CC BY
59
УДК 579.26
Давыдова О.К.1, Алешина Е.С.1, Жиленков А.В.2
1Оренбургский государственный университет 2Институт проблем химической физики РАН Е-mail: esaleshina@mail.ru, okdavydova@yahoo.com, zhilenkow91@inbox.ru
использование люминесцирующих штаммов
микроорганизмов при исследовании зависимости
биологической активности производных фуллеренов
от значения их повехностного заряда
Производство наноматериалов и успешное применение в различных сферах вызывают озабоченность по поводу их неконтролируемого поступления в окружающую среду и, как следствие, воздействия на живые организмы, что ставит вопрос о разработке экспресс-анализа опасности/безопасности наноматериалов с использованием оригинальных сенсорных и репортерных тест-систем на основе микроорганизмов, в том числе люминесцирующих. В представленной работе произведена оценка биологической (антимикробной) активности производных С60- и С70-фуллеренов и обсуждены механизмы, лежащие в ее основе и определяемые формированием физического контакта с бактериальными клетками-мишенями. Методом биолюминесцентного анализа определены концентрации 12 оригинально синтезированных производных С60- и С70-фуллеренов, вызывающие подавление биолюминесценции к 60-й минуте контакта на 50% от контрольных значений (ЕС50). Выявлено, что использование сенсорного штамма Escherichia coli K12 TG1 позволяет выявлять антибактериальную активность у большего количества функциона-лизированных производных фуллеренов (у 6 из 12) и имеет большую чувствительность, нежели при использовании Bacillus subtilis B-10548 (у 3 из 12). Применение модифицированного метода гель-электрофореза позволило оценить значение и величину электрофоретической подвижности использованных производных С60- и С70-фуллеренов и роль электростатических взаимодействий в формируемой ими биологической активности. Полученные данные могут явиться основой для создания инновационных нанодезинфектантов, представляющих интерес для практического использования в медицине и ветеринарии.
Ключевые слова: бактериальные биосенсоры, Escherichia coli, Bacillus subtilis, производные фуллеренов, биологическая активность.
В настоящее время в связи с нарастающими масштабами производства наноматериалов и их успешного применения в различных сферах деятельности человека возникает озабоченность по поводу их воздействия на живые организмы [1]-[2]. Подвижность и биологическая доступность наноматериалов зависит как от факторов окружающей среды, так и от характеристик конкретного материала [3]. Именно поэтому становится актуальным вопрос о разработке новых вариантов экспресс-анализа опасности/ безопасности наноматериалом с использованием оригинальных сенсорных и репортерных тест-систем на основе микроорганизмов, в том числе люминесцирующих [4].
В многочисленных работах уже показана токсичность производных фуллеренов в водной среде для бактерий и других организмов [5]-[6], что, вероятно, вызвано их взаимодействием с поверхностью клетки и, возможно, зависит от способности образовывать агрегаты [7], наличия и значения поверхностного заряда [8], характера функционализации [9]. Все это позво-
ляет рассматривать эти соединения в качестве перспективных основ для создания дезинфек-тантов различных сред [10] и потенциальных антибактериальных препаратов [11].
В связи с этим целью настоящей работы явилось исследование зависимости биологической активности производных С60- и С70-фуллеренов от их химического строения и значения поверхностного заряда в отношении люминесцирующих штаммов.
В качестве объектов исследования была использована представительная выборка из С60- (Ф1) и С70-фуллеренов (Ф2) и их производных (Ф3-Ф9, Ф11-Ф14 - производные С60-фуллерена, Ф10 - С70-фуллерена), кова-лентно функционализированных различными химическими группировками: по всей поверхности сферы (Ф3-Ф5, гидроксигруппы) или присоединенными к одному из полюсов от 4 до 12 амино- (Ф6-Ф10) или карбоксигруппами (Ф11-Ф14). Перечисленные образцы были синтезированы в Институте проблем химической физики РАН (Россия).
