CC BY
29
АСТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ
№ 4 (38) 2016. с. 92-100. Биологические науки
УДК 582.261.3 574.2
ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ ЗОЛОТИСТЫХ ВОДОРОСЛЕЙ (CHRYSOPHYTA) К ИОНАМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
Людмила Николаевна Волошко l.voloshko@inbox.ru Ольга Яковлевна Чаплыгина Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН
Золотистые водоросли, штаммы Ochromonas, ионы тяжелых металлов, биотестирование
Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности штаммов Ochromonas к присутствию в среде ионов тяжелых металлов (медь, кадмий и кобальт) Если судить по нарушению движения клеток токсические эффекты проявляются уже при концентрации ионов 0.25-5.0 мкг л-1 после 2 мин экспозиции. Эти данные дают возможность использовать штаммы охромонад в качестве биоиндикаторов на присутствие в водной среде поллютантов. Изменения в скорости движения клеток после 1 ч экспозиции в тестируемой среде следует признать наиболее удобной тест-функцией.
EVALUATION SENSITIVITY OF THE CHRYSOPHYCEAN ALGAE STRAINS (CHRYSOPHYTA) TO HEAVY METAL IONS
Ludmila N. Voloshko l.voloshko@inbox.ru Olga Ya. Chaplygina Komarov Botanical Institute RAS
Chrysophycean algae, Ochromonas strains, heavy metal ions, biotesting
The results indicate a high sensitivity of Ochromonas strains to the presence of heavy metal ions (copper, cadmium and cobalt) in medium. The toxic effects on swimming velocity are manifested after 2 min of the exposure of cells to cation-containing medium of 0.25-5.0 mg l-1. Since the motility of cells is well documented these strains can be used as bioindicators for the presence of pollutants in an aqueous medium. Changes in cell movement speed after 1 h exposure to the test medium should recognize as most convenient test function.
Поиск высокочувствительных тест-объектов на присутствие в воде токсикантов относится к актуальным задачам современной токсикологии. Такие тест-объекты должны обладать высокой чувствительностью к токсикантам, кроме того, желательно быстрое получение результата.
Золотистые водоросли представляют собой широко распространенную группу преимущественно пресноводных флагеллат, крайне разнообразных по морфологии, которые составляют значительную часть биомассы фитопланктона в водоемах со средней и низкой продуктивностью [22]. Факторами, контролирующими развитие золотистых водорослей, являются величина рН, удельная электропроводность (УЭП), температура воды, содержание гуминовых веществ и трофность водоемов [7, 8]. Золотистые водоросли достаточно чувствительны к изменению факторов окружающей среды (7), однако при проведении токсикологических экспериментов они почти не использовались Флористические и экспериментальные экологические исследования золотистых водорослей стали выполняться
в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова со второй половины 1990-х гг. (1-15, 19-21, 28-29, 31-35).
Целью настоящей работы было изучение чувствительности штаммов Ochromonas spp. к ионам тяжелых металлов (Cu2+, Cd2+, and Co2 ). Поскольку клетки исследованных нами штаммов всегда подвижны, о токсических эффектах можно было судить не только по росту лабораторных популяций, но и по изменению скорости движения клеток.
В качестве токсикантов были использованы сульфаты меди, кадмия и кобальта, которые являются широко распространенными поллютантами. Водоросли нуждаются в небольшом количестве меди, поскольку этот ион входит в состав металлоферментов и является микроэлементом [24], но в высоких концентрациях токсична для многих организмов, в том числе для высших растений и водорослей [29]. Кобальт также играет роль микроэлемента и является компонентом коферментов, например, витамина B12. Однако при высоких концентрациях он вызывает нарушения проницаемости плазмаллемы и поэтому токсичен для водорослей [17]. Кадмий в отличии от меди и кобальта не является микроэлементом и даже при низких концентрациях высокотоксичен. Он интенсивно накапливается в клетках и очень медленно из них выводится. У водорослей ионы кадмия препятствуют поглощению CO2 и росту клеток [36]. Ультраструктурный анализ клеток водорослей показал, что в присутствии кадмия происходит разбухание митохондрий и образование внутри них Cd-содержащих гранул [27]. ПДК ионов меди и кобальта в водоемах, используемых для рыбохозяйственных целей, составляет 0.01 мг л-1, а кадмия 0.005 мг л-1 [18].
