CC BY
25
• запровадити податкове стимулювання iнвестицiйних процес1в у галузi сiльського господарства;
• забезпечити квалiфiкований вiдбiр iнвестицiйних проектов для АПК;
• здiйснити перехвд до цiльового кредитування iнвестицiйних проектов на пiль-гових умовах;
• впровадити мехатзм залучення кошт1в населення до реал1заци швести-щйних проектiв в АПК.
Лггература
1. Сорока М.П. 1нвестицшна привабливють агропщприемництва. - Р1вне: Вид-во "Во-линська обласна друкарня", 2000. - 40 с.
2. Гайдуцький П.1. Аграрна реформа: на пороз1 реструкгуризацп// Агрошком. - 1997, № 8-9. - С. 10-21.
3. Doing business 2006, World Bank Report,// http://www. doingbusiness.org.
4. Гонгальский Д. Злачные капиталовложения// Инвестгазета. - 2003, № 8. - С. 7.
5. Клебан О.Л. Проблеми швестування в основний каттал сшьськогосподарських тд-приемств// Наук. вiсник ЛНАВМ iм. С.З. Гжицького. - 2003, т.7 (№ 4) ч. 1. - С. 252-256.
6. Марчак В. В 80 % случаев реформы проводятся в первые 15 месяцев новой власти// Инвестгазета. - 2005, № 38. - С. 9.
7. Зайцев I. Чарiвнiсть i привабливють// Контракти. - 2006, № 13. - С. 46-50.
УДК 575.8:582.632.2 Доц. Р. Т. Гут, канд. бюл. наук - НЛТУ УкраТни;
А. Дзялук, канд. наук - Ун-ет Казимира Великого в Бидгошi
ВСТАНОВЛЕННЯ ГЕНЕТИЧНОГО РВИОМАИГГТЯ В ПОПУЛЯЦП PINUS SYLVESTRIS L. ЗА ДОПОМОГОЮ ХЛОРОПЛАСТНИХ М1КРОСАТЕЛ1Т1В
Розглянуто результати SSR-aHanÏ3y молекулярно-генетичного внутршньовидо-вого полiморфiзмy сосни звичайно'1 на Львiвськомy Розточчь Вивчено характер розпо-д1лу ампшкошв, отриманих на основi мультиплексно'1 полiмеразно-ланцюговоï реакцп, складено'1 з 9 хлоропластних мшросател^них послiдовностей. Встановлено велику кiлькiсть гаплотитв, що вказуе на значну внутршньопопуляцшну мiнливiсть сосни.
Ключов1 слова: полiморфiзм, гаплотип, мiкросателiти.
Doc. R.T. Gout - NUFWT of Ukraine;
Dr. A. Dzialuk - Universytet Kazimierza Wielkiego w Bydgosczy
The study of genetic diversity in the population of Pinus sylvestris L.
using chloroplast microsatellites
The results of SSR-based analysis of intraspecific molecular-genetic polymorphism in P. sylvestris from L'viv Roztochya are presented. The pattern of distribution of ampli-cons obtained after multiplex PCR with 9 primer pairs specific to chloroplast microsatellites was studied. A large number of haplotypes was found, indicating the significant within-population diversity.
Keywords: polymorphism, haplotyp, microsatellites.
У тепер1шнш час особлива увага придшяеться питанню охорони бюлопч-ного р1зноманптя, зокрема видового i внутр1шньовидового складу деревних рос-лин люових екосистем, що тюно пов'язано з генетико-селекцшними роботами.
Рiзноманiтнi комбшаци гешв у межах кожного виду створюють великий набiр ознак, таких, як забезпечують його виживання i стшюсть у певних
умовах середовища. Цi комбшаци генiв успадковуються в наступних поко-лiннях, а при перехресному запиленш формуються також i новi генетичнi комбшаци, якi забезпечують адаптацiю виду до умов навколишнього середовища, що постiйно змшюються. Висока генетична полiморфнiсть деревних рослин, велика варiабельнiсть впливiв середовища на генотип, зумовлюють велику мiнливiсть дерев за енерпею росту та шшими ознаками i зумовлюють значнi трудношд в проведеннi всiх генетико-селекцiйних дослщжень та змен-шують 1х ефектившсть. У зв'язку з цим генетико-селекцшна оцiнка лiсових популяцiй з метою шдвищення комплексно! продуктивностi i бюлопчно! стiйкостi лiсiв, а також проблема вщбору дерев iз спадково закршленими гос-подарсько цiнними властивостями е вельми актуальними [1].
