CC BY
72
УДК: 615.273:577.112.855:591.339]-092.9
изучение гемостимулирующей активности нуклеопротеидного комплекса, выделенного из плаценты человека
в.И. Масычева1, Е.д. даниленко1, г.г. Шимина1, т.С. гвоздева2,
Е.А. Алямкина2, Е.в. долгова2, А.С. проскурина2, К.Е. Орищенко2, в.А. рогачев2, С.С. Богачев2, С.в. Сидоров34, М.А. Шурдов5
Институт медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, г. Бердск1 ФГБУ «Институт цитологии и генетики» СО РАН, г .Новосибирск2 МУЗ «Городская клиническая больница № 1», г. Новосибирск3 Новосибирский государственный медицинский университет4 ООО «Панаген», г. Горно-Алтайск5 633190, Новосибирская обл., г. Бердск, ГУС, а/я 112
Проведено исследование гемостимулирующей активности субстанции препарата Панаген, представляющей собой нуклеопроте-идный комплекс, выделенный из плаценты человека, на модели цитостатической миелосупрессии у мышей, вызванной введением циклофосфана. Установлено, что препарат Панаген обладает гемостимулирующими свойствами, сравнимыми с активностью препарата Деринат, и по ряду показателей превосходит их.
Ключевые слова: нуклеопротеидный комплекс Панаген, миелосупрессия, циклофосфан.
STUDY OF HEMOSTIMULATING ACTIVITY OF NUCLEOPROTEIN COMPLEX EXTRACTED
FROM THE HUMAN PLACENTA V.I. Masycheva1, E.D. Danilenko1, G.G. Shimina1, T.S. Gvozdeva2, Е.А. Alyamkina2, E.V Dolgova2, A.S. Proskurina2,
К.Е. Orischenko2, V.A. Rogachev2, S.S. Bogachev2, S.V. Sidorov3,4, М.А. Shurdov5 State Scientific Centre of Virology and Biotechnology «Vector», Berdsk1 Research Institute of Cytology and Genetics, SB RAMS, Novosibirsk2 Municipal Clinical Hospital № 1, Novosibirsk3 Novosibirsk State Medical University4 Limited Liability Company «Panagen», Gorno-Altaisk5 Post box 112, Berdsk-633190, Novosibirsk region, Russia1
Hemostimulating activity of Panagen substance representing the nucleoprotein complex extracted from the human placenta was studied using the model of cyclophosphan-induced myelosuppression in mice. Panagen was found to have hemostimulating properties comparable with activity of Derinat drug.
Key words: nucleoprotein complex, Panagen, myelosuppression, cyclophosphan.
В настоящее время химиолучевая терапия является одним из ведущих методов лечения онкологических больных. Среди ее побочных эффектов одним из наиболее серьезных является депрессия кроветворения. Согласно рекомендации ВОЗ по оценке токсичности химиотерапии, снижение уровня лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови до пороговой границы (лейкоциты<3х109/л. гранулоциты<1,5х109/л, тромбоциты<75х109/л) является противопоказанием для дальнейшего проведения химиолучевой терапии. Очевидно, что от
переносимости больным химиолучевого воздействия и, в частности, от выраженности миелосупрессии зависит эффективность противоопухолевой терапии. Для ослабления супрессивного действия химиолу-чевой терапии на гемопоэз используются гемостимуляторы - препараты, обладающие способностью усиливать пролиферацию и дифференцировку клеток крови. К ним относятся вещества, имеющие разную структуру, источник происхождения и механизм действия, причем каждой группе присущи свои преимущества и недостатки. Такие препараты, как
пентоксил и метацил, ускоряют восстановление общего числа эритроцитов и лейкоцитов в крови при нарушениях кроветворения, вызванных химио- и радиотерапией, однако их использование ограничено лишь легкими формами лейкопений [5]. Стимулятор лейкопоэза лейкоген противопоказан при злокачественных заболеваниях органов кроветворения [5]. Высокоэффективные гемостимуляторы, такие как лейкомакс, нейпоген, граноцит, способны оказывать побочные эффекты на организм [3]. В связи с этим поиск веществ, отличающихся высокой гемостимулирующей активностью при отсутствии токсических свойств, является актуальным.