Методы исследований
В работе использованы одноклеточные культуры Ochromonas, выделенные из водоемов Карелии (Кондопожский район). Культивирование выделенных штаммов осуществлялось в жидкой минеральной среде № 1 [16, 26], пробирках и колбах объемом 200 мл при температуре 20-23 °С и непрерывном освещении люминесцентными лампами на поверхности среды около 1.5 103 лк (Табл. 1-2). Численность клеток в культуре определялась под микроскопом в камере Горяева.
Для оценки возможности использования культур Ochromonas в качестве биоиндикаторов на присутствие поллютантов в водной среде были протестированы сточные воды г. Санкт-Петербурга. На Северной станции аэрации воды, подвергавшиеся биотестированию, предварительно пропускались через мембранные фильтры. При тестировании использовались образцы воды перед и после полной очистки в аэротэнке. Данные химического анализа показали присутствие в этих образцах ионов тяжелых металлов высокой концентрации (Fe, Cu, Cr, Ni, Zn, Pb, Hg, Cd, Co,Mn, Al), как до очистки (20.65 мг л-1), так и после нее (0.83 мгл-1). В лаборатории образцы сточной воды смешивали со средой № 1 в соотношениях 1:9; 1:1; 9:1. Вариант со средой № 1 рассматривался как контроль. К смесям (0.1 мл) в лунках иммунологических камер добавляли клеточные суспензии Ochromonas (0.1 мл), инкубировали в течение 1 ч. и затем вычисляли скорость движения клеток. Все эксперименты выполнялись в трехкратной повторности, вычислялись средние значения и стандартные отклонения (Microsoft Excell). Методом прямолинейной графической интерполяции определены значения IC50 (50 % ингибирование) [23].
Табл. 1
Состав среды № 1 (мг л-1 дистиллированной воды)
Состав среды №1
Химические соединения Вес или объем
KNO3 100.0
K2HPO4 66.7
MgSO4 -7Н20 33.3
Микроэлементы 1.0 мл
Табл. 2
Состав использованных микроэлементов в средах № 1 (мг л-1 дистиллированной воды)
Химические соединения Вес
ZnSO4 7H2O 0.022
MnSO4 1.81
CuSO4 . 5H2O 0.079
NaBO3 ■ 4Н20 2.63
(NH4)6MovO24•4H2O 1.0
FeSO4•7H2O 9.3
СаСЬ 1.2
со(да3)2-н2о 0.02
ЕДТА (трилон В) 10.0
В долгосрочных экспериментах клетки активно растущих культур инокулировали в пробирки со средой и ионами тяжелых металлов различной концентрации и наблюдали в течении 7 сут. При проведении краткосрочных экспериментов использовались камеры (планшеты) для проведения иммунологических реакций. В лунки камеры, которые уже содержали 0.1 мл среды с соответствующей концентрацией металла или контрольную (без металла), добавляли 0.1 мл клеточной суспензии. Планшеты инкубировались при выше указанной температуре и интенсивности освещения в течение 24 ч. Вычисления скорости движения проводили по числу пересечений клетками стенки большого квадрата камеры Горяева в течение 1 мин [25, 32]. Расчет производили по формуле:
N 4
^ пА
где V = скорость движения клеток; N = число клеток, проходящих через площадь А (большой квадрат камеры Горяева, 0.2 x 0.2 мм) за данный период t = 1 мин; п = концентрация клеток в 1 мл; 4 = статистический фактор.
Результаты
Ионы меди и кобальта при низких концентрациях оказывали стимулирующее
воздействие на размножение клеток, однако при повышении содержания катионов
проявлялся токсический эффект, возрастающий с увеличением концентрации. Полное
ингибирование культуры наблюдалась в присутствии 50 мкг л-1 Си2+, и 2100 мкг л-1 Cd2+ и 2+
Со (Рис. 1). После 2 сут инкубации концентрации, ингибирующие рост на 50 %, превышали в 27-272 ПДК этих металлов для рыбохозяйственных водоемов, хотя токсический эффект проявлялся и при более низких концентрациях (25.4 мг л-1 для Си2+; 438 мкг л-1 для Cd2+ и 209.6 мкг л-1 для Со2), Рис. 1.
Влияние ионов тяжелых металлов на скорость движения клеток Ochromonas ovalis проявляется сразу и при очень низких концентрациях. Токсический эффект наблюдался в присутствии в среде 0.25 мкг л-1 0.44 мкг л-1 Cd и 2.1 мкг л-1 По отношению к скорости движения клеток достоверные результаты могут быть получены уже после 1 ч экспозиции в среде, содержащей токсикант (Рис. 2, Табл. 3). ГС50 по этому показателю были 7.6 мкг л-1 для меди, 3.6 мкг л-1 для кадмия и 18.8 мкг л-1 для кобальта, что намного ниже принятых в России ПДК этих металлов. Сходные результаты наблюдались при испытании остальных штаммов Ochromonas (Табл. 4).
Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности штаммов Ochromonas к присутствию в среде ионов тяжелых металлов [32, 35]. Если судить по нарушению движения клеток токсические эффекты проявляются уже при концентрации ионов 0.25-5.0 мкг л-1. Эти данные позволяют использовать штаммы охромонад в качестве биоиндикаторов на присутствие в водной среде поллютантов. Изменения в скорости движения клеток после 1 ч экспозиции в тестируемой среде следует признать наиболее удобной тест-функцией.
Для проверки возможности практического использования рекомендуемого метода было проведено тестирование сточной воды из очистных сооружений г. Санкт-Петербурга. В присутствии 0.1-0.9 объема сточной воды скорость движения клеток не ингибировалась, а возрастала в 1.5-1.9 раза, что также указывает на значительные отклонения от контроля (Табл. 5). Подобная реакция была, вероятно, вызвана одновременным присутствием 11 различных ионов тяжелых металлов в тестируемой воде. Возможно, различные антагонистические и синэнергетические взаимодействия ионов проявлялись именно в такой ответной реакции на токсичность среды. Вода после биологической очистки оказывала несколько меньший эффект, но токсичность ее сохранялась. Эксперименты с Ochromonas показывают присутствие токсикантов в сточных водах даже после очистки и подтверждают возможность практического использования изученных штаммов в качестве биоиндикаторов различных поллютантов в водной среде.
50 у 40 -30 -20 10
0 0
50 у 40 -30 -20 -10 -0 0
50 т 40 30 20 -10 -0 0
а)
Время, сут
2 5
Время, сут
Ь)
с)
Время, сут
Рис. 1. Влияние ионов металлов на рост of Ochromonas вуаШ. Концентрация катионов (мкг л Си (а): 1 контроль; 2 — 2.5; 3 — 25; 4 — 250; 5 — 500; Са (Ь) : 1 — контроль; 2 — 43.8; 3 — 438; 4 — 2200; Со (с): 1 контроль; 2 — 21; 3 — 210; 4 — 2100.
2
5
7
7
2
5
200 150 100 50 0
Контроль 25
1,3 2,5
Си 2+ (мкг л"1)
510
200 150 100 -50 -0
200 150 100 + 50 0
-I
+
+
+
+
Контроль ,1
10,5 21
Со 2+(мкглС
□ 2 т1п а 20 т1п ■ 60 т1п
525
640
Контроль 44 2,2 4,4 1 76
Сс!2+ (мкг л"1)
2420
с)
1821
Рис. 2. Влияние ионов меди (а), кадмия (Ь)и кобальта (с) на скорость движения клеток Ос^втвпа, вуаН?' в среде, содержащей тяжелые металлы.
Табл. 3
Концентрации ионов тяжелых металлов (мкг л"1), ингибирующие на 50 % рост популяции и скорость
движения клеток (ГС50) Оскготопа^' оуаИ&\
Ионы металлов 1С50 по отношению к
численности популяции, после экспозиции в течении скорости движения клеток, после экспозиции в течении
7 сут 20 мин 1 ч 1 сут
Си2+ 288±25 483±38 8±0.7 509±20
СсР 876±76 19+1 3.5±0.2 730±35
Со2+ 734±67 671±44 18±1.2 2096±82
Табл. 4
Концентрации ионов тяжелых металлов (мкг л-1), ингибирующие на 50 % скорость движения клеток
(1С50) различных штаммов Ochromonas.
Штамм Скорость 1С50
движения клеток для скорости движения клеток через сут.
(мкм сек"1) воздействия ионов:
в контроле Си СС Со
Оскготопа^' оуаН5 СЛЬИ 944 25±3 509±45 730±80 2096±98
Оскготопа^' globosa СЛЬИ 945 20±5 253±26 146±15 5240±154
Оскготопа5 Бр. СЛЬИ 1013 20±6 252±28 145±22 20921110
Оскготопа5 Бр. СЛЬИ 1014 56±10 510±50 292±30 2090±99
Оскготопа5 Бр. СЛЬИ 1015 11±2 255±26 438±46 2085±88
Оскготопа5 Бр. СЛЬИ 1016 50±8 254±25 437±48 52001152
Оскготопа5 Бр. СЛЬИ 1626 70±8 250±30 292±32 2094±101
Табл. 5
Влияние сточной воды на скорость движения клеток Ochromonas ovalis после 1 ч экспозиции.
