CC BY
71
© ДВОРНИЧЕНКО В.В., ПОНОМАРЕНКО Д.М., ШЕВЧУК А.В., ЮКАЛЬЧУК Д.Ю., КЛИМОВА И.Д., БОГАЧЕВ Д.Ю.,
ОРИЩЕНКО К.Е., РОГАЧЕВ В.А., ШУРДОВ М.А. — 2011 УДК 616-006-085.36.015.5
ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ, ПЕРЕНОСИМОСТИ И ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА «ПАНАГЕН» У ЗДОРОВЫХ ДОБРОВОЛЬЦЕВ
Виктория Владимировна Дворниченко1-2, Дмитрий Михайлович Пономаренко1-2, Анна Витальевна Шевчук2, Денис Юрьевич Юкальчук2, Ирина Дмитриевна Климова2, Сергей Станиславович Богачев3, Константин Евгеньевич Орищенко3, Владимир Алексеевич Рогачев3, Михаил Аркадьевич Шурдов4 ('Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра онкологии, зав. — д.м.н., проф. В.В. Дворниченко; 2Иркутский областной онкологический диспансер, гл. врач — д.м.н., проф. В.В. Дворниченко; 3Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, директор — д.б.н., акад. РАН Н.А. Колчанов, лаборатория молекулярной биологии клетки, зав. — д.б.н. С.С. Богачев; 4000 «Панаген», Горно-Алтайск, директор — М.А. Шурдов)
Резюме. Исследование посвящено изучению переносимости и влиянию на кроветворение препарата «Панаген». Препарат представляет собой фрагменты полноценной геномной ДНК, выделенной бесфенольным методом из плаценты здоровых рожениц. Клиническое исследование 1 фазы проведено на базе Иркутского областного онкологического диспансера в соответствии с требованиями нормативных документов. Препарат испытывался у 30 здоровых добровольцев, в различных дозовых режимах. В результате исследования установлена оптимальная доза препарата, показана хорошая переносимость и безопасность. На основании полученных данных, рекомендовано дальнейшее изучение во 2-й фазе клинических исследований в качестве стимулятора кроветворения у онкологических больных, получающих химиотерапию.
Ключевые слова: «Панаген», стимуляторы гемопоэза, нуклеиновые кислоты
ASSESMENT OF SAFETY, TOLERABILITY, AND HEMOPOIETIC ACTIVITY OF PREPARATION «PANAGEN» IN HEALTHY VOLUNTEERS
V.V. Dvornichenko1’2, D.M. Ponomarenko1-2, A.V. Shevchuk2, D.Y. Yukalchuk2,1.D. Klimova2,
S.S. Bogachev3, K.E. Orishchenko3, V.A. Rogachev3, M.A. Shurdov4 (Irkutsk State Institute of Postgraduate Medical Education; 2Irkutsk Regional Oncology Dispensary; 3Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk; 4LLC Panagen, Gorno-Altaisk)
Summary. Study investigates the tolerability and effects on hemopoiesis drug «Panagen». The drug is a mixture of fragments a full genomic dNa, isolated from the placenta healthy women. Phase 1 clinical study, conducted on the basis Irkutsk Regional Oncology Dispensary, in accordance with the requirements of normative documents. The drug was tested in 30 healthy volunteers, in various dose regimes. The study established the optimal dose of the drug and showed good tolerability and safety. On the basis of the received data, recommended further study in phase 2 clinical trials as a stimulator of hemopoiesis in cancer patients receiving chemotherapy.
Key words: «Panagen», stimulators of hematopoiesis, nucleic acids.
Миелосупрессия — основной вид токсичности современной химиотерапии. Для профилактики и лечения этого побочного действия химиопрепаратов, используются стимуляторы гемопоэза — препараты, обладающие способностью усиливать пролиферацию и диффе-ренцировку клеток крови. К ним относятся вещества, имеющие разную структуру, источник происхождения и механизм действия, причем, каждой группе присущи свои преимущества и недостатки [3,6]. Поиск веществ, отличающихся высокой гемостимулирующей активностью при отсутствии токсических свойств, является по-прежнему актуальным.