Генетична структура основних лiсотвiрних порiд в Укра1ш на цей момент вивчена дуже слабо. Вiдсутнi банки даних для щентифжаци генотипiв у популящях, на лiсонасiнневих дiлянках i плантащях, не складенi генетичнi карти плюсових та елiтних дерев. Основною причиною цього е вщсутшсть використання нових, простих i надiйних методiв отримання об'ективно! ш-формаци про генетичну рiзноманiтнiсть деревних рослин. Поряд з тради-цiйним селекцiйним методом вщбору дерев за фенотипом, на основi морфо-метричних показникiв, для виршення генетико-селекцiйних проблем набува-ють широкого використання методи молекулярно-генетичних маркерiв.
Впровадження сучасних технологш з використанням ДНК-маркерiв вiдкрие новi можливостi в люовш генетицi та селекци i е цшком необхiдним для 1х майбутнього розвитку, оскшьки дасть змогу дослщжувати мiж- та внутрiшньопопуляцiйну генетичну мшливють i структуру, встановлювати фь логенетичш зв'язки, вирiшувати питання систематики, будувати вiдповiднi генетичнi та фiзичнi карти, визначати локашзащю генiв у групах щеплення, клонувати !х, аналiзувати еволющю геномiв, вивчати генетику популяцiй та потж генiв у них, анашзувати системи схрещування у природних та експери-ментальних популяцiях [2-6]. На цей момент для вивчення зазначених вище процеЫв найбiльш широко використовують ДНК-маркери, як базуються на пбридизаци за Саузерном, полiмеразнiй ланцюговiй реакци (ПЛР) та !х поеднаннi. Метод амплiфiкацil ДНК за допомогою ПЛР позначив новий нап-рямок у методологи встановлення специфiчностi геномiв, дае змогу виявити полiморфiзм ДНК, що може використовуватися для анашзу мiж- та внут-ршньородово! та видово! мiнливостi [3, 6, 7]. У молекулярно-генетичних дослщженнях розрiзняють два основних варiанти ПЛР - коли полiморфiзм послiдовностей, що амплiфiкуються, пов'язаний з праймерами, яю фланку-ють гени з визначеною нуклеотидною послiдовнiстю (вивчаеться полiмор-фiзм вiдомих локусiв); коли вивчаеться полiморфiзм невiдомих локусiв i ви-користовуються праймери з випадковою нуклеотидною послщовшстю.
На цей момент багато люових генетикiв займаються пошуком нових мiкросателiтних послiдовностей та застосуванням ЗБЯ-методу для деревних видiв [6, 7]. При SSR-аналiзi мiшенню для ПЛР амплiфiкацil е тандемнi муль-тикопiйнi повтори ди-, три- та тетрануклеотидних послiдовностей (вiдомi також як мшросател^и). Мiкросателiти вважаються розповсюдженими, чисель-
ними та високо полiморфними маркерами, швидко оцiнюються за допомогою ПЛР, що робить привабливим ïx застосування для картування, а також ощнки генетичних параметрiв популяцiй дерев. Оскiльки нуклеотидш послiдовностi, якi оточують мiкросателiти, е консервативними, SSR-специфiчнi праймери можна легко створювати. Крiм цього, SSR-маркери потенцшно е багато-алельними i тому бшьш iнформативними. Виходячи з наведеного вище, для нас представляло значний штерес вивчити внутрiшньовидовий полiморфiзм в популяцп сосни на основi мжросателггних послiдовностей xлоропластiв.
Об'екти та методика. У нормальному насадженш штучного поход-ження (страдчанська популяцiя), вiком 110 роюв, розмiщеного у Львiвському Розточч^ було вiдiбрано 29 модельних дерев сосни рiзноï iнтенсивностi росту (плюсов^ нормальнi, мiнусовi). Усi модельнi дерева ютотно вiдрiзняються мiж собою за бюметричними показниками. У кiнцi серпня у кожного iз них було вщбрано по 10-20 г свiжоï xвоï. Зразки були очищенi вщ контамiнацiй, замо-роженi у рщкому азотi та зберiгалися в кельвiнаторi за температури -80 °С.
