CC BY
60
УДК: 616.15:618.48
Ибрагимов Р.Ш.1, Райкина Е.В.1, Осипова Е.Ю.1,2, Майорова О.А.1, Яковлева М.В.2, Румянцев С.А.1
КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ ТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО
МАТЕРИАЛА ПуПОВИННОЙ И Г-КСф МОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРИфЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России Россия, 117997, г. Москва, Ленинский проспект, д. 117/2. E-mail: [email protected] 2Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы Россия, 115516, Москва, Бакинская ул., 31
Клеточный состав пуповиной крови является быстропроходящим следствием родового стресса и напоминает клеточный состав периферической крови взрослых, полученной вы результате мобилизации гранулоцитарнымколоние-стимулирующим фактором (Г-КСФ), реализующим свое биологическое действие путем ряда вторичных посредников, многие из которых являются также естественными эффекторами стрессового состояния. В настоящем исследовании продемонстрирована сравнительная характеристика клеточного состава, в том числе субпопуляций лимфоцитов, CD34+ и CD133+ клеток, колониеобразующей активности гемопоэтических клеток-предшественников, а также концентраций мобилизующих цитокинов (IL-8, MMP-2, MMP-9) в пуповинной крови доношенных новорожденных и периферической крови после мобилизации при помощи Г-КСФ.
Соотношение концентрации мобилизующих цитокинов в сочетании с количеством CD34+клеток в результате мобилизации и в ПК позволяет предположить, что хотя родовой стресс и позволяет объяснить многие тенденции в изменениях клеточного состава ПК в зависимости от ряда анте- и интранатальных факторов, но, вероятно, не является единственной причиной особенностей ПК.
Ключевые слова: пуповинная кровь, мобилизация, CD34+клетки, CD133+клетки, гранулоцитарный колониестиму-лирующий фактор.
Ibragimov R.Sh.1, Raikina E.V.1, Osipova E.Yu.1,2, Maiorova O.A.1, Yakovleva M.V.2,
Roumiantsev S.A.1
CELL COMPOSITION OF CORD BLOOD AND G-SCF-MOBILIZED BLOOD TRANSPLANTATIONAL
MATERIAL
1Federal Research Center of pediatric hematology, oncology and immunology 117/2 Leninskiyi pr., Moscow. 117997, Russia. E-mail: [email protected]
2Moscow stem cell bank 31 Bakinskaya st., Moscow, 115516, Russia
Cord blood cell composition is a short-lasting delivery stress consequence and is similar on adult G-CSF-mobilized peripheral blood. G-SCF realizes biological effect by number of secondary messengers, many of which are also natural effectors of stress. In this research comparative characteristics of cell composition, including lymphocytes subpopulations, CD34+ and CD133+ cells, hematopoietic progenitor cells colony-forming activity and mobilizing cytokines concentration (IL-8, MMP-2, MMP-9), between term newborns cord blood and G-SCF-mobilized peripheral blood is shown.
Mobilized cytokines concentration ratio in combination with CD34+ cells count in cord blood and mobilized peripheral blood suggests that delivery stress possibly is not single cause of cord blood features.
Keywords: Cord blood, mobilization, CD34+cells, CD133+cells, granulocyte colony stimulated factor (G-CSF).
Известно, что пуповинная кровь не может отождествляться с кровью новорожденного даже в первые часы жизни, поскольку особенности клеточного состава ПК являются быстропроходящими последствиями родового стресса, а сыворотка ПК обладает выраженной цитокиновой активностью [1]. Учитывая тот факт, что состав мобилизованной при помощи препаратов Г-КСФ крови в значительной степени отличается от физиологического состояния, что обусловлено действием множества вторичных посредников, многие из которых являются также естественными эффекторами стрессового состояния, представляется интересным сравнить клеточный состав ПК с кровью доноров после применения препаратов Г-КСФ.
Ранее было показано, что экспрессия рецептора к Г-КСФ (СБ114), через который реализуется эффект Г-КСФ на клетку, на поверхности СБ34+клеток очень невелика и составляет 4-5%. [2-5]. Такой уровень экспрессии рецептора к Г-КСФ дает основания предполагать, что Г-КСФ не оказывает непосредственного влияния на СБ34+клетки, а действие его опосредовано другими клетками, несущими на поверхностиСБ114. Гранулоциты и в меньшей степени моноциты имеют большое количество рецептора к Г-КСФ и, вероятно, являются основными мишенями для реализации биологического действия Г-КСФ в организме. Динамика количества клеток в результате использования Г-КСФ демонстрирует нарастание доли СБ15+СБ114+ клеток и уменьшение доли СБ14+СБ114+клеток за счет более интенсивного роста гранулоцитов в ответ на Г-КСФ во всех исследованных группах [2,3].
Известно, что повышение количества СБ34+клеток в периферической крови может быть результатом действия других цитокинов [7-14]. В последнее время появились данные о мобилизации СБ34+клеток под действием ин-терлейкина 8 (1Ь-8). Так, в исследовании РгшДОБ е1 а1. [11] на макаках Резус показано, что 1Ь-8 стимулирует быстрое нарастание уровня фермента матрикс-металлопротеи-назы-9 параллельно со значительным повышением количества СБ34+клеток в периферической крови. В свою очередь, в исследовании ^^апаЬе Т е1 а1. показано, что при мобилизации СБ34+клеток при помощи Г-КСФ в сыворотке крови происходит 20-кратное повышение уровня 1Ь-8, при отсутствии изменений в концентрации других исследованных цитокинов (М1Р-1а, ТЫБ-а, ¡БЫ-у) [15].
