CC BY
13
HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMem C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.15421/nvlvet8363 http://nvlvet.com.ua/
UDC 619:616.98 - 076:579.843.95
Suppression of cellular immunity factors by toxic fraction of supernatant of broth culture Pasteurella haemolytica
T.V. Masur, O.V. Yablonska
National University of Life end Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
Masur, T.V., & Yablonska, O.V. (2018). Suppression of cellular immunity factors by toxic fraction of supernatant of broth culture Pasteurella haemolytica. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 20(83), 314-319. doi: 10.15421/nvlvet8363
In the etiology of many infectious animal diseases, Pasteurella haemolytica belongs to a specific place. An important factor in the pathogenicity of this microorganism, like the Pasteurella multocida serotype D, is the thermostable exotoxin. It can be obtained from bacterial-purified culture fluid. Although the study of toxin formation among microorganisms is quite popular, however, the features of toxin formation in hemolytic pasteurals, depending on the virulence of the pathogen, the nature of the toxic effects of these objects in vivo remain unclear. Materials for research were 16 isolates of Pasteurella haemolytica, isolated from pathological and biological material obtained during the outbreaks of respiratory pathology in farm animals. Initially, the nature of the research concerned the establishment of the potential for toxin formation in the isolates obtained. The method provided for a comparative analysis of the DNA nucleotide sequences of each of the investigated isolates P. haemolytica and information obtained from the international database. Another part of the work concerned the actual allocation of the major groups of toxic components of Pasteurella haemolytica by extraction to determine their biochemical nature. Exotoxin isolation was carried out from the Pasteurella spp. The components of the sediment and supernatant were separated by ion exchange chromatography on TSK gels. In order to detect the harmful effects of toxin hemolytic pasteurals on the body, they used the method of determining the opsonic index (the ratio of the phagocytic number in the mixture without the products of toxic fractions to the mixture with the toxin-containing fraction). It has been established that an important factor of the pathogenetic effect in Pasteurella haemolytica is the toxic fraction. Electrophoregram analysis of the results of DNA amplification in a comparative aspect with the data of standard samples helped to determine the presence of elements of the genome, which indicate the potential for toxin formation in isolated hemolytic pasteurized isolates from the test material. Toxic fractions isolated from Pasteurella haemolytica broth culture supernatant are substances of protein-carbohydrate nature. The isolated peak toxicogenic fractions of dialysate of a bacterial culture sieve contained protein and carbohydrates within the limits of 12.5-20 pg / ml and 0— 20 pg/ml, respectively. In the dialysate of the broth culture supernatant, where 5 groups of toxigenic fractions were identified, the content of protein and carbohydrates in them varied, respectively, in the range from 20 to 95 pg/ml and from 3.3 to 26.62 pg/ml. At reproduction of opsono-phagocytic reaction with participation of toxigenic fractions of hemolytic pasteurel, a sufficiently expressed immunosuppressive effect of these complexes on the body of warm-blooded substances with an opsonic index of 3 ± 0.03 was established. During further research it is planned to determine the dermal necrotic and lethal effects of the isolated toxicogenic fractions of hemolytic pasteuride on the body of warm-blooded ones.
Key words: Pasteurella haemolytica, toxic fraction, broth culture supernatant, DNA, opsonic index.
