CC BY
56
■■■ ......
Оригинальные исследования
ш
Экспрессия рецепторов к Г-КСФ и IL8 на клетках крови в динамике терапии Г-КСФ*
Е.В. Райкина, С.А. Румянцев
Receptor expression to G-CSF and IL8 in blood cells while treating with G-CSF
E.V.Raikina, S.A. Rumyantsev
Многочисленными исследованиями показано, что рецептор к Г-КСФ имеется лишь у небольшого числа гемопоэтичес-ких стволовых клеток (ГСК) костного мозга и периферической крови [1, 2]. Его плотность на CD34+ клетках очень низкая, увеличивается по мере созревания гранулоцитов, достигая максимума у зрелых нейтрофилов и моноцитов. Так, известно, что количество рецепторов у нормальных нейтрофилов возрастает соответственно с их степенью зрелости с 500 до 3000 на клетку [3].
Действительно, наибольший эффект Г-КСФ отмечается при уровне нейтрофилов более 2000 клеток в 1 мкл крови и времени более 30 суток от окончания химиотерапии [в этот временной промежуток происходит репопуляция стволовой клетки) [4]. В таком случае остается неясным мобилизирую-щий эффект Г-КСФ в условиях индуцированной гипоплазии кроветворения после химиотерапии, когда абсолютное число гранулоцитов в периферической крови менее 500 в 1 мкл.
Таким образом, вопрос о непосредственном влиянии Г-КСФ на гемопоэтические стволовые клетки остается дискутабельным, в свете чего становится актуальным исследование, направленное на поиск факторов, способствующих мобилизующему действию Г-КСФ.
Материал и методы исследования
Материалом исследования служила периферическая кровь 45 детей с онкогематологическими заболеваниями, находившихся на лечении в ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава с 2000 по 2006 годы. Из них 26 пациентов получали препараты Г-КСФ с целью восстановления количества грану-лоцитов при медикаментозной цитопении, остальные 19 -с целью мобилизации CD34+ клеток в периферическую кровь для сбора и последующей аутологичной трансплантации. Кроме того, исследовали периферическую кровь и сыворотку 15 здоровых доноров ГСК, которые получали препараты Г-КСФ с целью мобилизации CD34+ клеток в периферическую кровь для дальнейшего отбора и последующей аллогенной трансплантации.
Протоколы клинического применения
препаратов Г-КСФ
В настоящем исследовании использовались препараты Г-КСФ - граноцит [леногастрим), нейпоген [филгастрим) и лейкостим (филгастрим) - в рамках трех протоколов клинического применения Г-КСФ:
1. Мобилизация CD34+ клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аллогенной трансплантации.
2. Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аутологичной трансплантации.
3. Лечение медикаментозной цитопении после курсов высокодозной цитотоксической полихимиотерапии у детей с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями.
Получение CD34+ клеток периферической крови
Периферические CD34+ клетки получали с помощью процедуры цитафереза на гемосепараторе «Baxter CS-3000 Plus». Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли на градиенте гравитации. Процедуры цитафереза после периода мобилизации проводили ежедневно до тех пор, пока суммарное количество CD34+ клеток не достигало уровня, обеспечивающего наиболее быстрое приживление трансплантата.
Минимально допустимым количеством CD34+ клеток для трансплантации считали их число более 2х106/кг массы тела реципиента. Оптимальным считали количество CD34+ клеток более 5х106/кг массы тела реципиента. Для достижения такого уровня требовалось различное число процедур цитафереза [от 1 до 4). Ежедневное введение препаратов Г-КСФ продолжали и в дни проведения сеансов цитафереза.
Определение количества субпопуляций лейкоцитов
и стволовых клеток, несущих рецептор
к IL8 и Г-КСФ
Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтичес-ких стволовых клеток, несущих рецепторы к Г-КСФ (CD114) и IL8 (CDw128), определяли по экспрессии мембранных маркеров [CD - clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD14, CD15, CD34, CD38, CD45, CD114, CDw128 «Becton Dickinson» (США) при помощи проточной цитомет-рии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson» (США).