В течение многих лет интерес исследователей привлекают в качестве лекарственных средств препараты экзогенных ДНК. В 70-х годах прошлого века было установлено, что экзогенная ДНК способна проникать в клетку и активировать процессы репарации клеточных повреждений, индуцированных облучением. В эксперименте были показаны противоопухолевый, радиопротекторный, лейкостимулирующий, иммуномодулирующий эффекты воздействия чужеродной ДНК [8-13]. Результатом работ по исследованию гемостимулирующих. иммуномодулирующих и протекторных свойств нуклеиновых кислот в нашей стране являлось создание и испытание в клинике таких препаратов, как Деринат, Дезоксинат, Полидан. Действующим компонентом препарата Деринат является натриевая соль деполимеризованной дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной из молок осетровых рыб [5]. Молекулярная масса ДНК составляет 270-500 кДа, препарат содержит незначительное количество белка (менее 1 %). Деринат рекомендован для клинического использования в качестве регенерирующего, ранозаживляющего, иммуномодулирующего и ге-мопоэтического средства, в том числе при лечении онкологических заболеваний [3]. Благодаря иммуномодулирующему действию Деринат обладает противоопухолевым эффектом и может значительно ослаблять болевой синдром у больных с IV стадией заболевания, способствовать уменьшению размеров опухоли, лизису метастазов и продлению сроков жизни [1].
По своему составу и способу получения к Дерина-ту близок препарат Дезоксинат, представляющий собой натриевую соль частично деполимеризованной дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из молок осетровых рыб [5]. Но в отличие от Дерината,
Дезоксинат не влияет на опухолевый рост, а также на лечебный эффект цитостатиков или лучевой терапии. Препарат Полидан представляет собой смесь солей ДНК и РНК, получаемую из спермы осетровых рыб [2, 7]. Полидан активирует и усиливает гемопоэз, обладает способностью стимулировать колониеобра-зование в условиях миело- и иммунодепрессии, увеличивая индекс созревания нейтрофилов и повышая выход в циркуляцию лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов.
Приведенные примеры свидетельствуют о том, что лекарственные средства, основанные на ДНК, оказывают универсальный гемостимулирующий эффект, независимо от вида химиопрепарата цитостатика и/или лучевой терапии. К числу положительных свойств таких препаратов относятся их безвредность и способность оказывать противоопухолевое действие.Однако важно отметить, что разрешенные к клиническому применению препараты получены из гетерологичного для человека биологического материала. Интенсивность лейкостимулирующего эффекта ДНК, как известно, зависит от ее видовой принадлежности [14].
В связи с этим представлялось перспективным создание новых препаратов с гемостимулирующими свойствами на основе ДНК, выделенной из гомологичного биологического материала. Препарат Панаген (ЛСР № 004429/08 от 09.06.08) представляет собой фрагментированный нуклеопротеидный комплекс, выделенный из плаценты человека. Способ получения позволяет выделить полноценную геномную ДНК с сохранением тех ее фрагментов, которые прочно ассоциированы с белками ядерного матрикса. Размер фрагментированной ДНК колеблется от 200 до 6000 пар оснований. Лекарственной формой препарата являются таблетки, покрытые кислотоустойчивой оболочкой, массой 200 мг с содержанием основного вещества 5 мг. В настоящее время завершены доклинические испытания препарата Панаген, начата II фаза клинических испытаний.
Целью исследования являлось изучение специфической гемостимулирующей активности препарата Панаген в условиях in vivo, на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной циклофосфаном.
Материал и методы
В экспериментах использовали субстанцию препарата Панаген (далее - Панаген) с содержанием
фрагментированной ДНК 1,7 мг/мл. Препаратом сравнения являлся Деринат, как наиболее близкий к исследуемому препарату по природе активного вещества. Исследования проведены на мышах линии СВА, самцах массой 18-22 г, полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор». До эксперимента и в ходе исследования животные содержались в стандартных условиях вивария, при естественном освещении, на сбалансированном пищевом рационе. Все манипуляции с лабораторными животными проводились в соответствии с протоколом исследований и протоколом-заявкой, рассмотренной и утвержденной Биоэтической комиссией за содержанием и использованием лабораторных животных ГНЦ ВБ «Вектор».
Для моделирования миелосупрессии мышам однократно вводили циклофосфан (ЦФ) в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. За сутки до введения ЦФ, в день введения и в течение 4 сут после введения ежедневно, один раз в день, животные получали внутрибрюшинные инъекции препарата Панаген в дозах от 1 до 5 мг/кг в объеме 0,2 мл. Контрольным животным вводили по той же схеме физиологический раствор.
В первом эксперименте было сформировано 5 экспериментальных групп животных, по 10 особей в каждой. Мыши 1-й группы были интактными (отрицательный контроль). Вторую группу составляли животные, получавшие инъекции физиологического раствора по вышеописанной схеме на фоне введения ЦФ (положительный контроль). Животным 3, 4 и 5-й групп на фоне введения ЦФ вводили препарат Панаген в дозах 1; 2,5 и 5 мг/кг.