Супреая клггинних фактор1в iMyHireTy токсичною фракщею супернатанту бульйонно'1 культури Pasteurella haemolytica
ТВ. Мазур, О.В. Яблонська
Нацюнальний yuieepcumem бюресурав i природокористування Украти, м. Кшв, Украна
Article info
Received 29.01.2018 Received in revisedform
01.03.2018 Accepted 08.03.2018
National University of Life end Environmental Sciences of Ukraine, Polkovnik Potechin str., 16, Kyiv, 03048, Ukraine. Tel.: +38-097-512-90-05 E-mail: doktorvet67@ukr. net
Встановлено, що важливим фактором патогенетичного впливу у Pasteurella haemolytica, е токсична фракщя. Аналiз елек-трофореграми результатiв амплiфiкування ДНК в порiвняльному аспектi з даними стандартних зразтв допомогли встанови-ти наявтсть елементiв геному, ят вказують на потенщйну здаттсть до токсиноутворення у видшених з до^джуваного матерiалу iзолятiв гемолтичног пастерели. Токсичт фракцп, видмет iз супернатанту бульйонног культури Pasteurella haemolytica, являють собою речовини протегново-вуглеводног природи. Видтеж пiковi токсигенж фракцп дiалiзату осаду бак-тершно'г культури мктили в собi бток та вуглеводи в межах вiдповiдно 12,5-20 мкг/мл та 0-20 мкг/мл. В дiалiзатi супернатанту бульйонног культури, де було визначено 5 груп токсигенних фракцш, вмкт в них бшка та вуглеводiв коливався вiдповiдно в межах вiд 20 до 95мкг/мл та 3,3 до 26,62мкг/мл. При вiдтвореннi опсоно-фагоцитарногреакцггзаучастi токсигенних фракцш гемолтичног пастерели встановлена достатньо виражена шуносупресивна дiя цих комплек^в на оргатзм теплокровних при опсожчному тдекЫ 3 ± 0,03.
Ключовi слова: Pasteurella haemolytica, токсична фракщя, супернатант бульйонног культури, ДНК, опсожчний тдекс.
Вступ
В етюлогп багатьох шфекцшних хвороб тварин певне мюце належить Pasteurella haemolytica (Abdullah et al., 1990; Whiteley et al., 1990; Sharif et al., 2005; Poyelson et al., 2007). Важливим фактором пато-генносп цього мжрооргашзму, под1бно як i у Pasteurella multocida серотипу Д, е термостабшьний екзотоксин. Його можна отримати з очищено! вщ бактерш культурально! рщини.
Для iзолятiв, що типуються як Pasteurella multocida серотипу Д, виявлена корелятивна залежшсть мiж синтезом токситв та вiрулентнiстю штаму. Токсин проявляе дермонекротичну даю при внутршньо-шшрному тест у поросят-вцщученщв, токсичну даю на культурi клгган легень ембрюшв ВРХ та летальну даю при внутршньочеревинному введенш бшим мишам. Крiм того, ведомо, що термолабiльний екзотоксин P. multocida типу Д тсля введения тваринам на 14-ту добу здатен викликати змiну картини кровi i пригнiчувати синтез P-лiмфоцитiв, ввдповщальних за формування гуморально! 1мунно! вщповвд. Також встановлено, що термолабiльний токсин серотипу Д пастерел складаеться з 3-х компонента, один з яких iмунологiчно подiбний до аналогiчного термостабшь-ного токсину B. bronchiseptica (Clinkenbeard et al., 1989; Majury and Shewen, 1991; Abdullah et al., 1992; Clinkenbeard et al., 1994; Basaraba et al., 1999; Sun et al., 1999; Radi et al., 1999; Shevtsov et al., 2007).
Бактерiальнi токсини у вражаючих концентращях здатш викликати значну запальну реакцiю шкiри, гiперемiю селезiнки, некроз лiмфо!дних елементiв, а в судинах - тромбоз та шваскулярну коагуляцш, ко-лапс та збагачення гемоглобшом !х стiнок (Townsend et al., 2000; Poermadjaja and Frost, 2000).
Окремi дослвдники на пiдставi визначення дп ток-синiв пастерел на альвеолярш макрофаги свиней роб-лять висновок, що вони не вщграють вирiшальну роль в патогенезi ензоотично! пневмони у цих тварин (Schboss, 1987; Reinhold et al., 2002). Хоча дослвджен-ня питання токсиноутворення серед мiкроорганiзмiв е досить популярним, проте особливостi токсиноутво-ренння у гемолггачно! пастерели в залежностi ввд вiрулентностi збудника, характеру прояву токсично! дп цих об'ектiв in vivo залишаються не з'ясованими.
