CC BY
68
УДК 579.26
Алешина Е.С., Дроздова Е.А.
Оренбургский государственный университет E-mail: esaleshina@mail.ru, drozdova15@mail.ru
оценка биотоксичности углеродных нанотрубок с использованием биотестов
НА ОСНОВЕ ЛЮМИНЕСцИРУЮщИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Не смотря на то, что углеродные наноматериалы (УНМ) были открыты уже тридцать лет назад, до сих пор расширяется спектр их применения, а также количество исследований посвященных определению их биологических эффектов. В литературе постоянно появляются данные о возможных неблагоприятных эффектах, вызываемых УНМ, развивающихся на разных уровнях организации живого. Поэтому изучение вопросов потенциальных рисков их использования до сих пор представляется первостепенной задачей. А возможность использования для этих целей природных и рекомбинантных штаммов люминесцирующих бактерий весьма актуально.
В этой связи целью настоящей работы стала оценка биологических эффектов углеродных наноматериалов, представленных 8 образцами и включающими как одностенные, так и многостенные нанотрубки и нановолокна, методами биолюминесцентного анализа с использованием люминесцирующих рекомбинантного штамма Escherichia coli К12 TG1 с клонированными luxCDABE генами морской светящейся бактерии Photobacterium leiognathi 54D10, выпускаемый в лио-филизированной форме и природного штамма Photobacterium phosphoreum В-17 677f (основа коммерческойтест-системы «Микробиосенсор В-17 677f»).
В опытах на E.coli для соединений УНМ, диспергированных в дистиллированной воде с последующей УЗ-обработкой значения ЕС20 и ЕС50былирассчитаны для 5 из 8 УНМ. При использовании же Photobacterium phosphoreumвеличины ЕС20 были установлены для 7 из 8, а ЕС50 для 5 из 8 УНМ.
Выявлено, что природный люминесцирующий штамм Photobacterium phosphoreum в 17-677f характеризуется более выраженной и быстрой реакцией на воздействие УНМ, чем рекомбинант-ный штамм Escherichia coli K12 TG1. Одновременно детали реагирования использованных сенсорных штаммов определяет перспективу их не взаимоисключающего, но взаимодополняющего использования.
Ключевые слова: люминесцирующие микроорганизмы, биотоксичность, углеродные нано-трубки.
В последние годы для проведения исследований в области биологии, медицины и санитарии востребованным инструментом стали люминесцирующие микроорганизмы [1]. Распространенным вариантом их использования является выявление биотоксичности химических веществ и соединений, основанное на оценке тушения биолюминесценции вслед-ствии нарушения основных энергетических процессов или гибели бактериальных клеток-мишеней [2]. Их использование для исследования биологической опасности/безопасности наностуктурированных соединений получило широкое распространение [3].
Проведение работ в данном направлении позволяет дать ответ о возможном потенциальном риске, возникающем при контакте биологических систем разного уровня организации с наноматериалами [4].
Ранее нами предложен адаптированный метод исследования биотоксичности углеродных наноматериалов, [5], включающий специальную процедуру пробоподготовки исследуемых
образцов, пролонгированный период регистрации свечения и специальный алгоритм его количественного учета.
В настоящий момент наблюдаются попытки использования для заявленных целей большого спектра коммерческих и лабораторных биосенсоров, основанных как на природных [6]-[7], так и рекомбинантных [8]-[9] люминесцирующих микроорганизмах. Однако до сих пор в литературе отсутствуют сведения о том, какие же люминесцирующие микроорганизмы будут проявлять более высокую чувствительность к воздействию углеродных наномате-риалов.
В этой связи целью настоящей работы явился сравнительный анализ чувствительности двух биосенсоров на основе природных и ре-комбинанотных люминесцирующих микроорганизмов при оценке биотоксичности углеродных наноматериалов.
При проведении исследований нами были использованы восемь коммерчески доступных и лабораторных препаратов углеродных нано-
материалов (УНМ). Их список включал пять образцов одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ), выпускаемые фирмой «НаноКарбЛаб» (Россия), содержащие 2-5% концевых СООН-групп (ОУНТ-1а, 1б) или NH2-групп (ОУНТ-3); их укороченные варианты, содержащие 5-10% концевых COOH-групп (ОУНТ-2) или NH2-групп (ОУНТ-4) и многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ). Также использовали синтезированные в РХТУ им. Д.И. Менделеева лабораторные образцы нановолокон (НВ) и их вариант, прошедший процедуру кислотной функционализации (фНВ).
В качестве объекта исследования использованы рекомбинантный штамм Escherichia coli K12 TG1 (pF1) с клонированными luxCDABE-генами Vibriofischeri 6 из коллекции Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Данный штамм выпускается ЗАО НВО «Иммунотех» (Россия) в лиофилизиро-ванном состоянии под коммерческим названием «Эколюм» [8] и природный люминесцирующий штамм Photobacterium phosphoreum B17-677f, выпускаемый Институтом биофизики СО РАН под коммерческим названием «Микробиосен-сор B17-677f» [10].
