CC BY
23
УДК 628.166
Давыдова О.К., Никиян А.Н.
Оренбургский государственный университет, г Оренбург, Россия E-mail: [email protected] ; [email protected]
СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
1,3-ДИГИДРОКСИ-4-ГЕКСИЛБЕНЗОЛОМ К ДЕЙСТВИЮ УГЛЕРОДНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ
Существующие методы обеззараживания объектов окружающей среды основаны на прерывании основных путей передачи бактериальных инфекций. Для достижения этой цели в настоящее время применяются физические и химические способы. При этом первые в основном включают в себя ультрафиолетовую обработку, а вторые - обработку окислителями или специально отобранными химическими соединениями. Однако, с течением времени микроорганизмы вырабатывают защитные механизмы к подобным повреждающим воздействиям, поэтому представляется возможным сенсибилизация микроорганизмов к уже известным дезинфектантам, а также разработка новых, реализующих ранее неизвестные механизмы антибактериальной активности. Так в последние годы применение для целей дезинфекции уже получили углеродные нанотрубки и фуллерены, действие которых может быть усилено предварительной сенсибилизацией клеток-мишеней.
В тесте ингибирования биолюминесценции сенсорного штамма Escherichia coli K12 TG1 показано повышение чувствительности бактериальных клеток в присутствии 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола к повреждающему действию одностенных углеродных нанотрубок в 1,9-30 раз и к производным С60-фуллеренав 1,9-2,3 раза. В свою очередь, предварительная сенсибилизация бактериальных клеток существенно повышала сродство их поверхности к производным С60-фуллерена и доля связанных наночастиц по данным атомно-силовой микроскопии возрастала в 4,1 раза.
Таким образом, для достижения одинаково выраженного антибактериального эффекта после сенсибилизации 1,3-дигидрокси-4-гексилбензолом требуется меньшее количество углеродных наноматериалов, а дополнительным положительным результатом является агрегация бактериальных клеток и воздействующих на них частиц наноуглерода, потенциально облегчающая их последующее удаление из обеззараживаемых сред или с поверхностей.
Ключевые слова: сенсибилизация бактериальных клеток, Escherichia coli, 1,3-дигидрокси-4-гексилбензол, алкилоксибензол, наноструктурированные соединения углерода, производные фуллеренов, углеродные нанотрубки, дезинфекция, антимикробное действие.
Для обеззараживания различных сред в настоящее время применяются безреагентные (физические) и реагентные (химические) способы, включающие в основном ультрафиолетовую обработку или обработку окислителями [1]-[3]. Однако, с течением времени микроорганизмы вырабатывают защитные механизмы к подобным повреждающим воздействиям [4]: только за последние 20 лет устойчивость бактерий к ультрафиолету возросла в 4 раза, а к окислителям (хлору) в 6 раз [5]. Альтернативное решение обсуждаемой проблемы лежит в сфере поиска принципиально новых дезинфектантов, в том числе наночастиц и наноматериалов, среди которых применение для целей дезинфекции уже получили углеродные нанотрубки и фуллерены [6]-[7], функционализируемые для увеличения антимикробной активности различными химическими группировками (аддендами), попутно увеличивающими растворимость данных соединений в водной среде [8]. В целом, наноде-зинфектанты на основе углеродных наномате-риалов экономически эффективны, стабильны
в процессе хранения, а также реализуют ранее неизвестный антибактериальный механизм, устойчивость к которому у бактерий отсутствует и предположительно не может сформироваться [9]. В то же время не полностью решенной задачей является обеспечение быстрого и выраженного антибактериального эффекта подобных нанодезинфектантов, что может быть достигнуто сочетанием описанных выше подходов, а именно: предварительной сенсибилизацией клеток-мишеней с последующим воздействием на них нанодезинфектантов.
В основе сенсибилизирующего эффекта соединений общей формулы (рисунок 1), относящимся к алкилоксибензолам, лежит их амфифильный характер и определяемая этим мембранотропная активность [10]. Помимо этого показана связь растворимости алкилок-сибензолов с гидрофобностью поверхностных структур клеток микроорганизмов и их антимикробной эффективностью [11].
В связи с этим, целью данной работы было определение влияния 1,3-дигидрокси-4-
Давыдова О.К., Никитян А.Н._
гексилбензола (ГБ), на чувствительность бактериальных клеток к повреждающему действию углеродных наноматериалов.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования были использованы укороченные одностенные углеродные нанотрубки, модифицированные аминогруппами по всей поверхности и производные С60-фуллерена (Ф1-Ф3, таблица 1), ковалент-но функционализированные различными химическими группировками, присоединенными к одному из полюсов, синтезированные в Институте проблем химической физики РАН (Россия).
Для исследования биологической активности образцов углеродных наноматериалов использован люминесцирующий штамм Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами морского люминесцирую-щего микроорганизма Photobacterium leiognathi [12], выпускаемый ЗАО НВО «Иммунотех» (Россия) в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм».
Ч
Рисунок 1 - Общая структурная формула алкилоксибензолов, где Иа, Ис, и Rd представляют собой водород; а ИЬ - алкильную группу.