Во втором эксперименте животные были разделены на 4 группы, по 20 животных в каждой. Первая группа являлась интактной. Во 2-й группе были мыши, получавшие инъекции физраствора до и после введения ЦФ. Мышам 3-й группы вводили ЦФ и препарат Панаген в дозе 5 мг/кг. Животным
4-й группы вводили препарат Деринат в дозе 7,5 мг/кг внутримышечно по схеме, описанной в Инструкции по применению. Первую инъекцию Дерината проводили одновременно с введением ЦФ, последующие - ежедневно однократно, в течение 4 дней.
На 5-е и 6-е сут после введения ЦФ животных (п=10) выводили из эксперимента мгновенной дислокацией шейных позвонков, забирали на анализ образцы крови из ретро-орбитального синуса и
образцы костного мозга. Взятие образцов костного мозга из бедренной кости (для подсчета общего числа миелокариоцитов) проводили методом, описанным в работе [6]. В образцах крови определяли общее количество лейкоцитов, эритроцитов, ре-тикулоцитов, рассчитывали лейкограмму [4]. Для оценки костномозгового кроветворения в образцах костного мозга подсчитывали общее количество миелокариоцитов [6].
Статистическую обработку данных экспериментов проводили с применением методов вариационного статистического анализа, используемых в биологии и медицине, с помощью пакета статистических программ «Statgraphics, Vers. 5.0» (Statistical Graphics Corp., USA). В качестве критерия статистической значимости различий выборок, не подчиняющихся нормальному закону распределения, применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни для сопоставления двух независимых групп по количественному признаку. Уровень статистической значимости считали достоверным, если вероятность ошибки не превышала 0,01.
Результаты и обсуждение
В первой серии экспериментов оценивали гемостимулирующие свойства препарата Панаген в разных дозах с целью выявления эффективной дозы и дозовой зависимости эффекта препарата. Введение ЦФ в дозе 200 мг/кг вызывало глубокую депрессию кроветворения. Общее количество кариоцитов костного мозга у мышей контрольной группы на 5-е сут после введения ЦФ было снижено в 2,8 раза, число лейкоцитов крови - в 5,3 раза, число сегментоядерных нейтрофилов - в 9,7 раза. Введение препарата Панаген в дозе 5 мг/кг приводило к ускорению восстановительных процессов (рис. 1). На 5-е сут после введения ЦФ общее количество кариоцитов костного мозга повышалось в 2 раза, количество сегментоядерных нейтрофилов - в 6,2 раза по сравнению с контрольным показателем. Отмечена четко выраженная тенденция к повышению общего количества лейкоцитов крови. Восстановление клеточности костного мозга и числа сегментоядерных нейтрофилов под действием препарата в дозе 2,5 мг/кг происходило медленнее. Эффективность самой низкой из использованных доз препарата Панаген (1 мг/кг) была незначительна. Ни одна из использованных доз препарата Панаген не оказывала существенного влияния на
содержание в крови лимфоцитов, моноцитов, эо-зинофилов, показатели «красной» крови.
Таким образом, внутрибрюшинное введение препарата Панаген мышам СВА с депрессией кроветворения, вызванной введением ЦФ, ускоряло восстановление как общего числа клеток крови и костного мозга, так и их отдельных морфологических форм. Гемостимулирующее действие препарата проявлялось, преимущественно, в отношении гранулоцитарного ростка кроветворения. Наиболее интенсивный и стабильный эффект был обнаружен при использовании препарата Панаген в дозе 5 мг/кг.
Во второй серии эксперимента проводили изучение гемостимулирующих свойств препарата Па-наген в выбранной дозе в сравнении с препаратом Деринат. Изменения формулы крови и интенсивности костномозгового кроветворения при введении препаратов Панаген и Деринат по сравнению с контрольными животными были зафиксированы по следующим показателям: общее количество кариоцитов костного мозга, количество лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов (рис. 2).
Введение цитостатика ЦФ в дозе 200 мг/кг приводило к значительному снижению общего количества кариоцитов костного мозга до 43 % на
5-е сутки. При введении препаратов Панаген и Деринат на 5-е сут значимых отличий от контроля по числу кариоцитов не наблюдалось. На 6-е сут препарат Панаген приводил к увеличению количества кариоцитов на 24 % по сравнению с контролем, а препарат Деринат - на 13 %.