В течение многих лет, интерес вызывают препараты экзогенных ДНК, способные проникать в клетку и активировать процессы репарации клеточных повреждений, индуцированных облучением [7,8]. Способность экзогенных гомологичных нуклеиновых кислот усиливать гемопоэз была установлена также на других моделях миелосупрессии, в частности цитостатической [12]. Усиление костномозгового и селезеночного кроветворения было обнаружено и при введении ДНК здоровым животным [11].
Результатом экспериментальных работ по исследованию гемостимулирующих, иммуномодулирующих и протекторных свойств нуклеиновых кислот в нашей стране является создание и испытание в клинике таких препаратов как Деринат, Дезоксинат, Полидан. Эти лекарственные средства, основанные на ДНК, оказывают универсальный гемостимулирующий эффект, независимо от вида цитостатика и/или лучевой терапии [1,2,4,13].
0днако, разрешенные к клиническому применению препараты получены из гетерологичного для человека
биологического материала. Интенсивность же лейкостимулирующего эффекта ДНК может зависеть от её видовой принадлежности [10].
В ООО “Панаген” разработан препарат «Панаген» в виде таблеток, представляющий собой фрагментированный нуклеопротеидный комплекс, выделенный из плаценты человека. Способ получения позволяет выделить полноценную геномную дНк с сохранением тех ее фрагментов, которые прочно ассоциированы с белками ядерного матрикса. Размер фрагментированной ДНК колеблется от 200 до 6000 пар оснований. В доклинических исследованиях препарат проявлял радиозащитные свойства, статистически значимо уменьшал рост экспериментальной опухоли у мышей, а так же оказывал гемостимулирующее действие при циклофосфановой миелосупрессии [9,5,15].
В настоящее время оформлены лабораторный регламент на производство субстанции препарата «Панаген», опытно-промышленный регламент на производство таблетированной формы препарата, проекты ФСП на субстанцию и лекарственную форму, технические условия на сырье [14].
Цель работы: изучить безопасность, переносимость и возможную гемостимулирующую активность препарата «Панаген», в рамках клинического исследования фазы 1 у здоровых добровольцев.
Материалы и методы
Исследование фазы I препарата «Панаген» выполнено в соответствии с разрешением Министерства здравоохранения и социального развития Российской
Федерации на нроведение клинических исследований от 12.05.2008 г. №209, и одобрения комитетов но этике нри Федеральной службе но надзору в сфере здравоохранения и социального развития от 15.10.2008 г. и Областном онкологическом диснансере.
Исследовалась таблетированная форма нренарата «Панаген», действующим началом которого является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Источником ДНК служит нлацента здоровых рожениц. ДНК выделяют бесфенольным методом, что нозволяет нолучить нолноценную геномную ДНК с сохранением тех ее фрагментов, которые in vivo нрочно ассоциированы с белками ядерного матрикса. ДНК фрагментируется ультразвуковым дезинтегратором, в результате чего нолучают смесь фрагментов размером 200-6000 н.о. Удержание ДНК в одной таблетке составляет 5 мг. Нанолнитель содержит всномогательные вещества: крахмал картофельный, сахарозу, лактозу, кремний диоксид коллоидный, кальция стеарат. B состав оболочки входит ацетилфта-лилцеллюлоза, масло касторовое, титана двуокись.
B исследование включались здоровые добровольцы в возрасте от 18 до 65 лет без нризнаков нарушения кроветворения, без заболеваний крови, с отсутствием в анамнезе тяжелых хронических заболеваний нечени, сердца, ночек, желудка, кишечника, ноджелудочной железы, онкологических заболеваний, острых инфекционных заболеваний. Bсегo нренарат был назначен 30 добровольцам. Bключение в исследование осуществлялось носле нолучения добровольного информированного согласия. Изучение свойств нренарата нроводи-лось в 4-х груннах:
— 1-я грулт: 5 человек, «Панаген» назначался неро-рально ежедневно в дозе 5 мг 3 раза в день, в течение 30 суток. Cутoчнaя доза нренарата составила 15 мг.
— 2-я грунна: 5 человек, «Панаген» назначался неро-рально ежедневно в дозе 5 мг 6 раз в день, в течение 30 суток. Cутoчнaя доза 30 мг.
— 3-я грунна: 5 человек, «Панаген» назначался неро-рально ежедневно в дозе 10 мг 6 раз в день, в течение 30 суток. Cутoчнaя доза 60мг.