Статистическая обработка
Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим
* Материал представлен на международный симпозиум «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантации», Москва, ЦИТО, 25-26 апреля 2007 г.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007
■.....
Оригинальные исследования
■тп
распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.
Результаты и обсуждение
Учитывая тот факт, что для реализации действия Г-КСФ на клетку необходимо наличие у нее рецепторов к Г-КСФ, можно предположить, что мобилизация CD34+ клеток в периферическую кровь связана с наличием у них рецептора к Г-КСФ. Мы изучили уровень экспрессии рецептора к Г-КСФ [CD114) на поверхности CD34+ клеток, гранулоцитов и моноцитов периферической крови. Количество CD34+ клеток, несущих рецептор к Г-КСФ, составило у здоровых доноров 3,6±1,1 % от CD34+ клеток, при медикаментозной цитопе-нии - 4,2±1,3 % и при мобилизации аутологичных CD34+ клеток - 3,9±1,1 % [табл. 1). Доля CD34+/114+ клеток из циркулирующих лейкоцитов показана в таблице 2. Количество гранулоцитов и моноцитов, несущих рецептор к Г-КСФ, показана в таблице 1, а доля CD15+/ CD114+ и CD14+/ CD114+ клеток продемонстрирована в таблице 2. При изучении динамики доли CD114+ клеток среди циркулирующих лейкоцитов при использовании препаратов Г-КСФ оказалось,
что доля CD34+//И4+ клеток после использования Г-КСФ статистически не значимо снижается, как и количество CD/I4+//I/I4+ клеток, тогда как количество гранулоцитов [CD15+/114+ клеток), несущих Г-КСФ рецептор в пуле циркулирующих лейкоцитов, в ответ на Г-КСФ статистически не значимо увеличивается [табл. 2).
Исследования последних лет, в основном на моделях с животными, показали, что Г-КСФ не оказывает прямого воздействия на гемопоэтические клетки-предшественники [5], а мобилизация ГСК является результатом действия «периферических» хемокинов, таких как интерлейкин 8 [^-8 или СХ^8), и ремоделирования матрикса и базальной мембраны энзимами матрикса, такими как желатиназа-В (ММР-9) [6]. Нами было изучено изменение количества рецепторов к ^-8 на стволовых клетках, гранулоцитах и моноцитах на фоне мобилизации Г-КСФ. Показано, что количество CD128b+CD34+ клеток минимально перед началом курса Г-КСФ и практически не определяется после его окончания (табл. 3). Количество гранулоцитов ^128Ь^15+ клеток) и моноцитов ^128Ь^14+ клеток), несущих Г-КСФ рецептор, в результате применения Г-КСФ не меняется (табл. 3).
Таблица 1. Доля Сй114+клеток среди Сй34+клеток, гранулоцитов и моноцитов периферической крови (%, M±m)
Доля CD114+KneTOK из числа Медикаментозная цитопения (n=10) Доноры аутологичных CD34+ клеток (n=5) Доноры аллогенных CD34+ клеток (n=5)
CD34+KneTOK 4,2±1,3 3,9±1,1 3,6±1,1
CD14+KneT0K 18,2±9,3 17,6±6,9 15,4±3,3
CD15+KneT0K 38,6±12,3 45,1±7,2 42,3±5,7
Таблица 2. Доля Сй114+клеток среди лейкоцитов периферической крови (%, M±m)
Параметр Медикаментозная цитопения (n=10) Доноры аутологичных CD34+ клеток (n=5) Доноры аллогенных CD34+ клеток (n=5)
до Г-КСФ после Г-КСФ до Г-КСФ после Г-КСФ до Г-КСФ после Г-КСФ
CD114+/34+ 0,07±0,03 0,01±0,01 0,08±0,06 0,02±0,02 0,038±0,02 0,02±0,02
CD114+/14+ 5,12±3,9 2,57±0,65 16,3±15,3 7,8±3,3 18,7±6,8 5,1±3,2
CD114+/15+ 15,2±5,4 22,9±8,7 5,5±0,8 15,4±7,4 34,2±8,7 47,2±13,4
Таблица 3. Изменение доли клеток, несущих рецептор к ^-8, среди различных дифференцированных элементов периферической крови в динамике использования Г-КСФ (%, М±т)
Параметр Медикаментозная цитопения (n=12) Доноры аутологичных CD34+ клеток (n=5) Доноры аллогенных CD34+ клеток (n=5)
до Г-КСФ после Г-КСФ до Г-КСФ после Г-КСФ до Г-КСФ после Г-КСФ
CD128b+/34+ 0,2±0,07 0,04±0,03 0,07±0,034 0,01±0,01 0,06±0,017 0,01±0,01
CD128b+/14+ 16±6,3 11,9±2,2 26,9±16,5 36,2±18,9 18,2±3,9 18,4±3,7
CD128b+/15+ 44,2±9,8 73,4±6,7 40,8±22,6 46,5±16,7 53,8±18,2 50,9±19,7
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007
■■■ ......
