CC BY
39
БИОФИЗИКА И МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА Бактерицидное действие односменных углеродных нанотрубок
Е.А. Образцова1", Е. П. Лукашев2, А. П. Зарубина2, И.М. Пархоменко2, И. В. Яминский1
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, 1 физический факультет, кафедра физики полимеров и кристаллов. Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2;
2 биологический факультет, кафедра биофизики. Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12.
E-mail: 11 kobr@polly.phys.msu.ru
Статья поступила 11.07.2008, подписана в печать 29.09.2008.
Изучено действие одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) на клетки генно-инженерного штамма Escherichia coli К12 TGI, имеющего светящийся фенотип, обеспеченный клонированием в него lux-оперона из природных люминесцентных морских бактерий Photobacterium leiognathi. С помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) были изучены выживаемость и изменение морфологии бактериальных клеток в динамике действия ОУНТ.
Ключевые слова: нанотрубки, атомно-силовая микроскопия, спектроскопическая и микроскопическая техники в биофизике и медицинской физике.
УДК: 579. PACS: 68.37.Ps, 81.07.De, 87.64.-t.
Введение
Повышенное внимание к взаимодействию наночастиц с биологическими объектами в последние годы вызвано перспективой широкого применения нанообъектов в продуктах массового и промышленного потребления. Одним из наноматериалов, представляющих наибольший интерес для применения в биологии, медицине, производстве повседневной и высокотехничной продукции, являются углеродные материалы и особенно нанотрубки. Кроме того, известно, что такие наночастицы содержатся в продуктах горения метана и даже в выхлопных газах автомобилей [1].
Повсеместное распространение углеродных наноматериалов заставляет задуматься об их воздействии на живые организмы. Однако действие наноматериалов на биологические системы, организмы, в том числе и человека, недостаточно изучено. Результаты исследований, проводимых в различных лабораториях, во многом противоречат друг другу [2, 3]. В настоящей работе с помощью атомно-силовой микроскопии было изучено действие одностенных углеродных нанотрубок на бактериальные клетки.
Объекты и методы исследования
Объектом исследования служили бактерии генно-инженерного штамма Escherichia coli Kl2 TG1 с клонированным в него /их-опероном из светящихся морских бактерий Photobacterium leiognathi. Штамм Е. coli К12 TG1 со светящимся фенотипом получен и хранится в лаборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова. Эти бактерии применяют в качестве биолюминесцентного сенсора тест-системы «Эко-люм» для оценки токсичности различных веществ [4]. В анализах использовали ночную культуру Е. coli, выращенную на LB-бульоне при 28° С в глубинных условиях на качалке, имеющей 220 оборотов в мин.
Одностенные углеродные нанотрубки были синтезированы методом дугового разряда в лаборатории спектроскопии наноматериалов ЦЕНИ ИОФ РАН им. А. М. Прохорова. Полученные таким методом ОУНТ имеют харак-
терный диаметр от 0.7 до 2 нм и длину до нескольких мкм. Исходный нанотрубочный материал содержит лишь около 20% ОУНТ, включая в себя частицы металлических катализаторов и различные формы углерода [5]. Применение специальных химических методов [6] позволяет получать очищенные нанотрубки. В наших исследованиях было оценено действие на бактериальные клетки как очищенного, так и исходного (неочищенного) нанотрубочного материала. В экспериментах для получения суспензии порошок ОУНТ помещали в дистиллированную воду. Непосредственно перед экспериментом водную суспензию углеродных нанотрубок подвергали ультразвуковому воздействию в течение часа для разрушения крупных агрегатов.
Для экспериментов использовали суспензию ночной культуры бактерий, осажденную в объеме 1 мл при 8000£ в течение 5 мин в центрифужных пробирках (типа эпендорфы) объемом 1.5 мл. Недосадочную жидкость сливали. К биомассе бактерий в контрольные образцы добавляли стерильную дистиллированную воду, а в опытные образцы — водные суспензии одностенных углеродных нанотрубок, обеспечивающие различную степень контакта бактериальных клеток с углеродными нанотрубками, используя следующие концентрационные соотношения.
1. Смешивали водные суспензии бактериальных клеток (с концентрацией 1 - 109 клеток в 1 мл) и ОУНТ (с концентрацией 0.2 мг/мл).