Общее число лейкоцитов в крови мышей, которым вводили ЦФ, на 5-е сут после введения было снижено в 7 раз. Инъекции препарата Панаген статистически значимо по сравнению с контролем ускоряли восстановление в крови общего числа лейкоцитов (на 5-е сут - на 13 %, на 6-е сут - на 23 %). Динамика изменения числа лейкоцитов в крови мышей, которым вводили Деринат, носила сходный характер, однако значимых различий с контрольным уровнем в этой группе мышей не отмечено.
В группе мышей, которым вводили Панаген, наблюдалось значимое увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов по сравнению с контрольным показателем. На 5-е сут после введения ЦФ количество сегментоядерных нейтрофилов было в 5,6 раза выше по сравнению с контролем. На
Рис. 1. Влияние препарата Панаген в разных дозах на показатели периферической крови и кроветворения мышей, подвергшихся воздействию ЦФ. Значения приведены на 5-е сут после введения цитостатика относительно значений интактных мышей, принятых за 100 %.
Примечание: * - различия статистически значимы (р<0,01, п=10, и-критерий Манна-Уитни) по сравнению с контрольной группой (ЦФ)
Рис. 2. Влияние препаратов Панаген и Деринат на показатели периферической крови и кроветворения мышей, подвергшихся воздействию ЦФ. Значения приведены относительно значений интактных мышей, принятых за 100 %: а - на 5-е сут после введения цитостатика; б - на 6-е сут после введения цитостатика. Примечание: * - различия статистически значимы (р<0,01, п=10, и-критерий Манна-Уитни) по сравнению с контрольной группой (ЦФ)
6-е сут этот показатель у опытных животных превышал интактный уровень в 2 раза, контрольный уровень - на 80 %. Количество сегментоядерных нейтрофилов в крови мышей, которым вводили Деринат, не значимо отличалось от контрольной группы.
Изменение числа незрелых палочкоядерных нейтрофилов в группах мышей, которым вводили Панаген и Деринат, по направленности и выраженности соответствовало изменениям, наблюдаемым в контрольной группе животных. Препараты не оказывали существенного влияния на динамику восстановления числа эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов крови. Анализ изменения числа эритроцитов и ретикулоцитов периферической крови показал, что ни субстанция препарата Панаген, ни препарат сравнения Деринат не оказывали заметного влияния на эритроидный росток кроветворения в ранние сроки после воздействия цитостатика. Сравнение гемостимулирующих свойств субстанции препарата Панаген и Дерината показало, что препараты обладали близким уровнем активности. Препарат Панаген не уступает Деринату по уровню фармакологической активности, являясь более удобной, по сравнению с Деринатом, лекарственной формой.
Полученные данные, на наш взгляд, позволяют рассматривать препарат Панаген как перспектив-
ное гемостимулирующее средство для лечения миелосупрессий, вызванных цитостатической терапией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок рыб - перспектива клинического применения. Владивосток, 2002. 38 с.
2. Бычков М.Б., Бодягин ДА., Борисов В.И. и др. Полидан - новый стимулятор лейкопоэза у онкологических больных // Клинический вестник. 1997. № 1. С. 85-86.
3. Жаврид ЭА., Истомин Ю.П. Изучение противоопухолевых свойств комплекса адриамицин-деринат в экспериментах. Минск: Онкоцентр, 1994.
4. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В Меньшикова. М.: Медицина, 1987. 368 с.
5. МашковскийМ.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей: в 2 т. М.: Медицина, 1995. 575 с.
6. Новицкий В.В., Евтушенко ОМ. Руководство к практическим занятиям по гематологии. Томск: SST, 1999. 160 с.
7. Трещалина Е., Бычков М., Бодягин Д. Натрия нуклеоспермат -новый стимулятор кроветворения // Врач. 1996. № 2. С. 26-27.
8. Anker P., Jachertz D., Stroun M. et al. The role of extracellular DNA in the transfer of information from T to B human lymphocytes in the course of an immune response // J. Immunogenet. 1980. Vol. 7 (6). P. 475-481.
9. Bhargava PM., Shanmugam G. Uptake of nonviral nucleic acids by mammalian cells // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1971. Vol. 11. P. 103-192.
10. Ledoux L. Uptake of DNA by living cells // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1965. Vol. 4. Р 231-267.
11. Leon SA., Shapiro B., Sklaroff DM., YarosMJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy // Cancer Res. 1977. Vol. 37 (3). P. 646-650.
12. Pulciani S., Santos E., Lauver A.V. et al. Oncogenes in solid human tumours // Nature. 1982. Vol. 300 (5892). P 539-542.
13. YakubovLA., PopovaN.A., Nikolin VP. et al. Extracellular genomic DNA protects mice against radiation and chemical mutagens // Genome Biol. 2003. Vol. 5. P. 3-8.
Поступила 5.03.12