Видшення сумарноï ДНК проводили, використовуючи комерцшний набiр "Qiagen DNeasy Plant Mini Kit" фiрми "Qiagen", згiдно з настановою ви-робника. Концентрацiю ДНК визначали за допомогою фотометра ДНК UV 1101 (WPA), пiсля цього було приготовано розведення з концентращею 10 нг/мкл. Реакцiï мультиплекс ПЛР було проведено в об,емi 10 мкл з вико-ристанням приладу PTC-200 (MJ Research). У дослщженнях використано 9 мiкросателiтниx послiдовностей ДНК хлоропласлв: Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204 а також PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP102652. Для кожного мжросател^у 5' кiнець прямого праймера був мiчений специфiч-ним флуоресценцiйним барвником (Applera). Для спрощення, у цш статтi тер-мiн "локус" означае мюце знаходження мiкросателiтноï послiдовностi у хло-ропластнiй ДНК, у той час як "алель" належить до варiанту розмiру дано!" мж-росателггно1" послiдовностi. Оскiльки рекомбiнацiя у геномi xлоропластiв не вiдбуваеться, комбiнацiя "алелiв" у рядi "локусiв" хлоропластного ДНК кож-но1' особини вважаеться окремим гаплотипом. Реакцшна сумiш мультиплекс ПЛР мгстила 30 нг ДНК, 1х буфер ПЛР (Qiagen), 4 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTP, 25-250 нМ прямих i обернених праймерiв, 0.4 мкг/мкл BSA, а також 0.25 U ДНК полiмерази (Qiagen). Для приладу ПЛР застосовано таку програму: по-чаткова денатуращя за температури 94 °С протягом 5 хв, по^м 30 циклiв: 94 °C протягом 30 с, 50 °С протягом 1 хв i 72 °С протягом 1 хв., з завершен-ням реакцiï за температури 72 °С протягом 10 хв. Продукти ПЛР (1 мкл) змь шували з 9 мкл маркеру HD 400 ROX Size Standard (Applera) та аналiзували на автоматичному секвенаторi ДНК ABI Prism 310 (Applera). Розмiр фрагменпв ДНК описували за допомогою комп'ютерно1' програми GeneScan (Applera). Для кожного дерева було окреслено його гаплотип, що являв собою комбшацш ва-рiантiв розмiрiв дев'яти мiкросателiтниx послiдовностей xлоропластноï ДНК.
Визначення частот алелiв та гаплотишв i вiдповiдниx параметрiв гене-тичноï мiнливостi, а також аналiз молекулярноï варiацiï проводили за допомогою програми Arlequin 3.01 [8]. Ефективне число гаплотишв визначали за формулою ne = 1/(Xp ), де p - частота i-го гаплотипа в популяцп. Незмщену
генетичну рiзномаштшсть гаплотипiв визначали за формулою НЕ = (п/(п - 1)) (1 - !рг2), де п - кшьюсть особин в популяци, рг - частота г-го гаплотипа в по-пуляци. Коефщент Б 5Н визначали за формулою
Д4 =
I I п п
Г г.
к= 1
де: п - кiлькiсть проаналiзованих особин; Ь - кiлькiсть проаналiзованих локу-сiв; ак i аук- розмiр алелiв у к-му локусi в особин г та у.
Результати та обговорення. За допомогою SSR-маркерiв (ерЗБК), спе-цифiчних до мiкросателiтних повторiв у хлоропластнш ДНК, проведено ана-лiз популяци сосни звичайно! (всього 29 особин). Проаналiзовано 9 локусiв, в кожному iз яких виявлено вiд 2 (Р136480) до 7 (Р130204) алелiв (табл. 1).