_Сенсибилизация бактериальных клеток...
При проведении исследований водный раствор ГБ с концентрациями 0,00001 масс. %; 0,00005 масс. % и 0,0001 масс. % в равных объемах вносили в суспензию бактериальных клеток (108 КОЕ/мл), после чего выдерживали в течение 60 мин при 25°С для достижения эффекта сенсибилизации. В контрольные пробы вносили идентичные объемы растворителя (воды) и инкубировали в тех же условиях. Далее, в опытные и контрольные пробы вносили водную суспензию углеродных нанотрубок с содержанием от 4 мг/мл до 0,004 мг/мл или производных С60-фуллерена с содержанием от 0,6 мг/мл до 0,006 мг/мл, после чего образцы помещали в измерительный блок микропланшетного биолюминометра ЬМ-01Т («1шшипо1есЬ», Чехия), с использованием которого в течение 60 минут динамически измеряли интенсивность биолюминесценции, прямо отражающую развитие антибактериального эффекта. Оценку интенсивности свечения рассчитывали в относительных величинах по математическому алгоритму (1к х1о Лкп х1оп ), где 1к
г ^ 4 0 мин 60 мин 60 мин 0 мин7 7
и 1о - интенсивность свечения контрольных и опытных проб соответственно. Полученные подобным образом значения интенсивности свечения сенсорных микроорганизмов использовались для расчета величины ЕС50 - концентрации производных фуллеренов, вызывающих подавление биолюминесценции на 50% от кон -трольных значений.
Для изучения влияния ГБ на степень сродства бактериальной поверхности к производным С60-фуллеренабыл использован атомно-силовой микроскоп СММ-2000 (ОАО «Завод
Таблица 1 - Общая химическая структура использованных производных С60-фуллерена
n R Обозначение
4 vwan N —^' \-/ N =/ Ф1
5 ^NH NH3+—CF3COO" Ф2
5 vvw\e ^ ^ NH3+—CF3COO" Ф3
ПРОТОН-МИЭТ», Россия) и методика пробо-подготовки образцов, описанная в [13]—[14].
Все эксперименты выполнены не менее чем в трех повторностях и обработаны методами вариационной статистики с применением пакета компьютерных программ «Statistica» V8 («StatSoft Inc.», США).
Результаты и обсуждение
Влияние ГБ на чувствительность бактериальных клеток к повреждающему действию углеродных нанотрубок было оценено в тесте ингибирования биолюминесценции сенсорного штамма E. coli K12 TG1, что позволило через параметр бактериальной биолюминесценции оценить развитие антибактериального эффекта при воздействии различных концентраций углеродных нанотрубок (рисунок 2А), а также количественно охарактеризовать его величинами ЕС50 при сенсибилизации клеток разным содержанием ГБ относительно контроля (К) к воздействию наноматериалов (рисунок 2Б).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ГБ в использованном диапазоне концентраций не влияет на биолюминесценцию/ жизнеспособность бактериальных клеток-мишеней, но по мере роста концентраций прогрессивно увеличивает их чувствительность к последующему повреждающему воздействию
углеродных нанотрубок. Так, увеличение концентрации сенсибилизатора с 0,00001 до 0,00005 и далее до 0,0001 масс. % прогрессивно снижало значения ЕС50 для углеродных нанотрубок от 1,5 мг/мл (контроль) до 0,77, 0,45 и 0,05 мг/мл, соответственно. Таким образом, для достижения одинаково выраженного антибактериального эффекта после сенсибилизации ГБ требуется меньшее количество наноде-зинфектанта (углеродных нанотрубок), а при сохранении равных концентраций в варианте сенсибилизации нанотрубки оказывают в 1,1-32 раз более быстрый и в 1,9-30 раз более выраженный антибактериальный эффект.
Влияние ГБ на степень сродства бактериальной поверхности к производному С60-фуллерена Ф1 было оценено методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Полученные на изображениях интактные клетки не имели на своей поверхности каких-либо включений и характеризовались типичными для данного вида формой и размерами (рисунок 3А). Контрольное воздействие фуллерена Ф1 сопровождалось визуализацией в образцах ряда округлых образований диаметром от 70 до 350 нм, представляющих собой ассоциаты данного соединения наноуглерода, неравномерно распределенные по поверхности бактериальных клеток и на подложке. Так, последующий статистический
Рисунок 2 - Развитие антибактериального эффекта. Пояснения в тексте.
Давыдова О.К., Никитян А.Н.
Сенсибилизация бактериальных клеток..
А Б В
Рисунок 3 - АСМ-изображения клеток E.coliK12 TG1. Пояснения в тексте.