Перед проведением исследований препарат «Эколюм» восстанавливали добавлением 10 мл холодной дистиллированной воды, выдерживали при 2-4 °С в течение 30 минут, после чего доводили температуру бактериальной суспензии до 15-25 °С. В случае «Микробиосенсора B17-677f», биотест регидротировали добавлением 1,5% NaCl и выдерживали в течение 30 минут при температуре 22-24 °С.
В качестве оценки биологической активности был использован метод биолюменесцент-ного анализа. При проведении биотестирования суспензии УНМ в объеме 50 мкл вносили в ячейки 96-луночных планшетов из непрозрачного пластика («Thermo», США), предварительно заполненные 50 мкл дистиллированной воды в случае E.coli или 3% раствором NaCl для P. phosphoreum, а из полученной смесей готовили серии двукратных разведений. В качестве контроля использовали дистиллированную воду для тест-системы «Эколюм» или 3% раствор NaCl для «МикробиосенсорВ17-677Б>. На следующем этапе в каждую лунку вносили по 50 мкл бактериального биосенсора, после чего
планшеты помещали в измерительный блок люминометра LM-01T («Immunotech», Чехия), регистрируя интенсивность свечения в течение 180 минут с интервалом 5 минут.
Припроведение расчета индекса токсичности определяемого по влиянию исследуемых образцов УНМ на интенсивность свечения сенсорного микроорганизма, использовали математический алгоритм (Ik. xIo )/(Ik *Io. .),
г 1 Omm nmm 1 nmm Omm '
где Ik и Io - интенсивность свечения контрольных и опытных проб на 0-ой и n-ой минутах измерения.
На основании полученных данных рассчитывали величины токсилогических параметров ЕС20 и ЕС50, соответствующие концентрациям УНМ, вызывающим 20% или 50% ингиби-рование свечения сенсорного микроорганизма по сравнению с контролем.
Полученные результаты выполнены минимум в трех повторностях и обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета компьютерных программ «Statistica» V8 («StatSofflnc.», США). При проведении исследований максимально возможное время проведения исследования составило 3 часа, по истечении которых уже наблюдалось собственное тушение свечения использованного бактериального биосенсора в контрольных пробах, определяемое истощением пула энергетических субстратов для реакции биолюминесценции.
В тоже время биологический эффект УНМ в отношении использованных сенсорых микроорганизмов, особенно для Escherichiacoli K12 TG1, имел постепенную и развивающуюся во времени динамику, что определяло кинетическое измерение биолюминесценции в течение всего названного периода времени.
При исследовании биотоксичности УНМ с использованием Escherichiacoli K12 TG1 c клонированными luxCDABE-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма Photobacteriuml eiognathi установлена только слабо выраженная биотоксичность или ее отсутствие, наблюдаемые на всем протяжении исследования.
Так у одностенных углеродных нанотру-бок (ОУНТ), содержащих 2-5% концевых NH2-групп, многостенных нанотрубок и нановоло-кон вероятные значения токсикологического параметра ЕС20 и ЕС50 оказывались выше
VII Всероссийская научно-практическая конференция
максимальной тестируемой концентрации. В свою очередь для одностенных углеродных нанотрубок с СООН-группами, их укороченных вариантов, укороченных одностенных углеродных нанотрубокс концевыми NH2-группами и функционализированных нановолокон был зафиксирован как токсикологический параметр ЕС20, так и ЕС50 (табл. 1).
При этом стоит обратить внимание на то, что в парах одностенные углеродные нано-трубки и их укороченные варианты большую токсичность проявляют последние, что проявляется в снижении концентрации вещества, вызывающем падение интенсивности биолюминесценции на 20% или 50% от контрольных значений - токсикологические параметры ЕС20 и ЕС50.
Так, например, в паре одностенных нанотрубок с NH2-концами значения ЕС20 и ЕС50 для ОУНТ 3 не возможно было зафиксировать, то для ОУНТ-4 проведенные исследования позволили рассчитать оба названных параметра.
Исследование биологической активности вторым сенсорным люминесцирующим микроорганизмом РИоЮЬа^епит рко8ркогеит, депонированным в Коллекции культур Института биофизики Сибирского отделения РАН (ИБСО РАН) под №В17-677F, было определено еговы-сокой чувствительностью к различным химическим поллютантам. При этом важной особенностью использования данного биосенсора явилось то, что егореакция на воздействие УНМ
была более быстрой по сравнению с E. coliK12 TGI и оценка полученного результата могла быть осуществлена уже к 60-й минуте эксперимента, что больше согласуется с понятием «острая токсичность».
Таким образом, использование природного морского люминесцирующего изолята Photobacterium phosphoreum в 17-677f позволило установить величины ЕС20 для 7из 8, а ЕС50 для 5 из 8 исследованных образцов УНМ (табл. 1). При этом образцы ОУНТ1б и фНВ также как и при использовании E. co-liK 12 TG1 оказывались наиболее токсичными. Однако P.phosphoreum в 17-677f позволял зафиксировать токсичность у МУНТ, в то время как укороченные одностенные углеродные на-нотрубки с МН2-концами (ОУНТ-4) оказывались нетоксичными.