— 4-я грулт: Cxемa была такой же, как для второй грунны. 15 человек, «Панаген» назначался нерорально ежедневно в дозе 5 мг 6 раз в день, в течение 30 суток. Cутoчнaя доза 30 мг.
Исследование было разделено на две стадии. На нервом этане нреднолагалось оценить безонасность и нере-носимость нренарата у здоровых добровольцев в трех дозовых режимах — 15 мг, 30 мг и 60 мг/сутки нри дробном равномерном нриеме в течение активного нериода суток на нротяжении 30 дней. Проводилось носледова-тельное изучение нарастающих доз нренарата, то есть нервоначально было обследовано 5 человек, нринимаю-щих в сутки 15 мг нренарата, затем 5 человек с суточной дозой — 30 мг, и затем — 5 человек с суточной дозой 60 мг. При таком снособе введения нренарата, ежедневный нрием для суточной дозы 15 мг составляет — 1 таблетка три раза в день, для суточной дозы 30 мг — 1 таблетка шесть раз в день, для суточной дозы 60 мг — 2 таблетки шесть раз в день. Количество нренарата нринятого в течение месяца составляет для нервой грунны 450 мг, для второй грунны 900 мг и для третьей грунны 1800 мг. Итогом данного этана является онределение безонасно-сти и нереносимости различных доз и выбор онтималь-ной дозы нренарата.
На втором этане исследовалась нереносимость, без-онасность и фармакологическую активность выбранной онтимальной дозы нренарата в грунне здоровых добровольцев из 15 человек.
Cxемa обследования включала многократные анализы нериферической крови до нриёма и на фоне нриёма нренарата «Панаген». Кроме этого, изучалось содержание гемоноэтических стволовых клеток крови CD34+ до нриема нренарата и в конце терании. Также оценивалось общее состояние и возможные негативные реакции. Анализы нроводились до начала нриема
«Панагена» и каждые 3 дня в течение 30 дней во время приема препарата.
Все данные и результаты заносились в таблицы и обрабатывались статистически, с использованием критерия Стьюдента для связанных выборок. Если выборка не удовлетворяла нормальному распределению, то данные обрабатывались при помощи критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и однофакторного дисперсионного анализа, используя F-критерий. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Побочные эффекты оценивались на протяжении всего курса терапии и через 30 дней после ее завершения. Оценка проводилась по шкале токсичности СТС АЕ v3,0 NCI, 2003. Применение «Панагена» оказалось безопасным во всех исследуемых дозовых режимах. Максимальная переносимая доза не достигнута. В ходе исследования были отмечены следующие негативные проявления: головная боль, повышение температуры тела до субфебрильных цифр, слабость, изжога. Данные случаи носили единичный характер, не установлена связь частоты побочных эффектов с дозой препарата. Выраженность по критериям СТС не превышала 1-ой степени. Связь с применением исследуемого препарата являлась не очевидной, но не может быть опровергнута. Серьезных негативных проявлений не отмечено.
На основании проведенных анализов в первой группе, где добровольцы принимали по 15 мг/сутки препарата, обнаружено незначительное увеличение % содержания моноцитов в периферической крови. Необходимо отметить, что содержание моноцитов до приема препарата находилось на очень низком уровне (1,6-2,7%), на границе, либо ниже физиологической нормы (3-11%). Прием препарата приводил к небольшому увеличению, максимум до 3,9%. Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента, однако р<0.2, что может быть связано с малым количеством данных включенных в выборку. Также отмечено небольшое снижение абсолютного количества CD34+^B45+ клеток (p>0,95 F- критерий и P<0,05 согласно критерию Манна-Уитни). Однако это снижение происходило в пределах физиологической нормы и его связь с действием препарата не очевидна. Все остальные показатели крови существенно не изменялись.