Оригинальные исследования
ш
Таким образом, показано, что количество CD34+ клеток, несущих рецепторы к Г-КСФ и ^8, минимально и в результате применения препаратов Г-КСФ не увеличивается. Количество клеток, несущих рецепторы к Г-КСФ и ^8, максимально на поверхности зрелых гранулоцитов и моноцитов, однако также не изменяется в результате приме-
нения препаратов Г-КСФ, что позволяет предположить отсутствие прямого влияния Г-КСФ и ^8 на CD34+ клетки, несмотря на то, что оба цитокина приводят к значительному повышению количества CD34+ клеток в периферической крови [7-9], наличие других механизмов мобилизации CD34+ клеток.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Shimoda K., Okamura S., Harada N. et al. High-frequency granuloid colony-forming ability of G-CSF receptor possessing CD 34 antigen positive human umbilical cord blood hematopoietic progenitors. Exp. Hematol. 1992; 23: 226-28.
2. Shinjo K., Takeshita A., Ohnishi K. et al. Granulocyte colony-stimulating factor receptor at a various differentiation stages of normal and leukemic hematopoietic cells. Leuk. Lymph. 1997; 25: 37-6.
3. Hamblin A.S. Cytokines and Cytokine Receptors. Oxford, New York: IRL; 1993.
4. Румянцев С.А. Влияние Г-КСФ на клеточный состав крови и костного мозга человека. Автореф. ...дисс. доктора мед. наук. Москва, 2002.
5. Liu F, Poursine-Laurent J, Link D.C. Expression of the G-CSF receptor on hematopoietic progenitor cells is not required for their mobilization by G-CSF. Blood 2000; 95: 3025-31.
6. Starckx S, Van den Steen PE, Wuyts A. et al. Neutrophil gelatinase B and chemokines in leukocytosis and stem cell mobilization. Leuk. Lymph. 2002; 43(2): 233-41.
7. Pruijt JF, Fibbe W.E, Opdenakker G. et al. Prevention of interleukin-8-induced mobilization of hematopoietic progenitor cells in rhesus monkeys by inhibitory antibodies against the Metalloproteinase gelatinase B (MMP-9). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96: 10863-68.
8. Imamura R., Miyamoto T., Yoshimoto G. et al. Mobilization of human lymphoid progenitors after treatment with granulocyte colony-stimulating factor. J. Immunol. 2005; 175: 2647-54.
9. Jilma B., Hergovich N., Homoncik M. et al. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) downregulates its receptor (CD 114) on neutrophils and induces gelatinase B release in humans. Br. J. Haematol. 2000; 111: 314-20.
В первом номере нашего журнала за 2007 год было опубликовано письмо Г.М. Михайлова [стр. 74-75). Вместо «поли-гликолиды» следует читать «полиглюколиды».
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007