Матерiал i методи досл1джень
Матерiалом для дослщжень були 16 iзолятiв Pasteurella haemolytica, видшеш з патологiчного та бюло-
гiчного матерiалу, отриманого при спалахах патологi! респiраторного характеру у альськогосподарських тварин. Спочатку характер дослщжень стосувався встановлення в отриманих iзолятiв потенцiйно! здат-ностi до токсиноутворення. Метод передбачав прове-дення порiвняльного аналiзу нуклеотидних послщов-ностей ДНК кожного з дослщжуваних iзолятiв P. haemolytica та шформацп, отримано! з мiжнародно!' бази даних за допомогою програмного забезпечення «Vector NT 1» v. 8.0. (Informax). Праймери, викорис-таш в дослвдженнях, були виготовленi фiрмою «.i-тех».
При розрахунку специфiчних олiгонуклеотидних праймерiв були використанi послщовносп ДНК пастерел, якi зареестроваш в мiжнароднiй базi даних сиквенав генiв GenBank. Вiн е частиною мiжнародно-го проекту International Nucleotide Sequence Database Collaboration.
Матерiал з ДНК польових iзолятiв пастерел отри-мували наступним чином. У пробiрки об'емом 1,5 мл (типу «еппендорф») вносили по 100 мкл промито! ЗФР 36-ти годинно! бульйонно! культури бактерiй. В уа пробiрки, за допомогою окремих наконечнишв з аерозольним бар'ером, додавали по 300 мкл лiзуючо-го буферу, що мютив 6М гуашдинтющанату, та рете-льно перемiшували на вортексг Пробiрки прогрiвали 5 хв. при 65 °С, !х вмют ретельно перемiшували на вортексi до повного розчинення матерiалу та центри-фугували при 5х103 об/хв. протягом 5 секунд. У кож-ну пробiрку вносили по 30 мкл. сорбенту сшлкагелю, знову перемшували на вортексi 10-15 секунд та за-лишали при шмнатнш температурi на 2 хвилини до повного осадження сорбенту, тсля чого ще раз пере-мiшували i ввдстоювали 5 хвилин.
Сорбент осаджували у пробiрках за допомогою мь кроцентрифуги при 5х103 об/хв протягом 30 секунд та тричi промивали один раз лiзуючим розчином по 300 мкл i двiчi по 500 мкл вщмиваючим розчином (70% етанол, 100 мМ №С1 i 10 мМ Tris-На, рН 8.0). Шсля видалення супернатанту, осад сорбенту вису-шували при ввдкритих кришках пробiрок у термостатi при 65°С протягом 5-7 хв. (до повного випаровування спирту) та до кожно! пробiрки вносили по 50 мкл ТЕ-буферу (рН 8,0) для елюювання ДНК. Елюювання проводили в термостал при 65 °С протягом 5-6 хвилин, ретельно перемiшуючи на вортекс кожну хвили-ну. Пiсля елюювання сорбент осаджували центрифу-гуванням при 12*103 об/хв протягом 1-2 хвилин та вщбирали супернатант, який мiстив необхвдну для подальшо! роботи очищену ДНК.
Для вiдтвoрeння влacнe ПЛР гoтyвaли тaк звaнi «вeрxню» тa «нижню» рeaкцiйнi cyмiшi. Для приготу-вaння «нижньoï» рeaкцiйнoï cyмiшi в oднiй прoбiрцi змiшyвaли пo 2,5 мкл. прaймeрiв тa нyклeoтидiв (кЦн-цeвa кoнцeнтрaцiя кoжнoгo прaймeрy - 25-З0 рMoль/зрaзoк) нa кoжнy ^o6y з yрaxyвaнням тон-трoльниx ^o6. Пicля змiшyвaння нa вoртeкci, в мЦк-рoпрoбiрки oб'eмoм 0,5 cм3 рoзкaпyвaли пo 5 мкл cyмiшi нyклeoтидiв з прaймeрaми, oбeрeжнo нaшaрo-вyвaли пo 10 мкл. рoзтoплeнoгo при тeмпeрaтyрi 95° вocкy дo пoвнoгo пoкриття вcieï пoвeрxнi.