Эти данные позволяют высказать предположение, что в ответ на связывание Г-КСФ с рецептором, зрелые грану-лоциты индуцируют секрецию 1Ь-8, который, в свою очередь, вызывает повышение уровня в крови ММР-9, разрушающей молекулы адгезии, фиксирующие СБ34+клетки к строме костного мозга, и приводящей, таким образом, к выходу СБ34+клеток в периферическую кровь.
Таким образом, Г-КСФ, вероятно, не оказывает прямого воздействия на гемопоэтические стволовые клетки, реализуя свой эффект мобилизации СБ34+клеток через клетки-мишени, имеющие рецепторы к Г-КСФ, которыми являются нейтрофильные гранулоциты и, возможно, моноциты [9-11,16]. Эти клетки, в свою очередь, получив сигнал от Г-КСФ, инициируют выработку вторичных посредников, которыми могут быть другие цитокины (1Ь-8, 1Ь-3, ОМ-С8Б, 8ББ-1) или ферменты (коллагеназы), которые разрушают связь СБ34+клеток со стромальны-ми элементами костного мозга и усиливают миграцию СБ34+клеток в периферическую кровь [2,11].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследования служили:
Пуповинная кровь 1013 доношенных новорожденных, родившихся на 37-41 неделе гестации (медиана составила 40 недель) в ЦПСиР ДЗ г. Москвы (гл. врач - д.м.н., проф. Курцер М.А.) и Родильном доме №10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы (гл. врач - Оземковская Е.П.) за период с 2005 по 2008 год.
Концентрат ПК (n=1013), полученный при помощи седиментации эритроцитов раствором гидроксиэтилкрах-мала (HES) в ГУЗ «Банк стволовых клеток» ДЗ г. Москвы за период с 2005 по 2008 год.
Материал мобилизации СБ34+клеток крови и кровь 23 здоровых доноров ГСК, которые получали препараты Г-КСФ с целью мобилизации СБ34+клеток в периферическую кровь для сбора и последующей аллогенной трансплантации в ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава за период с 2000 по 2008 год.
Получение пуповинной крови.
Пуповинную кровь получали при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных (3741 недель гестации (медиана - 40 недель)) с учетом информированного согласия матери и отсутствия стандартных противопоказаний. После пережатия и пересечения пуповины, производили пункцию сосудов пуповины специальной системой для забора ПК, содержащей 35,5 мл антикоагулянта CPDA. Сбор крови осуществляли в течение 2-15 минут после родов (менее 5 минут - 849 случаев (84,4%), от 5 до 10 минут - 90 случаев (8,7%) и более 10 минут - 69 (6,9%)), до отделения плаценты (n=998 (98,5%)). В случае сбора крови после отделения плаценты (n=15 (1,5%)), плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 18 часов после процедуры сбора ПК.
Процедура получения концентрата клеток пуповинной крови.
Выделение клеточного концентрата, содержащего стволовые клетки, проводилось в асептических условиях, в «чистом» помещении класса D ГУЗ Банк стволовых клеток ДЗМ за период 2005-2008 годы двумя методами: методом двойного центрифугирования и аппаратным методом с помощью аппарата «SepaxS100», Biosafe, Switzerland (539 и 554 образца, соответственно).
Исходный рабочий протокол метода двойного центрифугирования был разработан Нью-Йоркским банком пуповинной крови (P. Rubinstein et al. 1995) Международные стандарты сбора, обработки, тестирования, хранения и отбора пуповинной крови при использовании роботизированного криокомплекса «BioArchive®», ThermoGenesis, USA утверждены FDAUSA, NetCord и FAHCT. Плазмоэк-стракция проводилась при помощи автоматическогоплаз-моэкстрактора "AutoVolumeExpressor", ThermoGenesis, USA. Введение криопротектора - Диметилсульфоксида (DMSO) - осуществлялось с помощью шприцевого насоса TE-331, TerumoTerufusion, Belgium
Метод автоматического выделения с использованием аппарата "SepaxS100", Biosafe, Switzerland и криокомплекса "BioArchive®", ThermoGenesis. Аппарат для сепарации клеток управляется компьютерной программой, в основу
которой заложен принцип спектрометрического анализа фракций крови, а также принцип двойного центрифугирования. Во время первого кровь разделяется на три фракции - клеточная плазма, 1-я порция лейкоцитарного концентрата и эритроциты; во время второго происходит разделение на бесклеточную плазму, 2-ю порцию лейкоцитарного концентрата и остаточные эритроциты. Для обработки пуповинной крови этим методом использовались комплекты для автоматической обработки пуповинной крови "SepaxCS-530", Biosafe, Switzerland. DMSO вводилось при помощи аппарата для перемешивания и охлаждения концентрата пуповинной крови "CoolmixAS-210", Biosafe, Switzerland.
