CC BY
54
УДК: 636.2.082:575.113.1
Добрянська М.Л., Копилов К.В., д.с.-г.н., Подоба Ю.В., к.с.-г.н., Вдовиченко Ю.В., к.с.-г.н., Копилова К.В., к.с.-г.н., с.н.с. ©
1нститут розведення i генетики тварин НААН, Чубинське
ГЕНЕТИЧНА СТРУКТУРА М'ЯСНИХ ПОР1Д ВЕЛИКО1 РОГАТО1 ХУДОБИ П1ВДЕННА М'ЯСНА, СИМЕНТАЛЬСЬКА ТА АБЕРДИН-АНГУСЬКА ЗА Р1ЗНИМИ ТИПАМИ ДНК-МАРКЕР1В
Проведено аналiз генетичног структури тварин великог рогатог худоби м 'ясного напрямку продуктивностi за полiморфiзмом гетв тиреоглобулту (TG), калпагну (CAPN1 530) та ISSR-PCR - маркерами. Виявлено особливостi генетичног структури тварин твденног м'ясног породи, симентальськог та абердин-ангуськог за полiморфiзмом фрагментiв ДНК, отриманих з використанням у якостi праймерiв 4-х фрагментiв три та динуклеотидних мжросателтних локуЫв (ACC)6G, (GAG)6C, (AG)9C, (GA)9C; встановлена наявтсть комерцтно-бажаних алелей за маркерами TG i CAPN1 530.
Ключоei слова: ДНК-аналiз, велика рогата худоба, ген, тиреоглобулт, калпагн, ISSR-PCR - маркерами.
М'ясне скотарство Укра!ни представлено 13 породами велико! рогато! худоби, з яких близько 47 % тварин складають абердин-ангуси i симентали [7]. У кра!нах i3 розвинутим тваринництвом активно проводяться дослщження на рiзних породах велико! рогато! худоби для виявлення гешв, що асощюються з показниками якост м'яса. В Укра!ш до тепершнього часу не проводилося генотипування втизняних тварин за генами, яю впливають на яюсш показники м'яса. Сучасш методи ДНК-генотипування дозволяють проаналiзувати поголiв'я за генами м'ясно! продуктивностi та виявити генетичну структуру м'ясних порiд для формуванш стад з бажаними ознаками м'ясно! продуктивности
До показникiв м'ясно! продуктивности якi широко використовуються у свт для оцiнки якостi м'яса, належать шжтсть i мармуровiсть. Кiлькiсною характеристикою шжносп м'яса е поперечна пружшсть м'язового волокна , яку пов'язують з дiею кальцiй-залежних проте!наз [1], що кодуються генами калпа!ну (CAPN) i калпастатину (CAST). Калпа!н-системи вельми чутливi до коливань рiвня юшв кальцiю, температури, рН, якi змшюються одразу пiсля забою. Бiльшiсть дослщниюв вказують на калпа!новi проте!нази, припускаючи, що нiжнiсть, це перш за все результат калпа!н-опосередковано! деградацi! мiофiбрил та цитоскелету клiтин [2, 3].
Мармуровють характеризуе кiлькiсть внутрiшньом'язового жиру, депонування якого контролюють багато гешв, серед яких найбшьш незалежним вщ породи i умов утримання е ген тиреоглобулiну (TG)[4, 5]. Тиреоглобулш (TG) - глiкопроте!новий гормон, вш синтезуеться в фолiкулярних клiтинах щитовидно!
© Добрянська М.Л., Копилов К.В., Подоба Ю.В., Вдовиченко Ю.В., Копилова К.В., 2011
112
залози та е попередником трийодтирошну (Т3) та тетрайодтирошну (Т4), якi вiдiграють важливу роль у ростi адипоцита, диференщаци й гомеостазi жирових вiдкладень [6].
На основi дослiджень полiморфiзму гешв CAPN1 i TG iноземними компашями розробленi комерцiйнi тест-системи для передбачення якiсних показникiв тушi тварин за ДНК-маркерами (GeneSTAR®Tenderness, IGENITY® Profile, GeneSTAR®Quality Grade). Цi панелi маркерiв апробоваш та рекомендованi до використання провщним науково-методичним центром з вивчення м'ясно! худоби (NBCEC, США), що складаеться з десяти мiжнародних органiзацiй тваринниюв. Перевiрка тест-систем щодо вiдповiдностi заявленим показникам проводиться на багатьох стадах i породах для виявлення ушфжованих методик оцiнки, в яких зведено до мшмуму вплив навколишнього середовища, умов утримання, годiвлi та шших факторiв, що можуть впливати на об'ектившсть результатiв перевiрки. Результати цих аналiзiв е загальнодоступними на веб-сайт (http://www.nbcec.org).