Для пригoтyвaння «вeрxньoï» рeaкцiйнoï cyмiшi, кoмпoнeнти змiшyвaли в oб'eмax з yрaxyвaнням кшь-кocтi дocлiдниx прoб, включaючи кoнтрoльнi. Haбiр тa кiлькicть викoриcтaниx нa oднy прoбy кoмпoнeнтiв пoдaнi в тaблицi 1.
Таблиця 1
Об'ем кoмпoнeнтiв «вeрxньoï» ПЛР cyмiшi та oднy прoбy
Кoмпoнeнт ПЛР-cyмiшi-2 Об'ем рoзчинy, мкл
5-x ПЛР буфер 10,0
50 мЫ MgS04 3,0
HjO 6,0
Taq-пoлiмeрaзa 1,0
Ha пoвeрxню зacтиглoгo вocкy внocили пo 10 мкл. «вeрxньoï» рeaкцiйнoï cyмiшi тa та двi крaплi вaзeлi-нoвoï oлiï. ПЦд oлiю, y вiдпoвiднocтi дo мaркyвaння прoбiрoк, внocили пo 10 мкл. дocлiдниx aбo rampo-льниx ДНК. В якocтi нeгaтивнoгo кoнтрoлю шплЦфЦ-кaцiï викoриcтoвyвaли ДНК Escherihia coli, ДНК Salmonella typhimurium тa ДНК coмaтичниx клггин cвинi, вЦвцЦ тa вeликoï рoгaтoï xyдoби.
о 00 (N
В cтeрильнi цeнтрифyжнi прoбiрки нaливaли i рe-тeльнo пeрeмiшyвaли 0,1 мл 2%-го рoзчинy цитрaтy нaтрiю тa 0,1 мл крoвi крoля. Дaлi дo ^eï cyмiшi юэм-пoнeнтiв дoдaвaли 0,1 мл 2 млрд. зaвиci aгaрoвoï ку-льтури бaктeрiй Pasteurella haemolytica. В Цншу ^o-
ПЛР прoвoдили нa тeрмoциклeрi «Teрцик» в рe-жимЦ aктивнoгo рeгyлювaння згiднo прoгрaми.
Iншa чacтинa рoбoти cтocyвaлacь влacнe видiлeння ocнoвниx груп тoкcичниx кoмпoнeнтiв Pasteurella haemolytica шляxoм eкcтрaгyвaння для з'яcyвaння ïx бioxiмiчнoï прирoди.
Видiлeння eкзoтoкcинy прoвoдили з кyльтyрaльнoï рЦдини Pasteurella spp. Культуру вирoщyвaли нa м'яcнoмy бyльйoнi прoтягoм 18 гoд. Клггини видaля-ли шляxoм цeнтрифyгyвaння при 5000 g прoтягoм 30 xв. З oдeржaнoгo cyпeрнaтaнтy бшки ocaджyвaли cyльфaтoм aмoнiю, дoдaючи cyxy ciль дo 60% таст-чeння пЦд кoнтрoлeм рН. Витримyвaли cyмiш прoтя-гoм точЦ при 4 °С. Пoтiм cyмiш цeнтрифyгyвaли при 5000 g прoтягoм 30 xв. OcaA збирaли тa рoзчиняли y трирaзoвoмy oб'eмi 3 M cyльфaтy aмoнiю. У cyпeрнa-тaнтi тa ocaдi визнaчaли шлькють бiлкa. Бyлo падгото-влeнo 5 зрaзкiв: кyльтyрaльнa рiдинa, cyпeрнaтaнт (5,15 мг/мл), cyпeрнaтaнт дiaлiзoвaний (1,025 мг/мл), ocaд (0,575 мг/мл) тa ocaд дiaлiзoвaний (0,25 мг/мл). Бiлoк визнaчaли мeтoдoм Лoyрi. Cклaдoвi кoмпoнeнти oca^ тa cyпeрнaтaнтy рoздiляли шляxoм ioнooбмiн-нoï xрoмaтoгрaфiï нa TSK-гeляx.