2. В водную суспензию Е. coli добавляли значительно большее количество нанотрубок (с концентрацией 2 мг/мл).
3. Смешивали концентрированные пастообразные суспензии бактерий (5.6- 1012 клеток в мл) и углеродных нанотрубок (более 5 мг/мл).
Контрольные и опытные образцы выдерживали при комнатной температуре (22° С) в течение 14 сут. Пробы отбирали через 1-2 сут.
Плотность бактериальных суспензий оценивали нефе-лометрически (при длине волны А = 670 нм) и выражали числом клеток в 1 мл по предварительно составленным калибровочным кривым.
Интенсивность свечения бактерий регистрировали с помощью люминометра «Биотоке» (Россия). Интенсивность свечения бактерий связана с влиянием внешних факторов и не является строго постоянной величиной во времени, в связи с этим метод измерения токсичности не зависит от исходной первоначальной величины свечения биосенсора и необходимо постоянно сравнивать опытный образец с контрольным образцом. Измерение контроля всегда должно предшествовать измерению опыта.
Измерения токсичности образцов проводили при комнатной температуре (22°С) следующим образом. В чистые кюветы люминометра объемом 1.5 мл по 0.5 мл помещали исследуемые суспензии с концентрацией клеток 1.6 клеток на мл. Время экспозиции опытного и контрольного образца с биосенсором было одинаковым и строго фиксированным. В кюветное отделение люминометра устанавливали пробирки с образцами и регистрировали интенсивность свечения контроля /о, затем — интенсивность свечения опытного образца I. Определяли величину индекса токсичности Т во времени от 1 до 14 сут. Для получения достоверных данных одновременно регистрировали биолюминесценцию контрольных и опытных образцов (в трех повторностях). Индекс токсичности Т = 100(/о — /)//о определялся автоматически. Согласно разработанным для бактериального биолюминесцентного теста методикам, утверждены следующие критерии токсичности:
1) допустимая степень токсичности образца — уменьшение интенсивности свечения по сравнению с контрольным на 20%, Г ^ 20.
2) образец токсичен — тушение свечения опытного образца по сравнению с контрольным на 50%, Т = 20 ^50;
3) образец очень токсичен — тушение свечения в опыте по сравнению с контролем более 50%, Г ^ 50 [7, 8, 9].
Изучение состояния бактериальных клеток и анализ действия на них одностенных углеродных нанотрубок были проведены с помощью метода АСМ. Образцы для АСМ исследования были приготовлены по известным методикам [10, 11]. Для этого каплю контрольной или опытной суспензии бактерий помещали на подложку из свежесколотой слюды и высушивали. Ранее проведенные наблюдения показали, что заметной деградации образцов, приготовленных таким образом, не происходит в течение длительного времени (месяцы). Изображения были получены на атомно-силовом микроскопе Nanoscope III (Digital Instruments, США). Измерения проводили в режиме прерывистого контакта для уменьшения воздействия зонда на поверхность образца. Для анализа полученных изображений использовали программное обеспечение FerntoScan Online (Центр перспективных технологий, Россия).
Наличие ОУНТ в исследуемых образцах контролировали также с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР). Углеродные нанотрубки имеют характерный спектр КР [5]. Наличие ОУНТ на поверхности образцов отслеживали по интенсивности одной из линий в спектре (G-линии с частотой 1592 см^1). Измерения проводили на КР спектрометре Jobin Yvon Т64000 (Франция) с использованием в качестве возбуждающего излучения линию 514.5 нм Аг + -лазера.
Результаты исследований и их обсуждение
АСМ исследование состояния бактериальных клеток при действии на них одностенных углеродных нано-
трубок позволило получить и проанализировать изображения бактериальных клеток до начала, в процессе и в конце эксперимента. На рис. 1 представлены характерные АСМ изображения клеток бактерий Е. coli К12 TG1 в контрольных суспензиях. Анализ изображений показал, что популяция исходной суспензии бактерий была гетерогенна по размерам и морфологии клеток и содержала в основном морфологически полноценные клетки. Значительные различия в морфологии клеток бактерий являются следствием того, что культура бактерий развивалась несинхронно и представляла гетерогенную популяцию по фазам деления и развитию. Бактериальные клетки имели характерную палочковидную форму длиной 2-2.5 мкм, шириной около 1 мкм и высотой 250 ±50 нм.