Для исследования биологической активности образцов фуллеренов использованы два люминесцирующих штамма, первый из которых создан на основе грамотрицательных бактерий Escherichia coli K12 TGI (pFl) со встроенной кассетой luxCDABE генов Vibrio fischeri 6 из коллекции Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Данный штамм выпускается ЗАО НВО «Иммунотех» (Россия) в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм» [12], что предполагает регидратирование его дистиллированной водой. Второй использованный штамм Bacillus subtilis В-10548, несущий плазмиду pLF14lux-ABleo с luxAB-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма Photo-bacterium leiognathi, относился к грамположи-тельным бактериям. Биосенсор Bacillus subtilis В-10548 являлся лабораторным штаммом, что приводило к необходимости его предварительного выращивания.
Процедуру биолюминесцентного анализа проводили по ранее разработанной схеме [13]. Динамическую регистрацию биолюминесценции осуществляли на люминометре LM-01T («Immunotech», Чехия). Оценку интенсивности свечения рассчитывали в относительных величинах [14] по математическому алгоритму
(1к0 х1о /1к хЬ ), где 1к и 1о - ин-
4 0 мин 60 мин 60 мин 0 мин7'
тенсивность свечения контрольных и опытных проб соответственно. Особенностями проведения анализа характеризовался штамм B.subtilis ВКПМ В-10548, который нуждался во внесении экзогенного альдегида, а регистрация биолюминесценции требовала использования кюветного люминометра «Биотокс» (ООО «Нера», Россия). Полученные подобным образом значения интенсивности свечения сенсорных микроорганизмов использовались для расчета величины ЕС50 - концентрации производных фуллеренов, вызывающих подавление биолюминесценции на 50% от контрольных значений.
Для изучения роли заряда производных фуллеренов в определении наличия/отсутствия их антибактериальной активности был использован модифицированный метод элек-торофореза [15], проведенный в 1,5% агароз-ном геле («АррН^ет», Германия) при рН 7,2, напряжении 150 в и силе тока 100 мА, так что на 1 см геля приходилось 5 В/см. После 20 мин электрофореза миграцию исследуемых соединений оценивали в видимом свете и при облучении ультрафиолетом на трансиллюминаторе («УИЬег Lourmat», Франция) с последующим фотографированием и обработкой изображений с помощью универсальной компьютерной
Таблица 1. Результаты определения биологической активности функционализированных производных С60- и С70-фуллеренов по влиянию на уровень биолюминесценции сенсорных штаммов Е.соН К12 TG1 и В.зиЫШэ В-10548 и их подвижности в электрическом поле (катод слева, анод справа)
программы «ImageJ» (NIH, США) для расчета значений электрофоретической подвижности (^p) использовалась формула L/t^L/V, где L -расстояние от точки старта до места детекции, tr - время, затраченное анализируемой молекулой на достижение точки детекции, V - напряжение электрического поля, и Lt - расстояние между катодом и анодом. При этом значение ц выражалось величиной см2/Б*с и принимало положительный (при движении к катоду) или отрицательный (к аноду) знак.
Все эксперименты выполнены не менее чем в трех повторностях и обработаны методами вариационной статистики с применением пакета компьютерных программ «Statistica» V8 («StatSoftlnc.», США).
Полученные результаты проведенного биолюминесцентного анализа определения биологической активности производных фуллеренов с использованием сенсорных штаммов E.coii K12 TG1 (табл. 1) позволили констатировать слабо выраженную биотоксичность у С60-и С70-фуллеренов и их простых модификаций (Ф3-Ф5) по значению токсикологического параметра ЕС50, оказавшиеся выше максимальной тестируемой концентрации 200 мкМ.
Некоторым же производным С60- и С70-фуллеренов функционализация придавала свойства биотоксичности, связанной с приобретением частичной или полной раство-
римости в водных растворах. При этом если карбоксильные производные С60- и С70-фуллеренов демонстрировали полное отсутствие биотоксичности, то аминные производные проявляли выраженную активность, при оценке значений ЕС50 возрастающую в ряду Ф9^Ф10=Ф6^Ф8^Ф7.
Изучение особенностей биолюминесцентного отклика сенсорных микроорганизмов B.subtiiis В-10548 с отличным от E.coii K12 TG1 строением поверхностных структур, а именно имеющих строение клеточной стенки, свойственное грамположительным микроорганизмам, также позволило зафиксировать значения ЕС50, однако они могли быть рассчитаны у минимального количества (3 из 14) исследованных соединений фуллеренов, представленных их аминными производными. Сказанное относится к соединениям Ф8, Ф6, а также к Ф10, проявившим в подобной системе наибольшую биологическую активность.