Ioнooбмiннy xрoмaтoгрaфiю ocaдy прoвoдили нa кoлoнцi (2x35 cм) Fractogel DEAE-650-s «Merck», Hiмeччинa, yрiвнoвaжeнy 0,01 M Трта-HCl бyфeрoм рН 7,0. Зрaзoк (12 мл, 30 мг бшга) тата^ли нa кoлoн-ку, eлюцiю прoвoдили лшшним грaдieнтoм NaCl (01 M, та 150 мл) зЦ швидкicтю 24 мл/гoд (риc. 1). Oб'eднyвaли фрaкцiï двox oдeржaниx тшв тa пeрeвi-ряли ïx го^ичну дЦю. З мeтoю виявлeння шкoдoчин-нoгo впливу тoкcинy гeмoлiтичнoï пacтeрeли нa oргa-нЦзм cкoриcтaлиcь мeтoдикoю визнaчeння oпcoнiчнo-гo iндeкcy (вiднoшeння фaгoцитaрнoгo чиcлa y cyмiшi бeз прoдyктiв тoкcичниx фрaкцiй дo cyмiшi з тoкcи-нoвмicнoю фрaкцieю).
бЦрку з пoдiбними кoмпoнeнтaми дoдaвaли 0,1мл шв-нoï фрaкцiï тoкcинoмicниx рeчoвин, видiлeниx Цз cy-пeрнaтaнтy бульгонто!' культури Pasteurella haemolytica. Cyмiшi o6ox прoбiрoк витримyвaли 30 xвилин в тeрмocтaтi при 37 °C, a штЦм цeнтрифyгyвa-
Рис. 1. Ioнooбмiннa xрoмaтoгрaфiя ocaдy нa Fractogel DEAE-650-s y ipa^em! NaCl 0 - 1 M
ли, ввдбирали тпеткою верхнш шар осаду, що скла-дався з лейкоципв.
На достатньо знежирених скельцях готували мазки, висушували ïx, фжсували сумшшю НЫфорова протягом 20 хвилин, попм фарбували за методом Романовського-Лмза. Щд мжроскопом тдраховували кшьшсть бактерш, фагоцитованих нейтрофшами в кшькох полях зору у пробах за присутносп фракцш з токсинами так i без них.
1онообмшну хроматографш супернатанту проводили на колонщ (3,5x40 см) Fractogel DEAE-650-m «Merck», Шмеччина, урiвноважену 0,01 М Трис-НС1 буфером рН 7,0. Зразок (15 мл, мг бiлка) наносили на колонку, елюцш проводили лiнiйним гращентом NaCl (0-1 М, по 150 мл) зi швидк1стю 30 мл/год (рис. 2).
Рис. 2. 1онообмшна xроматографiя супернатанту на Fractogel DEAE-650-m у гращенп NaCl 0-1 М
Об'еднували фракцп одержаних пiкiв та перевiря-ли ïx токсичну дiю в опсоно-фагоцитарних реак^х.
Результати та ïx обговорення
З метою встановлення факту схильносп до токси-ноутворення в iзолятiв гемолiтичноï пастерели за допомогою ПЛР було проведено пошук осередкiв геному, яш кодують дану властивiсть бактери.