Табл. 1. Показники отриманих фрагментiв при 88Я-аналЫв
Локус Алель Кшьшсть 1ндекс пол1морфноси (Р1С) Частота
103 3 0,103
РСР1289 104 24 0,299 0,828
105 2 0,069
105 8 0,276
Pt26081 106 19 0,49 0,655
107 2 0,069
111 24 0,828
РСР87314 112 3 0,304 0,103
113 2 0,069
РСР102652 114 28 0,067 0,966
115 1 0,034
124 6 0,207
125 7 0,241
Pt15169 126 10 0,78 0,345
127 3 0,103
128 3 0,103
РСР41131 135 26 0,186 0,897
136 3 0,103
Pt36480 141 3 0,184 0,103
142 26 0,897
140 1 0,034
141 7 0,241
142 12 0,414
Pt30204 143 5 0,769 0,172
144 1 0,034
145 2 0,069
146 1 0,034
168 4 0,138
Pt45002 169 15 0,981 0,517
170 7 0,241
171 3 0,103
Ус дослщжеш локуси е на 100 % полiморфними у дослiджуванiй популяцп. Р1С [Smith, 1997] (шдекс полiморфностi маркерних локусiв) дорiв-
нюе 0 - для мономорфних локуЫв, наближаеться до 1 - для високо полiмор-фних локусiв
Оскшьки геном хлоропластiв е гапло!дним i не пiдлягае рекомбшацп, то при генетичному аналiзi його необхiдно розглядати як единий локус. На основi аналiзу розподiлу гаплотипiв (комбiнацiй алелiв за рiзними локусами) виявлено надзвичайно високу !х рiзноманiтнiсть у страдчанськш популяци. Серед 29 дослiджених особин 25 дерев (86,2 %) мали ушкальш гаплотипи (табл. 2). Тшьки гаплотип (104/106/111/114/126/135/142/142/170) мав дещо вишу частоту i був виявлений у деревах № 19, 2', а гаплотип (104/ 106/ 111/ 114/ 126/ 135/ 142/ 142/ 169) - у деревах № 6', 1Н.
Для ощнки генетично! мшливосл дослщжувано! популяци на основi частот гаплотитв (табл. 2) визначено ряд параметрiв: пе (ефективне число гаплотитв) - 25,5; Не (незмiшена рiзноманiтнiсть гаплотипiв) - 0,995; п - (се-редне число попарних вщмшностей мiж гаплотипами) - 3,842; к - (середня генна мшливють; а також коефщент) - 0,427; О 5Н - (показник ощнки внут-ршньопопуляцшно! мiнливостi iз врахуванням особливостей мутацшного процесу мiкросателiтних повторiв) - 3,671.
Табл. 2. Характеристика гаплотитв досл'кджувансн популяци сосни ишчайнсн
№ з/п № дерева Гаплотип Кшьшсть Частота
1 7' 104-106-111-114-125-135-142-142-169 1 0,034
2 5' 104-105-111-114-126-135-142-142-169 1 0,034
3,12 19, 2' 104-106-111-114-126-135-142-142-170 0,069
4 4 104-106-112-115-124-135-141-141-170 1 0,034
5 14' 104-107-111-114-126-135-141-142-169 1 0,034
6 12' 104-106-111-114-127-135-142-146-169 1 0,034
7 10' 104-106-111-114-127-135-142-145-168 1 0,034
8 -7 104-106-111-114-126-135-142-141-169 1 0,034
9 2Н 104-106-113-114-125-135-142-142-171 1 0,034
10 4Н 104-106-111-114-125-135-142-145-168 1 0,034
11, 23 6',1Н 104-106-111-114-126-135-142-142-169 0,069
13 3' 104-106-111-114-124-135-142-143-171 1 0,034
14 2 104-105-111-114-128-135-142-143-170 1 0,034
15 -5 104-105-111-114-124-135-142-141-168 1 0,034
16 8' 105-106-111-114-125-135-142-142-170 1 0,034
17 1' 104-106-111-114-126-135-141-141-169 1 0,034
18 -1 104-105-111-114-125-135-142-140-169 1 0,034
19 8 104-106-111-114-126-135-142-144-170 1 0,034
20 11' 103-106-111-114-124-136-142-143-171 1 0,034
21 -2 105-105-111-114-126-135-142-143-169 1 0,034
22 13' 104-106-113-114-124-136-142-142-170 1 0,034
24 -6 103-106-112-114-124-136-142-141-169 1 0,034
25 5 103-105-111-114-128-135-142-141-169 1 0,034
26 9' 104-106-111-114-128-135-142-141-168 1 0,034
27 5 104-105-111-114-125-135-142-143-169 1 0,034
28 4' 104-107-112-114-127-135-142-142-169 1 0,034
29 -3 104-105-111-114-125-135-142-142-169 1 0,034
Всього 29 1
Висновок. Отримаш результати вказують на високий piBeHb генетич-но! мiнливостi всерединi страдчансько! популяци. Використання для щенти-фшаци та диференщацн гаплотипiв сосни мультиплексно! полiмеразно-лан-цюгово! реакцп на основi хлоропластних мiкросателiтних послiдовностей де-монструе високу ефективнiсть такого аналiзу i можливiсть його використання для шших генетико-селекцiйних дослiджень
Лiтература
1. Гончаренко ГГ., Силин А.Е. Популяционная и эволюционная генетика сосен Восточной Европы и Сибири. Минск: Технология. - 1997. - 192 с.