Таким чином, розробленi в останш роки молекулярно-генетичнi методи тестування за ДНК-маркерами надають можливiсть передбачити можливий рiвень генетично детермiнованих характеристик тварин i попередньо оцiнити генотип для вщнесення конкретно! тварини до певно! групи тварин визначеного напрямку використання з метою створення спецiалiзованих стад велико! рогато! худоби. Генотипування тварин за ДНК-маркером полягае у визначенш вiдповiдних алелей. При аналiзi популяцiй особливо! уваги також заслуговують методи, якi дозволяють тестувати одночасно велику кiлькiсть полiморфних локусiв, i таким чином, давати комплексну характеристику геномiв. Мiкросателiти - короткi послщовноси, якi повторюються по всьому геному - зручний шструмент для дослщжень генетично! структури i генетично! спорщненость Технiка ISSR-ПЛР дозволила значно збшьшувати кiлькiсть високоварiабельних генетичних маркерiв, яю застосовуються для внутрiпородного та мiжпородного аналiзiв.
Метою даного дослiдження е аналiз генетично! структури вiтчизняного поголiв'я велико! рогато! худоби м'ясного напрямку продуктивной за двома типами ДНК-маркерiв для розробки методологi! диференцiацi! тварин за показниками якост м'ясно! продукцп.
Матер1ал i методи. Аналiз ДНК тварин був проведений за зразками кровi вщ 35-ти тварин породи твденна м'ясна, 30-ти тварин породи симентал та 21-о! тварини породи абердин-ангус iз господарств ТОВ «Агрикор-Холдинг», ТОВ «Зеленопрське». ДНК видiляли сорбентним методом. Дослщження проводились методом ПЛР-ПДРФ з оптимiзацiею температурних та часових умови. Сумш для полiмеразно! ланцюгово! реакцi!: на 10 мкл ПЛР сумiшi було використано 4 мкл стерильно! деiонiзовано! води , 2 мкл 5-ти кратного буфера (250 mM KCL, 50 mM Tric-HCL (pH 8.3), 7,5 mM MgCl2), 1 мкл сум^ dNTP(по 2 mM кожного), сумш праймерiв 0,8 мкл, Taq -полiмераза 0,1 мкл, 2 мкл геномно! ДНК.
Для амплiфiкацi! гену тиреоглобулiну (TG) застосоваш праймери: TGf 5'-GGGGATGACTACGAGTATGACTG-3', TGr 5'- GTGAAAATCTTGTGGAGGCTGT-3'.
Довжина амплiфiкованого фрагменту складае 548 п.н. Для виявлення алельних варiантiв С i Т гена ТО продукт амплiфiкащl обробляли рестриктазою Р8и1.
Для амплiфiкащl гену калпа!ну САРШ 530 застосоваш праймери: САРМ 530Г 5'- ТСТТСТСАОАОААОАОСвСАО - 3', САРМ 530г 5'-СТОСвССАТТАСТАТСОАТС - 3'. Довжина амплiфiкованого фрагменту складае 341 п.н. Для виявлення алельних варiантiв А i О гена САРМ 530 продукт амплiфiкацil обробляли рестриктазою Р8у1.
Дослiдження генетично! структури ДНК за 188К-маркерами проводили з використанням в якостi праймерiв фрагментiв динуклеотидних i тринуклеотидних мкросател^них локусiв, а саме: (АСС)6О, (ОАО)6С, (АО)9С, (ОА)9С. В аналiз включали амплкони якi стабiльно вiдтворювалися не менш нiж у трьох процедурах ампшфшацл.
Результати 1 обговорення. Загалом за чотирма 188К-маркерами виявлено 54 амплiфiкованих фрагменти iз них 37 з використанням тринуклеотидних мкросател^них повторiв i 17 iз використанням двонуклеотидних мiкросателiтних повторiв; 21 iз них повторюеться у всiх дослiджених породах Найбшьша кiлькiсть амплiфiкованих фрагментiв була характерна для послщовност (ОАО)6С - 20, для (АСС)6О було виявлено 17 амплкошв, а для двонуклеотидних мкросател^них повторiв (АО)9С i (ОА)9С - було виявлено 9 i 8 амплiконiв вiдповiдно.
Для породи симентал за маркером (АО)9С було виявлено iндивiдуальний фрагмент розмiром 280 п.н., а у породи абердин-аргус за даним маркером, в порiвняннi з шшими породами, вщсутнш фрагмент амплiфiкацil розмiром 1050 п.н. За маркером (ОА)9С спектри фрагментiв у вах порiд були подiбнi, але пiвденна м'ясна порода вiдрiзнялась вщ iнших наявнiстю фрагменту розмiром 600 п.н., а в породi абердин-ангус вщсутнш фрагмент розмiром 1700 п.н..