Порiвняльний аналiз нуклеотидних послщовнос-тей ДНК дослщжених штамiв пастерел i розрахунок олiгонуклеотидниx праймерiв виконували за допомогою програмного забезпечення «Vector № TI» v.8.0 (Infor Max).
Запуск програми та встановлення пробiрок проводили пiсля досягнення термоциклером температури 93°С («гарячий старт»). Дослщження та аналiз проду-ктiв амплiфiкацiï проводили методом роздiлення фрагмента ДНК в 1,5% гелi агарози «ИА». До розплав-леноï агарози, оxолодженоï до 55-60 °С додавали 25 мкл. розчину бромистого етидш та перемiшували. Отриманий гель заливали у форму (товщиною 56 мм) та за допомогою гребшок робили лунки для внесення зразк1в (табл. 2).
У випадках, коли реакцiйна сумш ПЛР вже мiсти-ла глщерин та ксиленцiанол в якостi маркерного бар-вника, зразки, що дослвджувались, вносили безпосе-редньо в лунки. Смуги гелю розмiщували в електро-форетичнiй камерi лунками в напрямку до негативного електроду та в середш лунки вносили по 10,0 мкл
амплiфiкованиx зразк1в, а в крайш - по 3 мкл марке-рiв.
Електрофорез проводили у гращенп напруги 10 В/см до того моменту, як барвник (ксиленщанол) проходив приблизно половину довжини гелю. Дослi-дження результатiв амплiфiкування ДНК на електро-фореграмах здшснювали вiзуально за допомогою трансiлюмiнатора в ультрафюлетовому свiтлi. Елект-рофореграми фотографували за допомогою цифрового фотоапарату з використанням жовтогарячого свiт-лофшьтру.
Таблиця 2
Програма температурного режиму амшафисатора для проведення ПЛР
Праймери tоx А F 5'-CTTAGAGAGGGACAAGG-3' tox А L 5 '-GAATGCCACACCrCTATAG-31
Етап Режим К1льк1сть циклiв
1 94 °C - 4 хв 1
94 °C - 30 с
2 55 °C - 30 с 5
72 °C -3 0 с
94 °C - 3 0 с
3 55 °C - 30 с 30
72 °C - 30 с
4 72 °C - 4 хв 1
5 10 °C збери-ання
Фoтoгрaфiчнe вiдoбрaжeння рeзyльтaтiв пoдaнo та риc. 3 Анaлiз eлeктрoфoрeгрaми рeзyльтaтiв aмплiфi-кyвaння ДНК в ш^вняльному acпeктi з дaними cra^ дaртниx зрaзкiв допомогли вcтaнoвити нaявнicть eлe-мeнтiв гeнoмy, як1 вкaзyють та пoтeнцiйнy здaтнicть до тoкcинoyтвoрeння y видiлeниx з дocлiджyвaнoгo мaтeрiaлy iзoлятiв гeмoлiтичнoï пacтeрeли.
Дaнi про кшькюний тa якicний бioxiмiчний cклaд зрaзкiв eлeмeнтiв cyпeрнaтaнтy iзoлятiв гeмoлiтичнoï пacтeрeли, що пiдлягaли пeрeвiрцi, пoдaнo в тaблицi 3.
Облiк рeзyльтaтiв двox пaрaлeльнo викoнyвaниx дocлiджeнь з мaтeрiaлaми, oтримaними з кожного польового iзoлятy гeмoлiтичнoï пacтeрeли, прoдeмoн-cтрyвaБ нacтyпнe. Рiвeнь фaгoцитoвaниx бaктeрiйниx клiтин (фaгoцитaрнe чиcлo) y прoбax cyмiшeй 1-ï групи (6 пoвтoрнocтeй) cтaнoвив 630 ± 12 (мiкрoбниx клiтин)/ 100 лeйкoцитiв, що дoрiвнюe 6,3 ± 0,12.
cuhuú буфер 1-4 - 55С 5— маркер fermentas 100+ 6-9 - 52С
концентрат^ я íohíS R&shíh - 1,5 ммоль
Рис. 3. Елeктрoфoрeгрaмa рeзyльтaтiв aмплiфiкyвaння ДНК Pasteurella haemolytica
Фaгoцитaрнe чтело у прoбax cyмiшeй 2-ï групи (6 пoвтoрнocтeй) cтaнoвилo 210 ± 4 (мiкрoбниx кль тин)/ 100 лeйкoцитiв, що дoрiвнюe 2,1 ± 0,04.