Все обработанные образцы были подвергнуты кри-оконсервации в роботизированномкриокомплексе "BioArchive®", ThermoGenesis, USA. Непосредственно перед криоконсервацией, в каждый образец добавлялся криопротектор DMSO в смеси с декстраном-40 в количестве 20% от объема конечного продукта для предотвращения разрушения клеток концентрата пуповинной крови под воздействием сверхнизких температур. Затем концентрат помещался в металлическую канистру и погружался в программном замораживателе криокомплек-са в пары азота для предварительного охлаждения и его предзаморозки по заданному температурному профилю до -50°С. Процесс начинается с охлаждения до -1°С. Затем следует этап предзаморозки со скоростью 10°С/мин до температуры -11°С. Конечным этапом является постзаморозка со скоростью 2°С/мин до температуры -50°С. Данный профиль, полученный экспериментальным путем фирмой-производителем ThermoGenesis, USA совместно с Нью-Йоркским банком пуповинной крови, контролируется программно. Затем канистра с образцом автоматически погружается криокомплексом в жидкий азот с температурой -196°С в заранее автоматически выбранную пустую ячейку для бессрочного хранения. Каждая ячейка имеет свой индивидуальный адрес хранения.
Определение клеточного состава пуповинной крови.
Подсчет клеток крови производился двумя методами:
1) все 1013 образцов пуповинной крови были подвергнуты анализу автоматическим счетчиком клеток крови ABXPentra 60 C+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов по объему, двумерную диаграмму, отражающую плотность популяции лейкоцитов и ее состав, а так же дифферен-цировку лейкоцитов по 5-ти параметрам - лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, выявление атипичных лимфоцитов (ALY), больших незрелых клеток (LIC) и нормобластов (NRBC);
2) для точной морфологической характеристики клеток пуповинной крови использовали мазки пуповинной крови, окрашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского). Дифференциальный подсчет лейкоцитов (лейкоцитарная формула) проводился при использовании иммерсионных объективов (х40 и х100). При подсчете лейкоцитарной формулы анализировали не менее 200 клеток;
Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100лейкоцитов).
Определение количества субпопуляций лейкоцитов и стволовых клеток
Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэ-тических стволовых клеток определяли по экспрессии мембранных маркеров (CD - clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональ-ными антителами CD3, CD4, CD8, CD13, CD14, CD16, CD 19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD61, CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR «BectonDickinson», США при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «BectonDickinson», США.
Определение колониеобразующей активности
Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции пуповинной крови определяли двумя методами:
1. культивирование в течение 14 суток в метил-целлюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.
• Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1 х 105эксплантированных клеток
• Для определения абсолютного количества гемопоэти-ческих предшественников в 1 мл пуповинной крови, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.
2. Культивирование в полутвердой среде в системе «агаровая капля - жидкая среда» в течение 7 суток с расчетом следующих показателей:
• колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность - число колоний (малые - 2040 клеток, средние- 41-100 клеток и большие - более 100 клеток) и кластеров (малые - 5-9 клеток, большие -10-19 клеток) на 1 х 105эксплантированных клеток.
• эффективность клонирования (ЭК) - общее число колоний и кластеров на 1 х 105эксплантированных клеток
• для определения абсолютного количества гемопоэти-ческих предшественников в 1 мл крови или костного мозга, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови и на число миелокариоцитов в 1 мл костного мозга.
• пролиферативный потенциал (ПП) - отношение числа колоний к кластерам в культуре.
Определение уровня спонтанного апоптоза и некроза клеток
Определяли уровень некроза и спонтанного апопто-за лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов пуповинной крови. Исследование проводили при помощи проточной цитофлюориметрии двумя методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidiumiodid (PI) и определение числа локусов связывания мембранного фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexin V FITC («PharMingen»), согласно инструкциям производителей.
Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметреFACScan («BectonDickinson", США). Обработку полученных данных производили при помо-
щи программы WinMDI 2.8 forWindows. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоци-товклеток пуповинной крови определяли как сумму PI+/ Annexin V+ и PI-/Annexin V+ клеток, а уровень некроза, как количество PI+/Annexin V- клеток.
Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь.
Для мобилизации CD34+клеток у здоровых доноров препараты Г-КСФ вводились в дозе 5-10 мкг/кг/сут в течение 5 дней. На пятый день от начала стимуляции проводили первый сеанс цитафереза.
Получение CD 34+ клеток периферической крови.
Периферические CD34+ клетки получали с помощью процедуры цитафереза на гемосепараторе «BaxterCS-3000 Р1ш».Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли на градиенте гравитации. Сепарации всегда подвергали постоянный объем периферической крови (7000 мл), поэтому в зависимости от массы тела, за один сеанс через гемосепаратор проходило более одного объема циркулирующей крови донора. Объем циркулирующей крови (ОЦК) донора определяли по таблицам в зависимости от массы тела и возраста.
Иммуноферментный анализ.
Для количественного определения концентрации G-CSF, IL-8, MMP-9, MMP-2, TIMP-1, TIMP-2 в сыворотке крови проводилась реакция ИФА «сэндвич» типа.