За маркером, що представлений тринуклеотидним мiкросателiтним повтор (АСС)6О у породи абердин-ангус виявлеш два iндивiдуальних фрагменти - 390 i 470 п.н., у симентальсько! породи виявився iндивiдуальний амплiкон розмiром 320 п.н. Швденна м'ясна порода характеризувалась за даним маркером вщносно невеликою кiлькiсть стабшьно вiдтворюваних амплiфiкованих фрагментiв -всього 7.
У порiвняннi з iншими 188К-маркерами за маркером (ОАО)6С породи симентальська i пiвденна м'ясна характеризувалось найбiльшим числом амплiфiкованих фрагментiв 13 i 10, У абердин-аргуЫв за цим маркером кшькють амплiфiкованих фрагментiв була така як i при використаннi маркеру (АСС)6О, а саме 14 фрагмент. Також за маркером (ОАО)6С порода абердин-ангуська вiдрiзнялась наявнiсть iндивiдуального амплкону розмiром 220 п.н.
Загалом за вЫма чотирма 188Я-маркерами в породах абердин-ангуська i симентальська було отримано по 39 аплiфiкованих фрагментiв, а в породi пiвденна м'ясна - 32 фрагменти. Найбшьший дiапазон фрагменив спостерiгався за маркером (АСС)6О - вщ 210 п.н. до 1270 п.н., дещо менший, але з бшьшою кiлькiстю аплiфiкованих фрагментiв був характерний для маркеру (ОАО)6С вщ 180 п.н. до 950 п.н.. За маркером (ОА)9С аплiфiкованi фрагменти були сконцентроваш в промiжку мiж 330 п.н. i 600 п.н. за винятком фрагменту розмiром
1700 п.н. який спостер^ався в породах твденна м'ясна i симентальська. Подiбна картина спостер^алась при використанш маркеру (АО)9С - фрагменти сконцентрованi в iнтервалi вiд 280 до 520 п.н., а також в двох породах наявний фрагмент розмiром 1050 п.н. - це твденна м'ясна i симентальська.
Для визначення генотитв тварин велико! рогато! худоби за локусами кiлькiсних ознак (РТЬ), якi пов'язаш з генами м'ясно! продуктивностi, проведено тестування тварин за маркерами ТО i САРШ 530 генiв тиреоглобулiну та калпа!ну, результати якого представлен в таблицi.
Таблиця
Розпод1л алельних вар1ант1в гешв тиреоглобул1ну та калпаУну у велико*!
рогато*!* худоби порщ ^ твденна м'ясна, симентальська _ та абердино-ангуська.
Порода ВРХ Ген Генотип Частота генотипу Частота алеля Н0 Не ИБ
Швденна м ясна (п -35) те СС -18 СТ - 16 ТТ - 1 СС -0,514 СТ - 0,457 ТТ - 0,028 С - 0,742 Т - 0,257 0,457 0,383 -0,192
САРШ 530 вв - 21 АО - 9 АА - 5 ОО -0,600 АО -0,257 АА -0,142 О - 0,728 А - 0,271 0,257 0,397 0,352
Симентальська (п -30) те СС -9 СТ - 18 ТТ - 3 СС -0,3 СТ - 0,6 ТТ -0,1 С - 0,6 Т - 0,4 0,600 0,480 -0,250
САРШ 530 ОО - 2 АО - 17 АА - 11 ОО - 0,066 АО - 0,566 АА - 0,366 О - 0,35 А - 0,65 0,566 0,465 -0,244
Абердино-ангуська (п - 21) те СС -12 СТ - 9 ТТ - 0 СС -0,571 СТ - 0,428 ТТ - 0,0 С - 0,761 Т - 0,238 0,428 0,338 -0,266
САРШ 530 ОО - 16 АО - 5 АА - 0 ОО -0,761 АО -0,238 АА -0 О - 0,880 А - 0,119 0,238 0,211 -0,126
У локусi ТО найбшьший ступiнь гетерозиготностi спостерiгаeться в породi симентал, також в цш породi найбiльша частота комерцiйно бажаного алелю Т, але в той же час за маркером САРШ 530, який дозволяе виявити асощацш з нiжнiстю м'яса, в данш породi виявлено вiдносно невисоку концентращю бажаного алелю О (0,35). Тим не менше гетерозиготнiсть в даному локусi спостерiгаеться на достатньо високому рiвнi (0,566). Як видно iз таблицi, фактична гетерозиготнiсть перевищуе оч^вану, тобто iснуе надлишок гетерозигот, що несуть в своему генотипi алель О.
Дослiджена популяцiя пiвденно! м'ясно! породи за маркером ТО також характеризуеться високим рiвнем гетерозиготноси, незважаючи на невисоку частоту алелю Т (0,257). За маркером САРШ 530 в данш породi виявляеться велика кшьюсть тварин з генотипом ОО, вщповщно i висока частота алелю О.