Опcoнiчний iндeкc (Io ) зa рeзyльтaтaми фaгoцитa-рниx читол 1-ï тa 2-ï груп eкcпeримeнтy cтaнoвив: 6,3 ± 0,12
Io =- = 3 ± 0,03
2,1 ± 0,04
Таблиця 3
Кoмпoнeнтний cклaд прeпaрaтiв cyмiшeй фрaкцiй
Прoбa Кiлькicть Кшьюсгь Byrae-
бiлкa, мкг/мл вoдiв, мкг/мл
Оcaд (дiaлiзoвaний) 250 75
I п1к 20 25
II пж 12,5 0
Cyпeрнaтaнт 262,5 80,0
(дiaлiзoвaний)
I п1к 27,5 26,6
II пж 95 23,3
III пiк 75 6,6
IV тк 30 3,3
V п1к 20 8,3
Привeдeнi дaнi cвiдчaть, що to^emm фрaкцiï' яв-ляють тобою рeчoвини прoтeï'нoвo-вyглeвoднoï' при-роди. Видiлeнi пiкoвi фрaкцiï' ocaAy бaктeрiйнoï' мacи тa cyпeрнaтaнтy бyльйoннoï' культури дeмoнcтрyвaли дocтaтню iмyнocyпрecивнy дiю зa нacлiдкaми опоно-фaгoцитaрнoï' рeaкцiï. Цe cBi^rnb про вирaжeнy ток-cичнicть вид^нт кoмпoнeнтiв.
Висновки
В рeзyльтaтi пoрiвняльнoï' гeнeтичнoï' eкcпeртизи ДНК видiлeниx iзoлятiв гeмoлiтичнoï' пacтeрeли дoвe-дeнa нaявнicть в ниx дiлянки гeнoмy, вадповдального зa фoрмyвaння тoкcигeнниx влacтивocтeй. Вcтaнoвлe-нa зaлeжнicть тoкcигeннocтi штaмy Pasteurella haemolytica ввд кoнцeнтрaцiï тoкcичнoгo бшку в дiaлi-зoвaнoмy ocaAi ïï бульйонно'' культури пoнaд 250 мкг/мл. Cyмaрнa кiлькicть бiлкy тoкcигeннoï' фрa-кцiï' дiaлiзoвaнoгo cyпeрнaтaнтy дocлiджyвaниx iзoля-тiв гeмoлiтичнoï пacтeрeли cтaнoвилa 262,5 мкг/мл. Визнaчeний бioxiмiчний кiлькicнo - якюний cклaд тoкcичниx фрaкцiй бaктeрiйнoï мacи тa cyпeрнaтaнтy гeмoлiтичнoï пacтeрeли тa ïx iмyнocyпрecивний вплив
на оргашзм теплокровних шляхом блокування опсо-но-фагоцитарно1 реакцп з опсошчним шдексом 3 ± 0,03.
Перспективи подальшого до^дження. При пода-льших дослщженнях плануеться визначення дермо некротичного та летального впливу видшених токси-генних фракцш гемолггично1 пастерели на оргашзм теплокровних.