Принцип реакции следующий: антигены исследуемых сывороток реагируют с иммобилизованными на твердой фазе антителами. После удаления избытка смеси в реакцию вводятся меченные ферментом антитела, которые связываются уже иммобилизованным антигеном. В данном случае ферментативная активность находится в прямо пропорциональной зависимости с количеством антигена в исследуемой сыворотке.
В качестве ферментных меток использовали перок-сидазу. При действии фермента на хромоген образуется окрашенный продукт, о содержании которого можно судить по оптической плотности фотометрируемого раствора.
В настоящем исследовании использовали следующие наборы реагентов: «HumanMMP-9 (total)», «Human/ mouseMMP-2(tota1)», «HumanTIMP-2» («Quan-tikine®» R&DSystemsInc., USA), «HumanTIMP-1» (Biosour-ceInternationalInc., USA), «HumanIL-8 ELISAKitII» (BDOptEIA™ BDBiosciencesPharmingen, USA). К каждому набору прилагалась собственная инструкция для выполнения эксперимента.
Статистическая обработка.
Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонфер-рони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Клеточный состав пуповинной и Г-КСФ-мобили-зованнной периферической крови
Сравнение клеточного состава ПК и крови доноров показало, что Г-КСФ мобилизованная периферическая кровь содержит статистически значимо большее количество лейкоцитов за счет статистически значимого большего количества нейтрофилов (табл. 1), в то время как количество эозинофилов и базофилов не различается, а количество лимфоцитов, напротив больше в ПК.
Таблица 1
Клеточный состав Г-КСФ мобилизованной крови и ПК (х107л)
Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ р
n=1013 n=23
Лейкоциты 17,24±0,16 32,8±2,2 <0,0001
Нейтрофилы 8,41±0,1 27,6±2,0 <0,0001
Лимфоциты 5,54±0,06 2,9±0,4 <0,0001
Моноциты 2,42±0,03 2,2±0,4 0,28
Эозинофилы 0,64±0,01 1,2±0,21 <0,0001
Базофилы 0,23±0,01 0,17±0,04 0,37
Мобилизованная при помощи Г-КСФ периферическая кровь содержит больше СБ3+лимфоцитов и меньше СБ16+СБ56+ (ЫК) клеток (табл. 2).
Таблица 2
Содержание субпопуляций лимфоцитов в Г-КСФ мобилизованной и ПК
Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ р
n=62 n=15
Доля (%) от лимфоцитов
CD3+ 56,03±1,67 67,8±3,04 0,002
CD3+CD4+ 39,44±1,4 48,76±2,76 0,004
CD3+CD8+ 15,65±0,81 19,27±2,07 0,065
CD19+ 14,61±0,62 17,87±3,33 0,115
CD16+CD56+ 13,85±1,83 8,62±0,96 0,169
Абсолютное количество (х106/л)
CD3+ 2,07±0,15 2,94±0,08 0,002
CD19+ 0,55±0,06 0,56±0,05 0,928
CD3+CD4+ 1,44±0,1 1,89±0,07 0,016
CD3+CD8+ 0,68±0,07 0,78±0,08 0,453
CD16+CD56+ 0,76±0,11 0,36±0,05 0,048
Если рассматривать ПК с точки зрения идентичного механизма мобилизации при помощи того же набора ци-токинов, концентрация которых в ПК повышается в ответ на родовой стресс, то, вероятно, такая картина может натолкнуть на мысль, что терапевтическая концентрация Г-КСФ в периферической крови выше, чем в пуповинной и, соответственно, выше уровень остальных цитокинов, участвующих в процессе мобилизации. Тем не менее, количество СБ34+клеток в Г-КСФ мобилизованной крови
статистически значимо ниже, чем в ПК (табл. 3), за счет всех исследованных субпопуляций (табл. 4), что дает возможность предположить, что аналог мобилизации в процессе родового стресса является не единственной причиной повышенного количества СБ34+клеток в ПК. Это предположение отчасти подтверждается тем, что эффективность клонирования Г-КСФ мобилизованной периферической крови также ниже, чем в ПК, а ГСК, в основном, представлены гранулоцитарно-макрофагальными предшественниками (табл. 5).