Условия эксперимента Сточная вода : среда № 1 Скорость движения клеток
Контроль (среда № 1) 0 1 177±39.9
1 9 241±51.5
Неочищенная сточная 1 1 281±73.7
вода 9 1 333±34.1
1 9 222±31.9
Вода после биологической 1 1 262±31.1
очистки 9 1 318±32.2
Благодарности
Исследования выполнялись в рамках плановой темы № 0120125605 Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН. Работа была поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН: «Биоразнообразие природных систем», проект «Инвентаризация разнообразия водорослей водоемов, почв и грунтов северных регионов Росси.
Литература
1. Белякова Р. Н., Волошко Л. Н., Гогорев Р. М., Гаврилова О. В., Макарова И. В., Околодков Ю. Б., Рундина Л. А. Водоросли, вызывающие «цветение» в водоемах северо -запада России / Под ред. К.Л. Виноградовой / М.: ТНИ КМК. — 2006. — 367 с.
2. Волошко Л. Н. Хризофитовые (Chrysophyceae, Synurophyceae) водоемов Севера России / Автор. дис. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук по спец. 03.02.01 — «Ботаника». СПб, БИН РАН. — 2012. — 43 с.
3. Волошко Л. Н. Хризофитовые (Chrysophyceae, Synurophyceae) водоемов Севера России / Дис. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук по спец. 03.02.01 — «Ботаника». СПб, БИН РАН. — 2013а. — 373 с.
4. Волошко Л.Н. Новые таксоны рода Mallomonas (Chrysophyta, Synurophyceae) из озер Полярного Урала // Ботан. журн.— 2009. — Т. 94, №7. — С. 1068-1076.
5. Волошко Л.Н. Новый вид рода Mallomonas (Chrysophyta, Synurophyceae) из озер Воркутинской тундры // Ботан. журн. — 2012. — Т. 97, № 9. — С. 1090-1098.
6. Волошко Л.Н. Хризофитовые (Chrysophyceae, Synurophyceae) водоемов Севера России / Автор. дис. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук по спец. 03.02.01 — «Ботаника». СПб, БИН РАН. — 2012. — 43 с.
7. Волошко Л.Н. Хризофитовые (Chrysophyceae, Synurophyceae) водоемов Севера России / Дис. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук по спец. 03.02.01 — «Ботаника». СПб, БИН РАН. — 2013а. — 373 с.
8. Волошко Л.Н. Виды рода Spiniferomonas (Chrysophyceae, Paraphysomonadaceae) в водоемах Севера России // Ботан. журн. 2013б. — Т. 98, № 7. — С. 848-858.
9. Волошко Л.Н. Золотистые водоросли водоемов Севера России. Род Chrysosphaerella (Chrysophyceae, Paraphysomonadaceae) в водоемах Севера России // Ботан. журн. — 2016а. — Т. 101, № 7. — С. 753-776.
10. Волошко Л.Н., Гаврилова О.В., Громов Б.В. Разнообразие золотистых водорослей (Paraphysomonadaceae, Mallomonadaceae, Synuraceae) в Ладожском озере и его регионе // Альгология. — 2002. — Т. 12, № 3. — С. 344-360.
11. Волошко Л.Н., Сафронова Т.В. Экология золотистых водорослей (Chrysophyta) и «цветение» воды // Астраханский вестник экологического образования. — 2015. — № 3 (33). — С. 23-27.
12. Волошко Л.Н., Сафронова Т.В., Шадрина С.Н. Виды рода Ochromonas (Chrysophyta, Chromulinaceae) в водоемах Ленинградской области // Ботан. журн. —2015. — Т. 100, № 5. — С. 452-459.
13. Волошко Л.Н. Золотистые водоросли водоемов севера России. Род Chrysosphaerella // Ботан. журн. — 2016. — Т. 101, № 7. — С. 753-776.
14. Волошко Л.Н. Золотистые водоросли (Chrysophyta) водоемов севера России. Разнообразие стоматоцист // Ботан. журн. — 2016. — Т. 101, № 11. — С. 1257-1281.
15. Волошко Л.Н., Сафронова Т.В. Экология золотистых водорослей (Chrysophyta) и «цветение» воды // Астраханский вестник экологического образования. 2015. — № 3 (33). — С. 23—27.
16. Громов Б.В., Титова Н.Н. Коллекция культур водорослей лаборатории микробиологии Биологического института Ленинградского университета. Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Л.: ЛГУ. — 1983. — С. 3-27.