References
Poyelson, L.L., Reynert, T.M., & Send, R.L. (2007). Rаsprostranenye gemolyticheskych mangeymniy sredi klinichesky zdorovich ovets v Norvegii. Rossiyskiy veterinarniy zurnal. 3, 25 (in Russian). Shevtsov, А.А., Rysalev, V.S., Shiryaev, F.A., Potechin, A.V. (2007). Ekonomichesky znachimie bakterialnii bolezni sviney i borba s nimi. Rossiyskiy veterinarniy zurnal. 3, 17 (in Russian). Abdullah, K.M., Lo, R.Y., & Mellors, A. (1990). Distribution of glycoprotease activity and the glycoprotease gene among serotypes of Pasteurella haemolytica. Biochem. Soc. Trans. 18(5), 901-903. doi: 10.1042/bst0180901. Abdullah, K.M., Udoh, E.A., Shewen, P.E., & Mellors, A. (1992). A neutral glycoprotease of Pasteurella haemolytica A1 specifically cleaves O-sialoglycoproteins. Infect Immun. 60(1), 56-62. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1729196. Basaraba, R.J., Byerly, A.N., Mosier, D.A. et al. (1999). Actin polymerization enhances Pasteurella haemolytica leukotoxicity. Veter. Microbiol. 64(4), 307-321. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10063536. Clinkenbeard, K.D., Mosier, D.A., Timko, A.L., & Confer, A.W. (1989). Effects of Pasteurella haemolytica leukotoxin on cultured bovine lymphoma cells. Am J Vet Res. 50(2), 271-275. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2719393. Reinhold, P., Rabeling, B., Gunther, H., & Schimmel, D. (2002). Comparative evaluation of ultrasonography and lung function testing with the clinical signs and pathology of calves inoculated experimentally with Pasteurella multocida. Veter. Rec. 150(4), 109-114. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11838994.
Whiteley, L.O., Maheswaran, S.K., Weiss, D.J., & Ames, T.R. (1990). Immunohistochemical localization of Pasteurella haemolytica A1-derived endotoxin, leukotoxin, and capsular polysaccharide in experimental bovine Pasteurella pneumonia. Veterinary Pathology. 27(3), 150-161. doi: 10.1177/030098589002700302.
Radi, Z.A., Register, K.B., Lee, E.K. et al. (1999). In situ expression of intercellular adhesion molecule - 1 (ICAM - 1) mRNA in calves with acute Pasteurella haemolytica pneumonia. Veter. Pathol. 36(5), 437444. doi: 10.1354/vp.36-5-437.
Majury, A.L., & Shewen, P.E. (1991). The effect of Pasteurella haemolytica A1 leukotoxic culture supernate on the in vitro proliferative response of bovine lymphocytes. Vet Immunol Immunopathol. 29(1-2), 4156. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1949582.
Sun, Y., Clinkenbeard, K.D., Clarke, C. et al. (1999). Pasteurella haemolytica leucotoxin induced apoptosis of bovine lymphocytes involves DNA fragmentation. Veter. Microbiol. 65(2), 153-166. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10078599.
Clinkenbeard, K.D., Clarke, C.R., Hague, C.M. et al. (1994). Pasteurella haemolytica leukotoxin-induced synthesis of eicosanoids by bovine neutrophils in vitro. Journal of Leukocyte Biology. 56(5), 644-649. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7964171.
Townsend, K.M., Hanh, T.X., O'Boyle, D. et al. (2000). PCR detection and analysis of Pasteurella multocida from the tonsils of slaughtered pigs in Vietnam. Veter. Microbiol. 72(1-2), 69-78. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10699504.
Poermadjaja, B., & Frost, A. (2000). Phagocytic uptake and killing of virulent and avirulent strains of Pas-teurella multocida of capsular serotype A by chicken macrophages. Veter. Microbiol. 72(1-2), 163-171. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10699512.
Schboss, P. (1987). Neues uber die Rhinity at atrophican des Schweines. Wien. Tierarztl. Mschr. 74(9), 301305.
Sharif, L., Obeidat, J. & Al-Ani, F. (2005). Risk factors for lamb and kid mortality in sheep and goat farms in Jordan. Bulg. J. Vet. Med. 8(2), 99-108.