Таблица 3
Количество CD34+клеток в Г-КСФ мобилизованной крови и ПК
Параметры СБ34 (%) СБ34 (в мм3)
Количество СБ34+клеток в ПК доношенных новорожденных
Количество наблюдений 618 618
Среднее значение 0,827 ± 0,023 100 ± 3
Количество СБ34+клеток в Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых доноров
Количество наблюдений 23 23
Среднее значение 0,24 ± 0,09 44 ± 10
Р р<0,0001 р<0,0001
Таблица 4
Количество субпопуляцийCD34+ и CD133+клеток Г-КСФ мобилизованной крови и ПК
Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ р
п=47 п=15
Доля (%) от лимфоцитов
СБ34+СБ133+ 0,46±0,05 0,09±0,036 <0,0001
СБ34+СБ133- 0,31±0,02 0,12±0,031 <0,0001
СБ34+СБ38- 0,77±0,09 0,19±0,042 <0,0001
СБ34+СБ71 + 0,96±0,1 0,22±0,065 <0,0001
СБ34+СБ62Ь+ 0,59±0,06 0,15±0,045 <0,0001
СБ34+СБ44+ 0,82±0,07 0,26±0,068 <0,0001
СБ34+СБ117+ 0,49±0,05 0,16±0,026 <0,0001
СБ34+СБ61 + 0,45±0,058 0,16±0,53 0,356
СБ34+СБ38+ 0,77±0,086 0,31±0,086 0,006
СБ133+СБ106+ 0,48±0,07 0,1±0,042 0,004
СБ133+СБ31 + 0,88±0,11 0,7±0,24 0,45
Абсолютное количество /мкл
СБ34+СБ133+ 59±7 3±0,9 <0,0001
СБ34+СБ61 + 58±8 5±1,1 <0,0001
СБ34+СБ38+ 103±16 9±1 0,002
СБ34+СБ71 + 131±20 6±0,9 <0,0001
СБ133+СБ106+ 58±8 3±0,9 <0,0001
СБ133+СБ31 + 116±17 20±2 0,002
Таблица 5
Эффективность клонирования Г-КСФ мобилизованной крови и ПК
Перифе-
ПК рическая
Параметр кровь после Г-КСФ р
п=226 п=15
ЭК (105эксплантированныхмононуклеарных клеток)
Суммарное количество 116,8±4,47 19,2±3,6 <0,0001
КОЕ-ГЕММ 41,95±2,2 1,3±0,6 <0,0001
КОЕ-ГМ 23,22±1,38 7,1±1,2 0,003
КОЕ-Г 20,44±1,04 4,6±0,6 <0,0001
КОЕ-М 15,93±1,14 3,8±0,6 0,007
КОЕ-Э 15,28±1,26 2,0±0,5 0,007
Количество клеток-предшественников в 1 мл
Суммарное количество 5490,2±419,3 478,6±112 0,002
КОЕ-ГЕММ 1789±121,9 38±6 <0,0001
КОЕ-ГМ 1144±117,1 181±24 0,036
КОЕ-Г 988,8±101,9 114±21 0,028
КОЕ-М 875,7±136 94±18 0,141
КОЕ-Э 692,8±76,4 46±11 0,03
Соотношение клеток-предшественников
КОЕ-ГЕММ 35,33±1,35 7,9±1,2 <0,0001
КОЕ-ГМ 19,28±0,75 37,8±4,7 <0,0001
КОЕ-Г 18,72±0,77 24,5±3,8 0,067
КОЕ-М 13,69±0,87 20,2±3,7 0,065
КОЕ-Э 12,99±0,88 10,6±2,9 0,495
Уровень спонтанного апоптоза клеток Г-КСФ мобилизованной крови и ПК статистически значимо не различался, имея, однако, тенденцию к значительному снижению в Г-КСФ мобилизованной крови (табл. 6). Этот факт может быть связан с тем, что ПК перед началом тестирования проходила определенные технологические этапы сбора и транспортировки в БСК, тогда как периферическую кровь у доноров тестировали сразу после сбора, а Г-КСФ, известный как мощный антиапоптотический фактор [17-19], приводит к выбросу в циркуляцию наиболее жизнеспособных клеток. При этом уровень спонтанного апоптоза СБ34+клеток, подавляющая часть которых (96,6±1,2 %) находится в 00 фазе клеточного цикла, был наиболее низким и не различался (табл. 6).
Таблица 6
Уровень спонтанного апоптоза клеток Г-КСФ мобилизованной крови и ПК
Перифе-
ПК рическая
Параметр кровь после Г-КСФ р
п=440 п=15
Апоптоз лейкоцитов (%) 9,18±1,19 3,4±0,6 0,387
Лимфоцитов 4,32±0,7 3,6±0,15 0,855
Моноцитов 15,35±2,02 3,8±0,72 0,309
Гранулоцитов 28,22±2,51 2,51±0,67 0,069
СБ34+ клеток 2,12±0,09 2,74±0,56 0,229
При сравнении уровня Г-КСФ в периферической крови и в ПК оказалось, что в ПК уровень Г-КСФ составляет 14,8± 2,2 пг/мл (п=45), что не превышает нормальный уровень сывороточного Г-КСФ в периферической крови. При клиническом использовании препаратов Г-КСФ в дозе 5-10 мкг/ кг в сутки в течение 5 суток, уровень сывороточного Г-КСФ
в крови у доноров возрастает приблизительно в 1000 раз. Таким образом, уровень Г-КСФ в сыворотке ПК доношенных новорожденных не отличается от нормального уровня Г-КСФ в сыворотке здоровых доноров, что в сочетании с данными, свидетельствующими об увеличении количества лейкоцитов и СБ34+клеток в ПК при наличии ряда осложнений беременности и родов, а также физиологических состояний при нормальном течении родов, удлиняющих родовой стресс, позволяет предположить изменение уровня других цитокинов и ферментов, участвующих в Г-КСФ индуцированной мобилизации лейкоцитов и СБ34+клеток. При изучении уровня 1Ь-8 в сыворотке ПК и Г-КСФ мобилизованной периферической крови было показано, что статистически значимое повышение концентрации 1Ь-8 после применения Г-КСФ было отмечено на всех клинических моделях, независимо от степени угнетения кроветворения. При этом, концентрация 1Ь 8 в сыворотке ПК была статистически значимо выше, чем у здоровых доноров до применения Г-КСФ, но меньше, чем после его отмены (табл. 7).