17. Костяев В.Я., Ягодка С.Н., Соколов В.А. Чувствительность Anabaena spiroides к цинку // Гидробиол. журн. — 1980. — Т. 60, № 2. — С. 89-92.
18. Правила охраны поверхностных вод от загрязнения сточными водами / Охрана окружающей среды. Справочник. Л.: Судостроение. — 1978. — 558 с.
19. Сафронова Т.В. Видовой состав Chrysophyta в водоемах водно-болотного угодья международного значения «Мшинская болотная система» (Ленинградская область). Ботан. журн. — 2011. — Т. 96. №_8. — С. 1037-1052.
20. Сафронова Т.В. Сезонные изменения состава золотистых водорослей в прудах Ботанического сада БИН РАН (Санкт-Петербург) // Ботан. журн. — 2014. — Т. 99. №_4. — С. 443-458.
21. Сафронова Т.В. Новые для флоры Ленинградской области и России виды Chrysophyta // Нов. систем. низш. растений. 2012. — № 46. С. — 60-67.
22. Chrysophyte algae. Distribution, Phylogeny and Development. New York, USA. — 1995. — 399 p.
23. Christinsen T., Nyholm N. Ecotoxicological assays with algae: Weibull Dose Response Curves // Environ. Sci. Technol. 1984. V. 18. No 9. P. 713-718.
24. Jungk A. Toxicologie der Pflanzenernährung (Dungershaden). Schadwirkungen auf Pflanzen, Lehrbuch der Pflanzenernätoxicologie. Mannheim; Wien; Zürich: Wissenschaftsveriag. — 1988. — 128 p.
25. Ojakian G.K., Katz D.F. A simple technique for the measurement of swimming speed of Chlamydomonas // Exptl. Cell Reseach. — 1973. — V. 81, № 2. — P. 487-491.
26. Pinevich A.V., Mamkaeva K.A. Titova N.N., Gavrilova O.V., Ermilova, E.V. Kvitko K.V., Pljusch A.V., Voloshko L.N., Averina S.G. St. Petersburg culture collection (CALU): four decades of storage and research with microscopic algae, cyanobacteria, and other microorganisms // Nova Hedwigia. — 2004. — V. 79, No 1-2. — P. 115126.
27. Rai L.C., Gaur J.P., Kumar H.D. Physiology and heavy metal pollution // Biol. Rev. Cambridge Phil. Soc. — 1981. — V. 56. — P. 155-161.
28. Safronova T.V. A new morphotype of chrysophycean stomatocyst from the pond of Peter the Great Botanical garden (Saint-Petersburg) // Нов. систем. низш. растений. — 2015. — Т. 49. — С. 47-51.
29. Safronova T.V., Voloshko L.N. Silica-scaled chrysophytes in the waterbodies of protected areas of the North-West of Russia // Nova Hedwigia, Beiheft 142. — 2013. — P. 97-116.
30. Schreiber R., Gordon A.S., Millero F.I. The toxicity of copper to the marine bacterium Vibrio alginolytous // Can.J. Microbiol. 1985. V. 31. P. 83-87.
31. Siver P.A., Voloshko L.N., Gavrilova O.V., Getsen M.V. The scaled chrysophyte flora of the Bolshezemelskaya tundra (Russia) // Nova Hedwigia, Beiheft. — 2005. — V. 128. — P. 126-150.
32. Voloshko L.N., Titova N.N., Gromov B.V. Influence of heavy metal ions on cell motility of Ochromonas ovalis Dofl. (Chrysophyta) // Hydrobiol. Journ. — 1997. — V. 33, Nos. 6 & 7.. — P. 147-155.
33. Voloshko L.N. The chrysophycean algae from glacial lakes of Polar Ural (Russia) // Nova Hedwigia, Beiheft. — 2010. — V. 136. — P. 191-121.
34. Voloshko L., Gavrilova O.V. A checklist of silica-scaled chrysophytes in Russia with an emphasis on the flora of Lake Ladoga // Nova Hedwigia, Beiheft. — 2001. — V. 122. — P. 147-167.
35. Voloshko L., Titova N. Effects of Heavy Metal Ions on the Motility and Phototactic Orientation of the chrysophycean and cryptophycean algae from Lake Ladoga Region // The Largest Lake in Europe and its environment. // Proceed. Second Intern. Lake Ladoga Symposium 1996. Joensuu: Joensuu Yliopisto, Finland. — 1997. — P. 220224.
36. Wong, S.C., Cowan I.R., Farquhar G.D. Stomatal conductance correlates with photosynthetic capacity // Nature. — 1979. — V. 282. — P. 424-426.