Во второй группе добровольцы принимали «Панаген» по 30мг/сутки в течение 30 дней. На фоне приема препарата у добровольцев происходило значительное увеличение от 2 до 6 раз % содержания моноцитов в периферической крови (Р<0.99 F-критерий, p<0,01 согласно критерию Манна-Уитни), что может говорить о возможном влиянии «Панагена» на пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток. Причем происходило увеличение % CD34+/CD45+ клеток относительно общего числа лейкоцитов и абсолютного количества CD34+/CD45+ клеток (p<0,05 согласно критерию Манна-Уитни). Кроме этого выявлено явное снижение щелочной фосфатазы (Р<0.05 по критерию Манна-Уитни и P>0,95 F-критерий). Таким образом, можно сделать вывод о статистически значимом влиянии «Панагена» на увеличения % содержания моноцитов, % CD34+/CD45+ клеток относительно общего числа лейкоцитов, абсолютного количества CD34+/CD45+ клеток и уменьшения щелочной фосфатазы.
В третьей группе доза препарата принимаемая добровольцами была увеличена до 60 мг/сутки и период приема составлял 30 дней. Увеличение дозы не привело к ухудшению общего физиологического состояния добровольцев. На фоне приема препарата происходило снижение абсолютного количества CD34+/CD45+ клеток (Р<0.05 по критерию Манна-Уитни и P>0,95 F-критерий), однако исходный уровень был высоким и снижение происходило до физиологической нормы. Также отмечено незначительное снижение % лимфо-
цитов в периферической крови, щелочной фосфата-зы, тромбоцитов и небольшой увеличение диастазы. Все изменения этих показателей находятся в пределах физиологической нормы и выявленные различия являются статистически не значимыми (P<0.2 t-критерий).
Таким образом, в результате первой части испытаний была выбрана оптимальная доза препарата, составляющая 30 мг/сутки и исследование безопасности, переносимости и гемостимулирующей активности «Панагена» было продолжено в четвертой группе на 15 здоровых добровольцах.
В четвертой группе на фоне приема препарата явной, статистически значимой гемостимулирующей активности препарата не определено. Происходило снижение щелочной фосфатазы (Р<0.05 по критерию Манна-Уитни и P>0,95 F-критерий) и небольшое увеличение диастазы (P<0.2 t-критерий). Это может быть связано с тем, что в случае приема препарата «Панаген» происходит физиологическая стимуляция белого ростка крови, которая характеризуется следующим: мягкое стабильное стимулирующее воздействие на белый росток крови, приводящее к активации пролиферативного потенциала. Стволовая клетка не работает на износ, а делится в пределах своей физиологической нормы. Это предполагает, что при использовании программной химиотерапии количество периферических клеток, которые резко подавляются в результате действия цитостатика, будет быстро и стабильно увеличиваться, не приводя к истощению популяции гемопоэтических стволовых клеток. Возможной особенностью стимуляции на здоровых добровольцах (у которых исходный уровень моноцитов был низким) является не только увеличение % CD34/45 от общего числа лейкоцитов, но и смещение формулы крови в сторону развития моноцитов, что было обнаружено на второй группе добровольцев. Моноциты являются предшественниками клеток формирующих клеточный иммунный ответ организма, как против инфекций, так и против неопластически трансформиро-
ванных клеток, что является дополнительным, важным параметром воздействия препарата «Панаген».
На группе из 15 человек не было обнаружено эффекта дозы, который был выявлен на 2 группе вследствие того, что исходная точка до приема препарата была выше, и наблюдался большой индивидуальный разброс вследствие маленькой выборки. 0днако, при нахождении параметров на границе минимального значения физиологической нормы, препарат приводит к их увеличению до верхней точки и даже больше. В случае последней группы исходные параметры находились в средней точке физиологической нормы, это говорит о том, что не происходит чрезмерной пролиферации ге-мопоэтических стволовых клеток, которая с неизбежностью приведет к истощению и спаду пролиферативной активности клеток. Этот спад может сказаться в 3 и 4 курсах программной химиотерапии.
Таким образом, препарат является не токсичным, безопасным, легко переносимым и, как показано в доклинических испытаниях, стимулирует лейкопоэз при искусственно вызванной лейкопении. У здоровых добровольцев во второй группе, у которых исходный уровень количества моноцитов был очень низким, на фоне приема препарата наблюдалось восстановление до верхних границ физиологической нормы и у некоторых добровольцев даже немного выше. Также происходило увеличение % СБ34+/СБ45+ клеток относительно общего числа лейкоцитов и абсолютного количества СБ34+/ СБ45+ клеток. Поэтому, можно предположить, что в случае угнетения функции кроветворения «Панаген» может оказывать мягкое физиологическое давление на пролиферативный потенциал стволовых клеток крови, не сбивая гомеостаз клетки в сторону взрывной пролиферации. И может приводить к увеличению количества моноцитов, которые являются предшественниками противоракового адаптивного иммунитета.
