CC BY
76
УДК 579.63; 57.083; 57.044
Алешина Е.С., Дерябин Д.Г., Ефремова Л.В.
Оренбургский государственный университет Е-mail: [email protected]
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ УГЛЕРОДНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ В ТЕСТЕ БАКТЕРИЦИДНОСТИ
Исследовано влияние 10 углеродных наноматериалов (УНМ), представленных одно- и многостенными нанотрубками, нановолокнами, С60- и С70-фуллеренами, а также аморфным углеродом, на жизнеспособность Escherichia coli K12 TG1 и Bacillus subtilis 168. С использованием данных модельных микроорганизмов продемонстрирован развивающийся во времени бактерицидный эффект УНМ, зависящий от структурной организации воздействующих соединений наноуглерода. Сравнение реакции названных тест-объектов позволило констатировать несколько большую чувствительность к повреждающему действию УНМ у B.subtilis, нежели E.coli, при высокой сопоставимости полученных с их использованием результатов биотестирования (r=0,927; P<0,005).
Ключевые слова: углеродные наноматериалы, биотестирование, бактерицидность, Escherichia coli, Bacillus subtilis
Ожидаемый прогресс в производстве и использовании углеродных наноматериалов (УНМ) одним из своих последствий может иметь их массивное поступление и накопление в абиотических средах и компонентах биоты с формированием соответствующих рисков [1]. Сказанное определяет становящийся все более актуальным заказ на всестороннее тестирование биологической безопасности УНМ в ходе их разработки, регистрации, производства, оборота, использования и утилизации [2]. Заметную роль в решении данной задачи могут сыграть микроорганизмы, в настоящее время рассматриваемые в качестве одной из важных «мишеней» для воздействия наночастиц, специфически обусловленного их малыми размерами и высокоразвитой межфазной поверхностью [3]. В частности, введенные в действие национальные нормативы [4] регламентируют исследование биологической активности наноматериалов в отношении модельных грамотрицательного (Escherichia coli) и грамположительного (Bacillus subtilis) микроорганизмов, являющихся типичными представителями водных и почвенных микробиоценозов. Однако, до настоящего времени результаты подобного биотестирования относительно немногочисленны [5, 6] и не позволяют получить законченное представление по обозначенной проблеме.
В этой связи целью настоящей работы явилось исследование влияния 10 коммерчески доступных и лабораторных образцов углеродных наноматериалов на жизнеспособность E.coli и B.subtilis, предусматривающее их ранжирование по степени подобной биологической активности, а также сравнение чувствительности использованных тест-микроорганизмов к повреждающему действию УНМ.
При проведении исследований использованы 10 углеродных наноматериалов, в том числе
четыре образца коммерчески доступных одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) производства фирмы «НаноКарбЛаб» (Россия). Их перечень включал образцы с 2-5% концевых СООН-групп (ОУНТ-1) или NH2-групп (ОУНТ-2), укороченные варианты с 5-10% концевых СООН-групп (ОУНТ-3), а также одностенные углеродные нанотрубки с отожженными под вакуумом концевыми СООН-группами (ОУНТ-4). Прочие исследованные лабораторные препараты были представлены синтезированными в РХТУ им. Д.И. Менделеева нановолокнами (НВ) и функци-онализированными нановолокнами (ф-НВ), а также созданными в ИПХФ РАН многостенными углеродными нанотрубками (МУНТ), С60- и С70-фуллеренами и аморфным углеродом (АУ). Морфологическая характеристика названных УНМ, подтверждающая их соответствие заявленным параметрам, дана нами ранее с использованием атомно-силовой микроскопии [7]. В свою очередь проведенное исследование их химического состава масс-спектральным методом с индуктивно-связанной плазмой на квадрупольном масс-спектрометре «Е1ап-6100» («РегкшЕ1тег», США) констатировало высокую степень очистки от технологических примесей [8], что в дальнейшем позволило связать регистрируемую биологическую активность именно с собственными свойствами УНМ. Перед проведением исследований их навески в количестве 0,2 мг помещали в стеклянные емкости, куда вносили по 1 мл химически чистой дистиллированной воды, после чего для повышения степени дисперсности формируемых суспензий УНМ обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в течение 30 мин в источнике ванного типа (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия).