Тем не менее, определенные в отношении двух сравниваемых сенсорных микроорганизмов значения ЕС50 характеризовались достоверным положительным коэффициентом корреляции (r=0,663; P<0,05), свидетельствующей о базовом универсальном механизме, лежащем в основе детектируемой биологической (антибактериальной) активности производных С60-и С70-фуллеренов (рис. 1, слева).
ЕС50 -Ecolil
ЕС50,-200-мкМ1
EC5Q-B.subtilis* ..........ЦрХКН.-смУВхс!
Рисунок 1. Соответствие значений ЕС50, определенных при тестировании биологической активности производных С60- и С70-фуллеренов в паре «E.coli K12 TG1 - B. subtilis B-10548» (слева) и биологической активности производных С60- и С70-фуллеренов, оцененных значениями EC50 (темные квадраты и сплошная линия регрессии - для E.coli K12 TG1; белые квадраты и пунктирная линия регрессии -для B. subtilis B-10548) от их заряда, характеризуемого величиной цр (справа)
Многочисленность и разнообразие исследованных производных фуллеренов, выявленная в эксперименте универсальность их активности в отношении модельных микроорганизмов, наличие антибактериальной активности у функционализированных амино-группами и ее отсутствие у функционализированных электронейтральными и карбокси-группами фуллере-нов послужили основанием для изучения роли их заряда, обеспечивающего электростатическое (кулоновское) взаимодействие с отрицательно заряженной поверхностью бактериальных клеток-мишеней, в определении наличия/ отсутствия их антибактериальной активности с использованием модифицированного метода электорофореза (табл. 1).
Полученные результаты позволили оценить исследуемых соединения Ф1, Ф2, Ф5 и Ф6 как электронейтральные, не проявляющие подвижности в электрическом поле. На этом фоне остальные образцы демонстрировали выраженную подвижность в направлении катода или анода, что позволяло отнести их соответственно к «катионоидным» (Ф7, Ф8, Ф9, Ф10) или «анионоидным» (Ф3, Ф4, Ф11, Ф12, Ф13, Ф14) соединениям.
Сопоставление полученных значений цр с приведенными выше значениями ЕС50 позволило рассчитать коэффициенты корреляции -0,737 (P<0,05) в отношении E.coli K12 TG1 и 0,366 (P>0,05) в случае проведения исследований на B.subtilis B-10548 и представить данные зависимости в виде соответствующих регрессий (рис. 1, справа). В результате, полученные
результаты подтвердили наше предположение о значимости электростатических взаимодействий в обеспечении наличия и выраженности антимикробного действия производных С60-и С70-фуллеренов, определяющих около половины подобного эффекта (54,3%) в отношении E.coli и всего лишь 13,4% - B.subtilis.
Таким образом, представляется возможным сделать три основных вывода: во-первых, выполнение процедуры функционализации фуллеренов ведет к повышению растворимости в воде и других полярных растворителях и как следствие к существенному увеличению их антимикробной активности; во-вторых, определена универсальность механизма формирования биологической активности производных фуллеренов в отношении модельных грамотрицательного и грамположительного микроорганизмов; в-третьих, с использованием технологии электрофореза в агарозном геле показано, что функционализация фуллеренов приводит к появлению анионоидных и катио-ноидных свойств и существенно влияет на уровень их биологической активности. При этом наибольшая антибактериальная активность продемонстрирована для катионоидных производных фуллеренов, способных вступать в электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженной бактериальной поверхностью. Соответственно, полученные данные могут явиться основой для создания инновационных нанодезинфектантов, представляющих интерес для практического использования в медицине и ветеринарии.
23.09.2015
Список литературы:
1. Buzea С., Pacheco I.I., Robbie K. Nanomaterials and nanoparticles: Sources and toxicity // Biointerphases. - 2007. -V. 2. - N»4. - P. MR17-MR71.
2. Terekhova V. A., Gladkova M. M. Engineered nanomaterials in soil: Problems in assessing their effect on living organisms // Eurasian Soil Science. - 2013. - V. 46. - N12. - P. 1203-1210.