Таблица 7
Концентрация ^-8 в сыворотке ПК и крови до и после применения Г-КСФ
*- р - сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.
Концентрация ММР-9 в сыворотке крови также статистически значимо повышается в результате использования Г-КСФ во всех исследованных клинических моделях, в то время как концентрация ММР-9 в сыворотке ПК не отличалась от таковой в крови здоровых доноров до начала использования Г-КСФ (табл. 8).
Таблица 8.
Концентрация ММР-9 в сыворотке ПК и крови до и после применения Г-КСФ
*- р - сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.
Такое соотношение концентрации мобилизующих цитокинов в сочетании с количеством СБ34+клеток в результате мобилизации и в ПК позволяет предположить, что хотя родовой стресс и позволяет объяснить многие тенденции в изменениях клеточного состава ПК в зависимости от ряда анте- и интранатальных факторов, но, вероятно, не является единственной причиной особенностей ПК.
Клеточный состав трансплантационного материала после процедур процессинга
В результате использования технологий, предложенных стандартом NetCord/FACT, получен трансплантационный материал, содержащий ГСК ПК. Учитывая возможность потери и перераспределения количество различных клеток в результате процессинга, концентрат ПК, готовый к криоконсервации был подробно исследовании для определения количества и жизнеспособности ГСК. Результаты были сравнены с показателями трансплантационного материала, полученного при помощи стандартной сепарации (BaxterCS3000 Plus) периферической крови после проведения курса Г-КСФ у здоровых доноров. Показано, что количество лейкоцитов в продукте цитафереза значительно выше, чем в концентрате ПК (табл. 9), причем представлены они, в основном, лимфоцитами, в отличие от концентрата ПК, половину лейкоцитарного пула которого составляют гранулоциты.
Таблица 9
Клеточный состав трансплантационного материала
(х106/мл)
Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза р
n = 1013 n = 15
Лейкоциты х106/мл 39,0±0,48 188,4±16,3 <0,0001
Нейтрофилы х106/мл 18,3±0,27 25,8±2,91 <0,0001
Лимфоциты х106/мл 13,1±0,19 119,3±11,74 <0,0001
Моноциты х106/мл 5,2±0,08 37,5±4,1 <0,0001
Эозинофилы х106/мл 1,1±0,02 2,86±0,53 <0,0001
Базофилы х106/мл 0,2±0,02 1,12±0,17 <0,0001
Продукт цитафереза содержит значительно большее количество всех субпопуляций лимфоцитов (табл. 10).
Таблица 10
Субпопуляции лимфоцитов в трансплантационном материале
Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза р
n = 62 n = 15
Доля (%) от лимфоцитов
CD3+ 53,91±1,62 70,0±3,08 <0,0001
CD3+CD4+ 38,15±1,4 46,2±2,91 0,014
CD3+CD8+ 14,37±0,8 22,1±2,64 <0,0001
CD19+ 16,04±0,69 16,3±2,52 0,889
CD16+CD56+ 15,16±1,57 12,61±1,74 0,444
Абсолютное количество ( х106/мл)
CD3+ 8,29±0,63 82,8±6,24 <0,0001
CD19+ 2,39±0,27 19,4±2,71 <0,0001
CD3+CD4+ 5,72±0,5 56,6±4,63 <0,0001
CD3+CD8+ 2,26±0,23 27,4±3,01 <0,0001
CD16+CD56+ 3,68±0,01 14,6±2,39 <0,0001
Исследуемые группы N Концентрация IL 8 в сыворотке р
до Г-КСФ после Г-КСФ
Здоровые доноры 6 6,07 ± 0,39 47,0 ± 6,18 0,022
Мобилизация ГСК у детей с онкогематологи-ческими заболеваниями 10 108,15 ± 44,72 569,0 ± 159,0 0,013
Лечение медикаментозной цитопении 21 485,0 ± 158,0 1113,0 ± 250,0 0,040
Пуповинная кровь 45 19,83 ± 4,93 0,039*
Исследуемые группы N Концентрация MMP-9 в сыворотке р
до Г-КСФ после Г-КСФ
Здоровые доноры 6 225,4 ± 33,6 3333,8 ± 608,2 < 0,0001
Мобилизация ГСК у детей с онкоге-матологическими заболеваниями 5 175,0 ± 79,7 819,4 ± 254,7 0,043
Лечение медикаментозной цитопении 10 24,2 ± 7,7 826,5 ± 180,3 < 0,0001
Пуповинная кровь 45 182,4± 23,7 0.521*
Доля СБ34+клеток была статистически значимо выше в продукте цитафереза, тогда как доля СБ133+клеток статистически значимо выше в концентрате ПК. Однако, абсолютное количество ГСК статистически значимо выше в продукте цитафереза Г-КСФ мобилизованной периферической крови (табл. 11).