В качестве объекта воздействия использовали лабораторные штаммы Б.соИ К12 Т01 и БзиЫйк 168, являющиеся типичными представителями
Проблемы экологии Южного Урала
своих видов и широко применяемые при проведении различных микробиологических или молекулярно-генетических исследований. Перед проведением исследований их выращивали на LB-агаре при 30еС в течение 24 часов, после чего переносили в LB-бульон, отмывали центрифугированием, после чего суспендировали в дистиллированной воде до оптической плотности 0,5 ед. при 600 нм (не подращивали). Полученные пробы в соотношении 1:1 смешивали с тестируемыми суспензиями УНМ, после 60, 120 и 180 минут контакта отбирали аликвоты по 100 мкл, из которых готовили серии 10-кратных разведений, в объеме 10 мкл высеваемых на поверхность LB-агара. В качестве контроля использовали образцы, смешанные с дистиллированной водой и инкубируемые в аналогичных условиях. После дополнительного культивирования при 30еС в течение 24-48 часов подсчитывали количество выросших колоний, после чего оценивали наличие и выраженность бактерицидного эффекта УНМ при различной продолжительности воздействия относительно контроля (%).
Все эксперименты выполнены не менее чем в трех повторностях и обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета компьютерных программ «Statistica» V8 («StatSoft Inc.», США), в том числе с использованием модуля корреляционного анализа.
Полученные результаты позволили констатировать у исследуемых углеродных наноматериалов способность к индукции бактерицидного эффекта, зависящего от структурной организации УНМ, развивающегося во времени с увеличением продолжительности контакта, а также неодинаково выраженного в отношении использованных бактериальных клеток-мишеней (таблица 1).
Так 60-минутный контакт УНМ с клетками E.coli K12 TG1 более чем в половине случаев вел к
развитию только достаточно слабых (<20%) бактерицидных эффектов, оказывающихся наиболее выраженными при использовании функционали-зированных нановолокон (61,1%), С70-фуллере-на (51,4%), а также неструктурированного аморфного углерода (51,0%). В свою очередь аналогичный контакт УНМ с ЕжЬИШ 168 сопровождался формированием несколько более количественно выраженных эффектов, проявляющихся в гибели более 50% клеток-мишеней также при использовании только трех соединений наноуглерода: ОУНТ-4, С70-фуллерена и АУ.
Увеличение времени воздействия до 120 и 180 минут сопровождалось ростом уровней регистрируемой бактерицидности, количественно увеличившейся у ранее названных соединений, а также ведущей к расширению спектра УНМ с подобной активностью. В результате к концу исследования при использовании как Е.соН К12 Т01, так и ЕжЫШз 168 бактерицидный эффект в отношении более 50% клеток-мишеней мог быть продемонстрирован для шести соединений наноуглерода, в том числе с использованием обоих тест-объектов для ОУНТ-3 и -4, ф-НВ, С70-фуллерена и АУ. В свою очередь для С60-фуллерена подобная активность в наибольшей степени была выражена только в отношении Е.соН К12 Т01, а для НВ - в отношении ЕжЫШз 168. Тем не менее, сравнение реакции двух модельных микроорганизмов (рисунок 1) позволило констатировать высокую сопоставимость полученных с их использованием результатов биотестирования, характеризуемую высоким положительным коэффициентом корреляции (г=0,927; Р<0,005).