Таблица 2 - Величина ЕС50 для производных фуллеренов Ф1, Ф2, Ф3 при воздействии на E.coli K12 TG1 в
различных условиях контакта
Условия контакта Ф1 Ф2 Ф3
Воздействие на интактные клетки 0,0120 0,0106 0,0080
Воздействие на клетки, сенсибилизированные 0,0001%ГБ 0,0052 0,0049 0,0042
анализ свидетельствовал об установлении физического контакта бактериальной поверхности с 18% наночастиц фуллерена Ф1, в то время как остальные 82% были визуализированы вне связи с бактериальными клетками (рисунок 3 Б). В свою очередь предварительная сенсибилизация бактериальных клеток ГБ существенно повышала сродство их поверхности к наноча-стицам фуллерена Ф1 и доля частиц, установивших физический контакт с бактериальной поверхностью возрастала в 4,1 раза (до 74%), в то время как в свободном состоянии оставалось не более 26% наночастиц (рисунок 3В). Итоговым результатом проведенной сенсибилизации явилось более выраженное развитие антимикробного эффекта в 1,9-2,3 раза превышающее таковое в условиях отсутствия ГБ (таблица 2).
Таким образом, структурные особенности 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола позволяют ему
функционировать в качестве своеобразного «склеивающего» агента (англ. - cross-linker) [15], повышающего вероятность физического контакта между бактериальными клетками-мишенями и частицами наноуглерода. Результатом подобной сенсибилизации является более выраженное и более быстрое развитие антимикробного эффекта, а дополнительным положительным результатом является агрегация бактериальных клеток и воздействующих на них частиц наноуглерода, потенциально облегчающая их последующее удаление из обеззараживаемых сред или с поверхностей. Проведенные экспериментальные исследования формируют основу для разработки инновационных нанодезинфектантов и их композиций, представляющих интерес для практического использования в дезинфектологии, санитарии и гигиене.
13.05.2017
Авторы выражают благодарность Дерябину Д.Г. за обсуждение результатов и Трошину А.П. за любезно предоставленные углеродные наноматериалы.
Список литературы:
1. Antibiotics: Targets, Mechanisms and Resistance / Claudio O. Gualerzi et al. - 2013. - 576 р.
2. Драгинский, В. Л. Образование токсичных продуктов при использовании различных окислителей для очистки воды / В. Л. Дра-гинский, Л.П. Алексеева // Технология очистки природных вод: сб. ст. - М.: б. и., 2006. - С. 142-154.
3. Huh, A.J. «Nanoantibiotics»: A new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era / A.J. Huh, Y.J. Kwon // J. of Contr. Release. - 2011. - V. 156. - P. 128-145.
4. Martinez, J.L. General principles of antibiotic resistance in bacteria / J.L. Martinez // Drug Discov Today Technol. - 2014. - V.11. -P. 33-39.
5. Effect of chlorination and ultraviolet disinfection on tetA-mediated tetracycline resistance of Escherichia coli / J.J. Huang et al. // Chemosphere. - 2013. - V. 90(8). - P. 2247-2253.
6. Environmental implications and applications of carbon nanomaterials in water treatment / S.R. Chae et al. // Water Sci Technol. -2013. - V.67(11). - P. 2582-2586.
7. Removal of dissolved organic matter (DOM) from raw water by single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) / J.C. Lou et al. // J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. - 2011. - V. 46(12). - P. 1357-1365.
8. The Activity of [60]fullerene derivatives bearing amine and carboxylic solubilizing groups against Escherichia coli: a comparative study / D.G. Deryabin et al. // J. of Nanomaterials. - 2014. - V. 2014. - 9 p.
9. Antimicrobial nanomaterials for water disinfection and microbial control: potential applications and implications / Q. Li et al. // Water research. - 2008. - V. 42. - P. 4591-4602.
10. Membranotropic autoregulatory factors in methane oxidising bacteria / E.S. Babusenko et al. // Russian Chemical Reviews. - 1991. -V. 60(11). - P. 1221-1231.
11. Antimicrobic features of phenolic lipids / Iu.A. Nikolaev et al. // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. - 2010. - V. 46(2). - P. 172-179.
12. Bioluminescent bioassays based on luminous bacteria / S.E. Medvedeva et al. // J. of Sib. Fed. Univ. Biol. - 2009. - V. 4. - №2. -P. 418-452.
13. Atomic force microscopy recognition of protein A on Staphylococcus aureus cell surfaces by labeling with IgG-Au conjugates / E.B. Tatlybaeva et al. // Beilstein J. Nanotechnol. - 2013. - V.4. - P. 743-749.
14. Nikiyan, H. Humidity-Dependent Bacterial Cells Functional Morphometry Investigations Using Atomic Force Microscope / H. Nikiyan, A. Vasilchenko, D. Deryabin // International Journal of Microbiology. - 2010. - Article ID 704170. - 5 p.
15. The functional valency of dodecamannosylated fullerenes with Escherichia coli FimH-towards novel bacterial antiadhesives / M. Durka et al.// Chem Commun (Camb). - 2011. - V. 28; 47(4). - P. 1321-1323.
Сведения об авторах:
Давыдова Ольга Константиновна, доцент кафедры биохимии и микробиологии Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук, доцент 460018, Оренбург, пр. Победы 13, e-mail: [email protected]
Никиян Айк Николаевич, доцент кафедры биофизики и физики конденсированного состояния Оренбургского государственного университета, кандидат физико-математических наук, доцент 460018, Оренбург, пр. Победы 13, e-mail: [email protected]