Таблица 11
Субпопуляции ГСК в трансплантационном материале
Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза р
п = 47 п = 15
Доля (%) от лимфоцитов
СБ34+ (*) 1,37±0,029 1,13±0,25 0,44
СБ34+СБ133+ 0,44±0,05 0,08±0,029 <0,0001
СБ34+СБ133- 0,56±0,16 0,72±0,029 0,577
СБ34+СБ38- 0,74±0,08 0,86±0,09 0,43
СБ34+СБ71+ 0,79±0,09 1,02±0,09 0,176
СБ34+СБ62Ь+ 0,61±0,06 0,87±0,08 0,028
СБ34+СБ44+ 0,9±0,08 1,14±0,017 0,165
СБ34+СБ117+ 0,46±0,04 0,1±0,03 <0,0001
СБ34+СБ61+ 0,42±0,05 0,72±0,16 0,02
СБ34+СБ38+ 0,74±0,074 1,1±0,12 0,018
СБ133+СБ106+ 0,46±0,06 0,21±0,08 0,035
СБ133+СБ31+ 0,8±0,08 0,84±0,22 0,832
Абсолютное количество /мкл
СБ34+ (*) 810±43 1256±126 0,23
СБ34+СБ133+ 196±24 95±28 0,03
СБ34+СБ61+ 198±35 857±112 <0,0001
СБ34+СБ38+ 353±56 1309±217 <0,0001
СБ34+СБ71+ 383±71 1124±198 <0,0001
СБ133+СБ106+ 193±26 250±44 0,28
СБ133+СБ31+ 367±46 1001±206 <0,0001
* - для расчетов общего количества СБ34+клеток в концентрате ПК п = 1095
При этом эффективность клонирования выше в концентрате ПК, но абсолютное количество клеток предшественников всех линий гемопоэза, в том числе КОЕ-ГЕММ и КОЕ-Э, значительно выше в продукте цитафереза, тем не менее, основное количество клеток-предшественников в нем представлено гранулоцитарно-макрофагальными предшественниками, в отличие от концентрата ПК, где преобладают наиболее ранние предшественники гемопо-эза (КОЕ-ГЕММ) (табл. 12).Уровень спонтанного апоп-тоза остается также ниже в продукте цитафереза Г-КСФ мобилизованной периферической крови в отличие от концентрата ПК, повторяя картину ПК и периферической крови до проведения соответствующих процедур процес-синга (табл. 13).
Таблица 12
Эффективность клонирования трансплантационного материала
Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза р
п = 178 п = 15
ЭК (105 эксплантированных мононуклеарных клеток)
Суммарное количество 104,7±8,3 87,63±12,34 0,555
КОЕ-ГЕММ 35,24±0,6 16,4±3,1 <0,0001
КОЕ-ГМ 22,22±0,82 26,31±3,17 0,17
КОЕ-Г 17,78±0,87 21,2±2,64 0,271
КОЕ-М 12,92±0,78 16,3±2,19 0,223
КОЕ-Э 16,53±0,33 9,2±1,6 <0,0001
Продолжение табл. 12
Количество клеток-предшественников в 1 мл.
Суммарное количество 21997±1259 94680±8826 <0,0001
КОЕ-ГЕММ 7158±426 14198±2361 <0,0001
КОЕ-ГМ 4382±228 24356±3117 <0,0001
КОЕ-Г 3626±296 19768±2726 <0,0001
КОЕ-М 2607±244 17126±2644 <0,0001
КОЕ-Э 3406±212 12232±1421 <0,0001
Соотношение клеток-предшественников.
КОЕ-ГЕММ 33,65±1,72 18,34±1,93 0,011
КОЕ-ГМ 21,22±0,81 29,4±1,12 0,004
КОЕ-Г 16,98±0,83 23,71±1,17 0,021
КОЕ-М 12,34±0,76 18,23±0,93 0,027
КОЕ-Э 15,78±0,84 10,29±0,86 0,061
Таблица 13
Уровень спонтанного апоптоза клеток трансплантационного материала
Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза р
Апоптоз лейкоцитов (%) 11,26±1,37 3,8±0,56 0,054
Лимфоцитов 4,42±0,77 3,4±0,58 0,639
Моноцитов 15,06±2,67 4,2±0,81 0,149
Гранулоцитов 29,17±2,96 2,7±0,78 0,002
СБ34+ клеток 2,27±0,12 2,61±0,23 0,327
При сравнении уровня Г-КСФ в периферической крови и в ПК оказалось, что в ПК уровень Г-КСФ составляет 14,8± 2,2 пг/мл (п=45), что не превышает нормальный уровень сывороточного Г-КСФ в периферической крови. При клиническом использовании препаратов Г-КСФ в дозе 5-10 мкг/ кг в сутки в течение 5 суток, уровень сывороточного Г-КСФ в крови у доноров возрастает приблизительно в 1000 раз. Таким образом, уровень Г-КСФ в сыворотке ПК доношенных новорожденных не отличается от нормального уровня Г-КСФ в сыворотке здоровых доноров, что в сочетании с данными, свидетельствующими об увеличении количества лейкоцитов и СБ34+клеток в ПК при наличии ряда осложнений беременности и родов, а также физиологических состояний при нормальном течении родов, удлиняющих родовой стресс, позволяет предположить изменение уровня других цитокинов и ферментов, участвующих в Г-КСФ индуцированной мобилизации лейкоцитов и СБ34+клеток. При изучении уровня 1Ь-8 в сыворотке ПК и Г-КСФ мобилизованной периферической крови было показано, что статистически значимое повышение концентрации 1Ь-8 после применения Г-КСФ было отмечено на всех клинических моделях, независимо от степени угнетения кроветворения. При этом, концентрация 1Ь 8 в сыворотке ПК была статистически значимо выше, чем у здоровых доноров до применения Г-КСФ, но меньше, чем после его отмены (табл. 14).