Как нами указано ранее, для изучения действия ОУНТ на бактериальные клетки были использованы три метода приготовления образцов. В результате применения этих методов была достигнута различная степень контакта нанотрубок с бактериальными клетками. Несмотря на то что соотношение концентраций бактерий и ОУНТ в суспензиях было различным, при АСМ исследовании во всех экспериментах было выявлено сходное влияние углеродных нанотрубок на клетки Е. coli.
С помощью спектроскопии КРС на образцах, приготовленных различными методами, были выявлены области, заполненные углеродными нанотрубками. Их число и размер изменялись в зависимости от концентрации нанотрубочного материала в исследуемых суспензиях. Изменения морфологии клеток наблюдали лишь в областях, покрытых значительным слоем ОУНТ.
мкм
12 10 8 6 4 2
°0 2 4 6 8 10 12 мкм
Рис. I. АСМ изображение контрольного образца бактериальных клеток Е. coli
мкм
10 8 6 4 2
°0 2 4 6 8 10 мкм
Рис. 2. АСМ изображение бактериальных клеток Е. coli после взаимодействия с углеродными нанотрубками
Рис. 3. АСМ изображение бактериальных клеток на границе области, покрытой нанотрубочным материалом. Приведенные спектры комбинационного рассеяния света подтверждают наличие такой области. Белым цветом обозначены бактерии, имеющие непосредственный контакт с ОУНТ и вследствие этого разрушенные. Черным цветом обозначены бактерии, неимеющие непосредственный контакт с нанотрубками и сохранившие свою
морфологию
Характерное АСМ изображение бактериальных клеток, находящихся в области, покрытой нанотрубками, представлено на рис. 2. Уже на четвертый день во всех сериях эксперимента контакта ОУНТ с бактериальными клетками стали заметны изменения в морфологии клеток бактерий. Видно, что клетки, подвергающиеся действию ОУНТ, значительно уплощены по сравнению с клетками контрольных образцов, на их поверхности наблюдали повторы неровностей, высота клеток не превышала 70-80 нм. Кроме того, наблюдаемые в этом случае клетки отличались латеральными размерами.
На рис. 3 представлено АСМ изображение участка образца, частично покрытого слоем нанотрубок. Как видно на рисунке, бактерии, находящиеся в области, покрытой ОУНТ, имеют различную форму и малую высоту, в то время как клетки, не имеющие прямого контакта с нанотрубками, остаются в исходном состоянии и сохраняют характерную для бактерий морфологию.
Мы полагаем, что данный феномен можно объяснить механическим действием углеродных нанотрубок на клетки бактерий. При непосредственном контакте тонких ОУНТ с клетками бактерий они, вероятно, механически нарушают клеточную стенку и мембрану, приводя к потере содержимого цитоплазмы и вследствие этого гибели бактерий.
По результатам проведенных АСМ измерений для суспензий бактерий с использованием очищенного и исходного нанотрубочного материала принципиального различия их действия на бактериальные клетки не наблюдали. Это может свидетельствовать о том, что наблюдаемый феномен вызван действием углеродных нанотрубок на жизнеспособность бактериальных клеток, при этом примеси других форм углерода и металлических катализаторов, содержащихся в исходных неощиченных ОУНТ, полученных при их синтезе, не дополняют наблюдаемый бактерицидный эффект.
Негативное действие ОУНТ на клетки Е. coli было зарегистрировано и при исследовании биолюминесценции используемых в экспериментах бактерий со светящимся фенотипом. Известно, что тест-система на основе бактериальной биолюминесценции является высокочувствительной к различным воздействиям, проста при измерениях, характеризуется хорошим быстродействием (время анализа образца 5 мин), обеспечивает точность, воспроизводимость (ошибка эксперимента 10%), тестирование в микрообъемах (от 0.1 до 1 мл), а также корреляцию
с ответной реакцией, регистрируемой в других общепринятых тест-системах. Многочисленными исследованиями показано, что тушение свечения на 50% (EC.so — эффективная концентрация или обьем) у биолюминесцентного биотеста коррелирует с LD50 у животных [8, 9].