При дослщженш популяцп абердин-ангуав було виявлено вщсутшсть тварин з генотипом ТТ за маркером TG, але гетерозиготшсть в даному локус спостеркалась на достатньо високому рiвнi (0,428) i фактична перевищуе очiкувану при низькiй частой алелю Т (0,238). При цьому за маркером CAPN1 530 в данш породi спостерiгаeться найбiльша частота алелю G (0,880).
Висновки.
Проведений порiвняльний аналiз полiморфiзму фрагментiв ДНК у трьох порiд велико! рогато! худоби при використаннi чотирьох ISSR-ПЛР - маркерiв показав, що спектри продукив амплiфiкацi! мають сво! особливоси, пов'язанi з обраним праймером. Породи вiдрiзнялися одна вiд одно! кшьюстю i розмiром амплiконiв, а !х розмiр варiював вiд 180 до 1700 п.н.
За результатами дослщження поголiв'я трьох порiд за ДНК-маркерами, пов'язаними з показниками м'ясно! продуктивност визначено частоту комерцiйно бажаного алелю Т (маркеру TG) на рiвнi 0,238 в породi абердин-ангус, 0,257 у породi пiвденна м'ясна та 0,400 у породi симентал. За маркером CAPN1 530 частоту бажаного алелю G на рiвнi 0,350 для симентальсько! породи, 0,728 - для породи твденна м'ясна та 0,880 для абердин-ангуав. Знайдеш певш особливостi генетично! структури трьох порщ. Отриманi в результатi дослiдження дат можливо використовувати при формуваннi стад iз певними ознаками м'ясно! продукцп.
У дослiдженнi, було виявлено, що за ДНК-маркерами пов'язаними з показниками продуктивности генетичт структури популяцiй велико! рогато! худоби породи твденна м'ясна i абердин-ангус мають певну схожють мiж собою. Можна припустити, що в деякш мiрi це пояснюеться селекцieю в напрямку м'ясно! продуктивности а дослiджена популяцiя сименталiв мае сво! особливост генетично! структури в зв'язку з тим, що в данш породi селекцiя довгий час була спрямована також i на молочну продуктивнiсть.
Л1тература
1. Calcinns, C.R., Seiderman, S.C. Relationships among calcium dependant protease, cathepsing B and H, meat tenderness and the response of muscle to aging // J. Anim. Sci. - 1988. - Vol. 66. - P.1186-1193.
2. Costello S. et al. Association of polymorphisms in the calpain I, calpain II and growth hormone genes with tenderness in bovine M. longissimus dorsi // Meat. Science. - 2007. - Vol. 75. - P. 551-557.
3. Page B.T. et al. Evaluation of single-nucleotide polymorphisms in CAPN1 for association with meat tenderness in cattle //J. Anim. Sci. - 2002. - Vol. 80. - P. 30773085.
4. Barendse W.J. et al. The TG5 thyroglobulin gene test for a marbling quantitative trait loci evaluated in feedlot cattle // Austr. J. Exp. Agricult. - 2004. -Vol.44. - P.66.
5. Casas E. et al. Assessment of single nucleotide polymorphisms in genes residing on chromosomes 14 and 29 for association with carcass composition traits in Bos indicus cattle // J. Anim. Sci. - 2005. - Vol. 83. - P. 13-19.
6. Barendse W.J. Assessing lipid metabolism. Int. Pat. Appl. WO99/23248. // World International Properti Organization. - Geneva:1999.
7. Державний племшний реестр. - 2009р. - Т.2. - 385с.
Summary
Dobrianska M.L., Kopylov K.V., Podoba Y.V., Vdovichenko Y.V., Kopylova K.V. The Institute of Animal Breeding and Genetics NAAN, Chubynske, Ukraine GENETIC STRUCTURE OF MEAT CATTLE BREEDS SOUTH MEAT, SIMMENTAL, ABERDEEN-ANGUS FOR DIFFERENT TYPES OF DNA
MARKERS
Were analyzed of genetic structure of beef cattle by DNA markers of genes thyroglobulin and calpain which associated with meat quality parameters, and ISSR-markers. Breed specific amplification fragments detected with microsatellits (ACC)G, (GAG)C, (AG)С, (GA)9C for breeds Southern Meat, Simmental and Aberdeen-Angus. Investigated polymorphisms of genes thyroglobulin (TG), associated with marbling meat and calpain (CAPN1 530), associated with the tenderness of meat. Were found the commercially desirable alleles for markers of TG and CAPN1 530 in cattle breeds Southern Meat, Simmental and Aberdeen-Angus from the holding companies "Agrikor-Holding" and "Zelenogirske".
Key words: DNA analysis, cattle, gene, thyroglobulin, calpain, ISSR-PCR -
marker.
Рецензент - д.с.-г.н., проф. Щербатий З.£.