Полученные данные позволяют рекомендовать препарат «Панаген» к дальнейшему изучению, у больных получающих противоопухолевую химиотерапию.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок рыб — перспектива клинического применения. — Владивосток, 2002. — 38 с.
2. Бобров М.Я., Сосновская ИЮ., Умникова Н.И. Полидан в профилактике лейкопении при проведении химиотерапии у больных злокачественными новообразованиями // Мат. VII Рос. нац. конгресса «Человек и лекарство». — М., 2000. — С. 256.
3. Большая Российская энциклопедия лекарственных средств. — М.: Ремедиум, 2001. — С. 430
4. Бычков М.Б., Бодягин Д.А., Борисов В.И. и др. Полидан — новый стимулятор лейкопэза у онкологических больных // Клин. вестник. — 1997. — № 1. — С. 85-86.
5. Гамалей С.Г., Даниленко Е.Д., Батинева А.В. и др. Изучение особенностей фармакокинетики препарата Панаген в организме мышей // Сборник научных трудов сотрудников института медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». / Под ред. В.И. Масычева. — Бердск, 2006. — С. 289307.
6. Жаврид Э.А., Истомин Ю.П. Изучение противоопухолевых свойств комплекса адриамицин-Деринат в экспериментах. — Минск: Онкоцентр, 1994. — с.
7. Кириллова Е.Н., Либинзон Р.Е. Лечебное действие гетеро-логичной ДНК при фракционированном пролонгированном облучении // Радиобиология. —1973. — Т. 13. № 3. — С. 44-48.
8. Кудрявцев В.Д., Гуменюк Л.Н., Цыганков А.П. Влияние
гетерологичной ДНК на репаративные процессы в слизистой оболочке тонкого кишечника крыс и мышей при лучевом кишечном синдроме // Радиобиология. — 1978. — Т. 18. № 1. — С. 92-95.
9. Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние экзогенной геномной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана // Вопр. онкол.. — 2006. — Т. 52. № 3. — С. 336-340.
10. Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей // Вопр. онкол. — 2006. — Т. 52. № 1. — С. 66-69.
11. Рогачева С.А., Русинова Г.Г., Шарова Э.Г. Влияние ДНК на кроветворение нормальных животных // Цитология. — 1970. — Т. 12. № 7. — С. 912-918.
12. Соболева Э.П., Рогачева С.А. Применение ДНК при цитопении, вызванной миелосаном // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1976. — Т. 81. № 4. — C. 409-411.
13. Трещалина Е., Бычков М., Бодягин Д. Полидан — новый стимулятор кроветворения // Врач. — 1996. — № 2. — С. 26-27.
14. ТУ 9154-003-03533859-2004. «Нуклеопротеидный комплекс из плаценты для изготовления косметических композиций».
15. Yakubov L.A., Popova N.A., Nikolin V.P et.al. Extracellular genomic DNA protects mice against radiation and chemical mutagens // Genom Biol. — 2003. — Vol. 5. — P. 3-8.
Информация об авторах: 664035, г. Иркутск, ул. Фрунзе, 32, тел. (3952) 777323, e-mail: dvv@iood.ru, ponomarenkodm@gmail.com, keor@academ.org, labmolbiol@mail.ru, Дворниченко Виктория Владимировна — заведующий кафедрой ИГИУВа, д.м.н., профессор; Пономаренко Дмитрий Михайлович — ассистент, к.м.н.; Шевчук Анна Витальевна — врач-онколог; Юкальчук Денис Юрьевич — врач-онколог; Климова Ирина Дмитриевна — врач-онколог; Богачев Сергей Станиславович — заведующий лабораторией, д.б.н.; Орищенко Константин Евгеньевич — научный сотрудник, к.б.н.; Рогачев Владимир Алексеевич — младший научный сотрудник; Шурдов Михаил Аркадьевич — директор