В тоже время сопоставление полученных результатов на P.phosphoreum в 17-677& аналогичными величинами, определенными с использованием E.coli K12 TG1, показало, что абсолютные величины токсичности, определенные с использованием P.phosphoreum в 17-677f, в большинстве случаев превышали таковые при проведении тестирования с использованием E.coli K12 TG1.
Следствием данных различий в реагировании двух названных биосенсоров явился тот факт, что при сопоставлении величин токсичности, определенных в отношении сенсорных штаммов E.coli K12 TG1, констатированы отрицательные, но незначимые коэффициенты
Таблица 1. Результаты определения биологической активности УНМ с использованием двух сенсорных штаммов микроорганизмов
Исследованные углеродные наноматериалы Значения токсикологических параметров, определенных с использованием сенсорных штаммов
Escherichia соН К12 TG1 Photobacterium phosphoreum
ЕС20 ЕС50 ЕС20 ЕС50
ОУНТ-1а (0,052±1,6) (0,07±3,6) (0,0031±1,5) (0,023±1,2)
ОУНТ-1б (0,001±1,1) (0,003±2,8) (0,002±2,0) (0,004±1,9)
ОУНТ-2 (0,0157±1,3) (0,06±1,9) (0,006±1,8) (0,042±1,0)
ОУНТ-3 >100 >100 (0,005±2,3) >100
ОУНТ-4 (0,03±0,5) (0,068±2,1) (0,031±0,5) >100
МУНТ >100 >100 (0,003±1,5) (0,06±0,2)
НВ >100 >100 >100 >100
фНВ (0,015±0,1) (0,057±2,0) (0,003±0,1) (0,015±2,0)
корреляции: г= -0,399 (Р=0,166) при сравнении значений ЕС20 и г= -0,459 (Р=0,215) при сравнении значений ЕС50. Сказанное свидетельствует о неполной идентичности биологической активности УНМ в отношении двух
названных сенсорных штаммов, что может рассматриваться в качестве аргумента в пользу их не альтернативного, но взаимодополняющего использования.
10.09.2015
Список литературы:
1. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука, 2009. - 246 с.
2. Ефременко Е.Н., Сенько О.В., Алескерова Л.Э., Аленина К.А., Мажуль М.М., Исмаилов А.Д. Биосенсоры на основе иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum для биомониторинга экотоксикантов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - №5. - С. 490-496.
3. HeinlaanM., IvaskA., Blinoval., DubourguierH.C., KahruA. Toxicity of nanosize dandbulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus // Chemosphere. - 2008. - V. 71. - №7. - P. 1308-1316.
4. Blaise C., Gangne F., Ferard J.F., Eullaffroy P.Ecotoxicity of selected nanomaterials to aquatic organisms// Environ.Toxicol. - 2008. -V. 23. - P. 591-598.
5. Дерябин Д.Г., АлешинаЕ.С., Ефремова Л.В. Применение теста ингибирования бактериальной биолюминесценции для оценки биотоксичности углеродных наноматериалов // Микробиология. - 2012. - Т.81. - №4. - С. 532-538.
6. Kurvetl., IvaskA., BondarenkoO., SihtmaeM., KahruA.LuxCDABE—transformed constitutively bioluminescent Escherichia coli fort oxicity screening: comparison with naturally luminous Vibrio fischeri // Sensors. - 2011. - V. 11. - №8. - P. 7865-7878.
7. Taran M.V., Starodub N.F., Katsev A.M., Guidotti M., Khranovskyy V.D., Babanin A.A., Melnychuk M.D. Biocidal effects of silver and zinc oxide nanoparticles on the bioluminescent bacteria // Biophotonics. - 2013. - doi: 10.1117/12.2044672.
8. Сорокина Е.В., Юдина Т. п., Бубнов И.А., Данилов В.С.
Оценка токсичности железа с помощью люминесцентного бактериального теста на рекомбинантном штамме Escherichia coli // Микробиология. - 2013. - Т. 82. - №4. - С. 428-433.
9. Kurvet I., Ivask A., Bondarenko O., Sihtmae M., Kahru A.LuxCDABE—transformed constitutively bioluminescent Escherichia coli for toxicity screening: comparison with naturally luminous Vibrio fischeri // Sensors. - 2011. - V. 11. - №8. - P. 7865-7878.
10. Каталог культур светящихся бактерий / под ред. Э.К. Родичевой. Новосибирск: Наука, СО РАН, 1997. - 125 с.
Сведения об авторах:
Алешина Елена Сергеевна, доцент кафедры микробиологии химико-биологический факультета Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук, 03.02.03 Микробиология 460018, Оренбург, пр-т Победы 13, тел.: (3532) 37-24-81, e-mail: esaleshina@mail.ru
Дроздова Елена Александровна, доцент кафедры микробиологии химико-биологический факультета Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук, 03.02.03 Микробиология 460018, Оренбург, пр-т Победы 13, тел.: (3532) 37-24-81, e-mail: drozdova15@mail.ru