3. Johnston H. J., Hutchison G. R., Christensen F. M., Aschberger K., Stone V. The biological mechanisms and physicochemical characteristics responsible for driving fullerene toxicity // Toxicol. Sci. - 2010. - V. 114. - N2. - Р. 162-182.
4. Medvedeva S.E., Tyulkova N.A., Kuznetsov A.M., Rodicheva E.K. Bioluminescent bioassays based on luminous bacteria // J. of Sib. Fed. Univ. Biol. - 2009. - V. 4. - N2. - P. 418-452.
5. Kubatova H., Zemanova E., Klouda K., Bilek K., Kadukova J. Evaluation of Effects of C60 fullerene and its derivatives on selected microorganisms // J. of Materials Science and Engineering B. - 2013. - V.3. - N7. - P. 409-417.
6. Blickley T.M., McClellan-Green P. Toxicity of aqueous fullerene in adult and larval Fundulus heteroclitus // Environ Toxicol Chem. -2008. - V. 27. - N9.- P. 1964-1971.
7. Henry T.B., Petersen E.J., Compton R.N. Aqueous fullerene aggregates (nC60) generate minimal reactive oxygen species and are of low toxicity in fish: a revision of previous reports // Curr Opin Biotechnol. - 2011. - V. 22. - N4. - Р. 533-537.
8. Tang Y.J., Ashcroft J.M., Chen D., Min G., Kim C.H., Murkhejee B. et al. Charge-associated effects of fullerene derivatives on microbial structural integrity and central metabolism // Nano Lett. - 2007. - V.7. - N3. - P. 754-760.
9. Deryabin D.G., Davydova O.K., Yankina Z.Zh., Vasilchenko A.S., Miroshnikov S.A., Kornev A.B., Ivanchikhina A.V., Troshin P.A. The Activity of [60]fullerene derivatives bearing amine and carboxylic solubilizing groups against Escherichia coli: a comparative study // J. of Nanomaterials. - 2014. V. 2014. - 9 p.
10. Li Q., Mahendra S., Lyon D.Y., Brunet L., Liga M.V., Li D., Alvarez P.J.J. Antimicrobial nanomaterials for water disinfection and microbial control: potential applications and implications // Water research. -2008. - V. 42. -P. 4591-4602.
11. Huh A.J., Kwon Y.J. «Nanoantibiotics»: A new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era // J. of Contr. Release. - 2011. - V. 156. - P. 128-145.
12. Сорокина Е.В., Юдина Т. п., Бубнов И.А., Данилов В.С. Оценка токсичности железа с помощью люминесцентного бактериального теста на рекомбинантном штамме Escherichia coli // Микробиология. - 2013. - Т. 82. - №4. - С. 428-433.
13. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С., Ефремова Л.В. Применение теста ингибирования бактериальной биолюминесценции для оценки биотоксичности углеродных наноматериалов // Микробиология. - 2012. -Т.81.-№4.-С. 532-538.
14. Алешина Е.С., Болодурина И.П., Дерябин Д.Г., Кучеренко М.Г. Коррекция результатов биолюминесцентного анализа с учетом оптических свойств исследуемых углеродных наноматериалов // Вестник Оренбургского гос. ун-та. - 2010. - №6. - С. 123-128.
15. Hartnagel U., Balbinot D., Jux N., Hirsch A. Electrophoresis of electrostatically assembled fullerene-porphyrin conjugates // Org. Biomol. Chem. - 2006. - V. 4. - P. 1785-1795.
Сведения об авторах:
Давыдова Ольга Константиновна, доцент кафедры микробиологии химико-биологического факультета Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук, 03.02.03 Микробиология 460018, Оренбург, пр-т Победы 13, тел.: (3532) 37-24-81, e-mail: okdavydova@yahoo.com
Алешина Елена Сергеевна, доцент кафедры микробиологии химико-биологического факультета Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук, 03.02.03 Микробиология 460018, Оренбург, пр-т Победы 13, тел.: (3532) 37-24-81, e-mail: esaleshina@mail.ru
Жиленков Александр Викторович, аспирант группы полифункциональных материалов и органической электроники отдела кинетики и катализа Института проблем химической физики Российской академии наук,
02.00.04 Физическая химия 142432, Московская обл., г. Черноголовка, пр. Семенова 1, e-mail: zhilenkow91@inbox.ru