Таким образом, полученные результаты позволяют ранжировать исследованные морфологически различные углеродные наноматериалы по степени их биологической активности, определяемой способностью к индукции гибели бак-
Таблица 1. Выраженность бактерицидного эффекта (в % по отношению к контролю) при воздействии углеродных наноматериалов (0,1 мг/мл) на Е.соїі К12 ТС1 и Е.тЫШ& 168 при различной продолжительности контакта
Исслєдуємьіє УНМ E.coli K12 TG1 B.subtilis 168
60 мин 120 мин 180 мин 60 мин 120 мин 180 мин
ОУНГ-1 9,1 17,3 25,0 9,7 15,0 24,0
ОУНГ-2 7,0 24,8 38,0 19,7 27,1 36,0
ОУт-з 14,9 23,6 62,0 20,2 47,9 84,0
ОУНМ 9,1 27,9 67,0 77,8 81,7 90,0
МУт 0 0 0 0 5,3 7,0
нв 4,4 25,9 41,0 27,7 54,0 62,3
Ф-НВ 61,1 66,2 70,0 24,9 50,9 75,0
С60-Фуллєрєн 21,8 31,2 52,0 30,5 29,3 45,7
С70-Фуллєрєн 51,4 63,7 70,0 79,1 85,3 95,0
АУ 51,0 80,2 96,0 85,9 91,0 96,0
териальных клеток-мишеней и оказывающейся наибольшей у аморфного углерода, а наименьшей - у многостенных углеродных нанотрубок. При этом важным результатом подобного исследования является заключение о том, что повышение степени структурированности наноуглерода и использованной тест-системе вело не к повышению, но к понижению выраженности бактерицидного эффекта. Соответственно, сказанное свидетельствует о возможности установления биологически безопасных концентраций большинства исследованных УНМ в природных средах на уровнях не выше таковых, ранее регламентированных для аморфного углерода (сажи, разупорядоченного монокристаллическо-го графита). Для окончательного же решения данного вопроса необходимым представляется получение согласованной оценки активности наноуглерода по результатам тестирования на биологических объектах различного уровня организации.
Одновременно выявление достаточной чувствительности модельных штаммов Е.ооН и Б.зиЬйШ к повреждающему действию наноуглерода, а также высокой степени сопоставимости получаемых с их использованием оценок, свидетельствуют об адекватности подобного подхода для оценки биологической безопасности УНМ. При этом особенности реагирования названных тест-объектов на воздействие различных соединений наноуглерода позволяют рекомендовать их взаимодополняющее исполь-
БЦ, % -E. coli
БЦ, % -B.subtilis
Рисунок 1. Соответствие значений бактерицидности углеродных наноматериалов (0,1 мг/мл) в отношении E.coli K12 TG1 (по оси ординат) и B.subtilis 168 (по оси абсцисс), определенных после 180 минут контакта
зование, потенциально способное сформировать комплексные представления о направленности и выраженности эффектов отдельных УНМ на грамположительный и грамотрицательный компоненты микробиоценоза.
12.09.2011
Список литературы:
1. Gottschalk F., Sonderer T., Scholz R.W., Nowack B. Modeled environmental concentrations of engineered nanomaterials (TiO2, ZnO, Ag, CNT, Fullerenes) for different regions // Environmental Science & Technology. - 2009. - V. 43. - № 24. - P. 9216-9222.
2. Hurt R. H., Monthioux M., Kane A. Toxicology of carbon nanomaterials: Status, trends, and perspectives on the special issue // Carbon. - 2006. - V. 44, - № 6, - P. 1028-1033.
3. Kang S., Herzberg M., Rodrigues D. F., Elimelech M. Antibacterial effects of carbon nanotubes: size does matter! // Langmuir. -2008. - V. 24. - № 13. - P.6409-6413.
4. Методические указания 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза». М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.
5. Mortimer M., Kasemets K., Heinlaan M., Kurvet I., Kahru A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles // Toxicology in Vitro. - 2008. - V. 22. - № 5. - P. 1412-1417.
6. Zheng H., Liu L., Lu Y., Long Y., Wang L., Ho K.P., Wong K.Y. Rapid determination of nanotoxicity using luminous bacteria // Anal. Sci. - 2010. - V. 26. - № 1. - P.125-128.
7. Дерябин Д.Г., Васильченко А.С., Алешина Е.С., Тлягулова А.С., Никиян А.Н. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии // Российские нанотехнологии. -2010. - Т. 5. - № 11-12. - С. 103-108.
8. Дерябин Д. Г., Алешина Е. С., Тлягулова А.С. Острая токсичность углеродных наноматериалов в отношении Escherichia coli частично определяется присутствием технологических примесей // Российские нанотехнологии. - 2011. - Т. 6. - № 7-8. -С. 88-93.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Аналитической ведомственной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (проект №2.1.1/9770)
Сведения об авторах: Алешина Елена Сергеевна, доцент кафедры микробиологии Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук Дерябин Дмитрий Геннадьевич, заведующий кафедрой микробиологии Оренбургского государственного университета, доктор медицинских наук, профессор
