише 20. Так, за (GAG)6C праймером у червоноТ польськоТ виявлено 11 локусiв, в украТнськоТ чорно-рябоТ молочноТ - 10, у бiлоголовоТ украТнськоТ - 12. Кiлькiсть смуг-амплiконiв, отриманих при використанш як праймера фрагмента мжросателггного локусу (ACC)6G, становила у червоноТ польськоТ 6, в украТнськоТ чорно-рябоТ молочноТ - 7, а у бшоголовоТ украТнськоТ - 7.

У червоноТ польськоТ за (GAG)6C праймером переважають спектри бшьшоТ молекулярноТ маси (1950 - 600 п.н.). У бшоголовоТ украТнськоТ i украТнськоТ чорно-рябоТ молочноТ порщ при використанш праймера структури (GAG)6C виявляються амплкони меншого розмiру (1500 - 240 п.н. i 600 - 240 п.н., вщповщно).

Рис. 1. Спектр продукта ампшфжацл (ISSR-ПЛР), отриманий при використанш як праймера фрагмента мжросателггного локусу а) (GAG)6C; б) (ACC)6G. Бшоголова украТнська порода. Дор1жки: 111 - продукти ампл1ф1кащТ; М - маркер молекулярних мас GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (Fermentas)

3000 2500 2000 1500 1000 900 800 700 600 500 400 300 200

loo_;

1 2 3 4 5 М 6 7 8 9

М 2 3 4 5 67 8 9 10 11

207

В результат використання праймера (ACC)6G у червоно! польсько! породи велико! рогато! худоби спостер^ався спектр продуктв амплiфiкацi! вщ 1800 п.н. до 500 п.н. В укра!нсько! чорно-рябо! молочно! розмiр фрагментв знаходився в межах вiд 950 до 200 п.н., а у бшоголово! укра!нсько! - вiд 950 до 300 п.н.

Сумарно найбшьшу кшьккть однакових за довжиною амплжошв у спектрах, отриманих з використанням двох праймерiв, виявлено при порiвняннi бiлоголово! укра!нсько! та укра!нсько! чорно-рябо! молочно! порщ, найменшу !х кшьккть виявлено в спектрi продуктiв амплiфiкацi! у червоно! польсько! i укра!нсько! чорно-рябо! молочно! порiд.

Червона польська i бiлоголова укра!нська породи за (GAG)6C праймером мають три однакових за довжиною амплжони, розмiр яких склав 1500, 900, 600 п.н., а у червоно! польсько! та укра!нсько! чорно-рябо! молочно! порщ однаковим за довжиною е фрагмент розмiром 600 п.н., у бшоголово! укра!нсько! та чорно-рябо! молочно! порщ спостер^али ствпадання амплiконiв з молекулярною масою 600, 550, 450,380, 240 п.н.

При використанш як праймера фрагмента мжросателпного локусу (ACC)6G червона польська порода велико! рогато! худоби мае однаковий за довжиною амплжон розмiром 750 п.н. з тваринами бшоголово! укра!нсько! i укра!нсько! чорно-рябо! молочно! худоби.

На основi розподiлу ДНК-фрагментв в спектрах, отриманих при використанш двох праймерiв у трьох породах, виявлено амплжони рiзно! довжини. Так, у червоно! польсько! породи виявлеш ушкальш фрагменти за (GAG)6C маркером розмiром 1950, 1700, 1300, 1250, 1200, 1100, 1050, 850 п.н., а за (ACC)6G праймером - 1200, 900, 600, 500 п.н. У бшоголово! укра!нсько! спостер^ались фрагменти, яю не зустрiчались в двох шших дослiджуваних популяцiях, а саме: за (GAG)6C праймером - 1000, 700, 500, 320, 280 п.н. За (ACC)6G праймером, тварини порщ бшоголова укра!нська i укра!нська чорно-ряба молочна мають амплiкони однаково! довжини, за винятком фрагментiв розмiром 600 п.н. у бiлоголово! укра!нсько! i 200 п.н. в укра!нсько! чорно-рябо! молочно! худоби.

Висновки

Використаш в дослiдi ISSR-праймери (ACC)6G i (GAG)6C е породоспецифiчними i можуть використовуватись як для оцшки внутршньопородних генетичних особливостей, так i мiжпородно! диференцiацi! велико! рогато! худоби. Висока шформатившсть застосованих маркерiв свiдчить про доцшьшсть проведення подальших дослiджень у цьому напрямку.

Л1тература

1. Metta Muralidhar. Genetic characterization of the Indian cattle breeds, Ongole and Deoni (Bos indicus), using microsatellite markers - a preliminary study / Muralidhar Metta, Sriramana Kanginakudru, Narasimharao Gudiseva, Javaregowda Nagaraju // Genetics. - 2004 - V. 5. - Р. 16 - 23.

208

2. Zietkiewicz E. Genome f ingerprinting by simple sequence repeat (SSR) -anchored polymerase chain reaction amplification / E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. - 1994. - V.20. - P. 176 - 183.

3. Bornet B. Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting /B. Bornet, M.Branchard // Plant Molecular Biology Reporter. - 2001. - № 19. - Р. 209-215.

4.Банникова А.А. Молекулярные маркеры и современная филогенетика млекопитающих / А.А. Банникова // Журнал общей биологии. - 2004. - Т. 65, № 4. - С. 278 - 305.

5. Метлицька О. ДНК-маркерш системи в селекци свиней / О. Метлицька, О.Ревенко, К. Копилова // Тваринництво Украши. - 2008. - №2. - С. 22 - 24.

6. Применение межмикросателлитного анализа ДНК (ISSR-фингерпринтинга) для оценки консолидированности и чистоты пород сельскохозяйственных животных / Г.Е. Сулимова, Ю.А.Столповский, Н.В. Кол и др.// 7-я международная научная конференция-школа «БиоТехЖ-2008». -Дубровицы. - 2008. - С. 75 - 83.

7. Mohammadabadi M.R. inter-Simple-Sequence Repeat (ISSR)-PCR for the identification of polymorphism in some native cattle breeds / M.R. Mohammadabadi, T.A. Kovalenko, M.R. Nassiri, G.E. Sulimova // Proceeding of the 3rd Moscow international congress: Biotechnology: state of the art and prospects of development. - Moscow, Russia. - 2005. - V. 1. - P. 282.

Summary

ISSR marker analysis of genetic structure of three cattle breed (Red Polish, White-Head Ukrainian, Ukrainian Black-and-White Dairy) is showed the ability of usage for character estimate of inter-breed differentiation.

Стаття надшшла до редакцИ' 14.04.2009

209