Биолюминесцентная система бактерий при их повреждении не функционирует. Нами выявлено, что уже через 4 дня совместной инкубации бактерий с ОУНТ во всех трех используемых методиках биолюминесценция клеток используемого штамма Е. coli резко снижалась. При этом в зависимости от концентрационных соотношений бактерий и ОУНТ индекс токсичности составлял от 30 до 80, что свидетельствовало о гибели клеток.
Заключение
Таким образом, было выявлено, что при непосредственном контакте бактериальных клеток с ОУНТ происходит разрушение бактерий. Это позволяет заключить, что одностенные углеродные нанотрубки обладают бактерицидным действием, вызывая, вероятно, механическое разрушение бактериальной клеточной стенки и нарушение мембраны. Отмеченное нами бактерицидное действие ОУНТ, возможно, перспективно для практического применения в некоторых областях медицины, пищевого, химического и других производств. В частности, одностенные углеродные нанотрубки могут быть использованы как нелетучие антисептические компоненты, входящие в состав перевязочных материалов, а также в некоторых видах упаковочных и лакокрасочных покрытий.
Списож литературы
1. Murr L.E., Bang J.J., Lopez D.A. // J. Mater. Sei. 2004. 39. P. 2199.
2. Kong S., Pinault M., Pfefferte L.D., Elimelech M. // Lang-muir. 2007. 23, N 17. P. 8670.
3. Shuedoua A.A, Castranova V., Kisin E.R. // J. Toxicology and Environmental Health. A. 2003. 66. P. 1909.
4. Данилов B.C., Зарубина А.П., Ерошников P.E. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Биология. 2002. № 3. С. 20.
5. Obraztsova E.D., Bonard J.-M., Kuznetsov V.L. et al. // Nanostructured Materials. 1999. 12. P. 56.
6. Terekhov S.V., Obraztsova E.D., Lobach Л.5., Konov V.l. // Appl. Phys. A. 2002. 74. P. 393.
7. Зарубина А.П., Мажцль M.M., Новоселова Л.A. и др. // Сенсор. 2005. № 3. С 14.
8. Kaiser K.L. // Environ. Health Perspect. 1998. 106, N 2. 10. Sokolov I.Y., Firtel M., Henderson O.S. // J. Vac. Sei. Tech-P. 583. nol. A. 1996. 14. P. 674.
9. Bulich A.A., Tung К.-К., Scheibner G. //Biolum. Chemilum. И. Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров / Под 1990. 5, N 2. Р. 71. ред. И. В. Яминского. М„ 1997.
Antibacterial action of single-walled carbon nanotubes
E. A. Obraztsova10, E. P. Lukashev2, A. P. Zarubina2, I.M. Parkhomenko2, I.V. Yaminsky1
1 Department of Polymer and Crystal Physics, Faculty of Physics;
2 Department of Biohysics, Faculty of Biology.
M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991, Russia. E-mail: "kobr@polly.phys.msu.ru.
Lately the action of various nanostuctures on biological objects became the topic of a great interest due to the potential use of nanostructured materials for numerous high-tech and everyday life products. In this work, action of single-walled carbon nanotubes on the cells of genetically engineered strain Escherichia coli K12 TGI is investigated. Bacterial cells' survival and morphological changes during the interaction with carbon nanotubes is studied by the atomic force microscopy.
Keywords: nanotubes, atomic force microscopy, spectroscopic and microscopic techniques in biophysics and medical physics.
PACS: 68.37.Ps, 81.07.De, 87.64.-t.
Received 11 July 2008.
English version: Moscow University Physics Bulletin 3(2009).
Сведения об авторах
1. Образцова Екатерина Александровна — выпускница аспирантуры; тел.: 939-10-09, e-mail: kobr@polly.phys.msu.ru.
2. Лукашев Евгений Павлович — канд. биол. наук, вед. научн. сотр.; тел.: 939-12-38, e-mail: lukashev@biophys.msu.ru.
3. Зарубина Алевтина Петровна — канд. биол. наук, ст. научн. сотр.; тел.: 939-56-03, e-mail: zarubina@>5.micro.bio.msu.ru.
4. Пархоменко Инна Михайловна — канд. биол. наук, ст. научн. сотр.; тел.: 939-12-38.
5. Яминекий Игорь Владимирович — д. ф.-м.н., профессор; тел.: 939-10-09, e-mail: yaminsly@nanoscopy.net.