2. Dzialuk A., Burczyk J. Molekularne markery DNA jako narz^dzie badawcze genetyki drzew lesnych. Sylwan 8. - 2001. - 76-83.
3. Dzialuk A., Burczyk J. PCR-multiplex of six chloroplast microsatellites for population studies and genotyping in Pinus sylvestris. Silvaea Genetica 53. - 2005. - 5-6.
4. Prus-Glowacki W., Stephan B.R. Genetic variation of Pinus sylvestris from Spain in relation to other european populations. Silvae Genetica 43. - 1994. - 7-14.
5. Robledo J.J., Collada C., Alia R., Gil L. Genetic structure of montane isolates of Pinus sylvestris L. in Mediterranean refugial area. Journal of Biogeography 32. - 2005. - 595-605.
6. Vendramin G.G., Lelli L., Rossi P., Morgante M. A set of primers for the amplification of 20 chloroplast microsatellites in Pinaceae. Molecular Ecology 5. - 1996. - 595-598.
7. Vendramin G.G., Anzidei M., Medaghiele A., Sperisen C., Bucci G. Chloroplast microsatellite analysis reveals the presence of population subdivision in Norway spruce (Pices abies K.). Genome 43. - 2000. - 68-78.
8. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin ver. 3.0: An integrated softwarepackage for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: - 2005. - 47-50.
9. Smith J.S.C., Chin E.C.L, Shu H., Smith O.S., Wall S.J., Senior M.L., Mitchell S.E., Kre-sovich S., Ziegele J. An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zea mays L.): comparisions with data from RFLPs and pedigrees. Theor. Appl. Genet. 95. - 1997. - 163-173.
УДК 634.174. Сан. лтар С. О. Грицюк - СЕС Франшвського р-ну м. Львова;
проф. I.I. Даценко д-р мед. наук - nbsiscbK^ медичний ушверситет
M. Данила Галицького
ДЕЯК1 РЕЗУЛЬТАТИ КОМПЛЕКСНОГО МОН1ТОРИНГУ ЗА СТАНОМ ЯКОСТ1 ВОДИ БАСЕЙНУ Р1ЧКИ ДН1СТЕР
Розглянуто питання комплексного мошторингу за станом якосп води басейну р. Дшстер, яка забезпечуе не тшьки водопостачання населення Львiвськоi област та промислових ii об'екпв, але й впливае на еколопчну безпеку регюну. Для уникнення значного забруднення водного середовища запропоновано ефективну систему захо-дiв охорони поверхневих вод, яка полягае у суворому облшу джерел забруднення, недопущення скидання неочищених чи недостатньо очищених спчних вод, впровад-ження сучасних систем ефективного 1х очищення та знезараження.
Health-officer S.O. Grycyuk - sanitary-epidemiology station of
Frankivs'k district of L'viv; prof. I.I. Dacenko - L'viv medical university
of the name of Daniel Galyc'ki
Some results of the complex monitoring on the state qualities of water
of river basin Dnistr
The questions of the complex monitoring are examined on the state qualities of water of river basin Dnistr, which provides not only water-supply of population of the Lvov region