Таблица 14
Концентрация ^-8 в сыворотке ПК и крови до и после применения Г-КСФ
Исследуемые группы N Концентрация1Ь 8 в сыворотке р
До Г-КСФ После Г-КСФ
Здоровые доноры 6 6,07 ± 0,39 47,0 ± 6,18 0,022
Мобилизация ГСК у детей с онкоге-матологическими заболеваниями 10 108,15 ± 44,72 569,0 ± 159,0 0,013
Лечение медикаментозной цитопении 21 485,0 ± 158,0 1113,0 ± 250,0 0,040
Пуповинная кровь 45 19,83 ± 4,93 0,039*
*- р - сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.
Концентрация ММР-9 в сыворотке крови также статистически значимо повышается в результате использования Г-КСФ во всех исследованных клинических моделях, в то время как концентрация ММР-9 в сыворотке ПК не отличалась от таковой в крови здоровых доноров до начала использования Г-КСФ (табл. 15).
Таблица 15
Концентрация ММР-9 в сыворотке ПК и крови до и после применения Г-КСФ
*- р - сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.
Таким образом, в настоящем исследовании мы показали, что сывороточные концентрации 1Ь-8 и ММР-9 значительно повышаются в результате использования Г-КСФ, причем степень этого повышения обратно пропорциональна их первоначальной концентрации. Концентрация другой матрикс-металлопротеиназы - ММР-2, также предполагающейся на роль посредника в реализации мобилизующего действия Г-КСФ, в результате его использования не меняется. Не меняется и концентрация в сыворотке естественных ингибиторов ММР-9 и ММР-2 -Т1МР-1 и Т1МР-11. То есть, из наших данных следует, что эффективность мобилизации, как гранулоцитов, так и ГСК зависит от степени повышения сывороточной концентрации 1Ь-8 и ММР-9.
При исследовании спонтанного апоптоза клеток крови перед началом введения Г-КСФ оказалось, что его уро-
вень у детей при развитии медикаментозной цитопении достоверно выше, чем у пациентов при мобилизации аутологичныхСБ34+клеток.
Г-КСФ известен как мощный антиапоптотический фактор. В настоящем исследовании было изучено влияние Г-КСФ на уровень спонтанного апоптоза клеток крови и костного мозга. Основанием для этого является предположение о том, что потеря стволовыми клетками связи со стромальным микроокружением при выходе в циркуляцию приводит к снижению их жизнеспособности и увеличению склонности к спонтанному апопто-зу. С другой стороны, возможно, увеличение количества СБ34+клеток и гранулоцитов периферической крови в ответ на Г-КСФ связано с блокированием в них программы апоптоза и, как следствие, повышением продолжительности их жизни.
Было установлено, что применение Г-КСФ привело к снижению уровня спонтанного апоптоза клеток крови и костного мозга, в том числе, гранулоцитов и СБ34+клеток.
Такое изменение уровня спонтанного апоптоза может быть связано как с прямым антиапоптотическим действием Г-КСФ на клетки крови и костного мозга, так и с выходом в циркуляцию большого количества клеток с меньшим уровнем апоптоза за счет мобилизующего эффекта Г-КСФ.
Итак, результаты работы демонстрируют некоторые аспекты механизма действия Г-КСФ на систему кроветворения, подтверждающиеся при всех основных вариантах клинического использования Г-КСФ: при выполнении мобилизации СБ34+клеток у здоровых доноров и у пациентов в ремиссии онкогематологических заболеваний, а также при коррекции цитостатически угнетенного кроветворения. Основная роль в процессе реализации биологического действия Г-КСФ принадлежит зрелым гранулоцитам и моноцитам, имеющим рецепторы к Г-КСФ, а влияние на ГСК осуществляется путем процесса мобилизации, основными участниками которого являются провоспалительный ци-токин 1Ь-8 и матрикс-металлопротеиназа-9, финальным процессом является, по-видимому, деструкция связи ГСК со стромальными элементами костного мозга и миграция ГСК в периферический кровоток.
Исследуемые группы N Концентрация MMP-9 в сыворотке р
До Г-КСФ После Г-КСФ
Здоровые доноры 6 225,4 ± 33,6 3333,8 ± 608,2 < 0,0001
Мобилизация ГСК у детей с онкоге-матологическими заболеваниями 5 175,0 ± 79,7 819,4 ± 254,7 0,043
Лечение медикаментозной цито-пении 10 24,2 ± 7,7 826,5 ± 180,3 < 0,0001
Пуповинная кровь 45 182,4± 23,7 0.521*
ЛИТЕРАТУРА
1. Bailie KE, Irvine AE, Bridges JM, McClure BG. Granulocyte and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors in cord and maternal serum at delivery //PediatrRes. - 1994 Feb. - №35(2). -P.164-8.
2. Райкина Е.В., Румянцев С.А. Механизм мобилизующего действия гранулоцитарногоколониестимулирующего фактора на клетки крови у детей //Вопросы практической педиатрии. - 2007. - №3. - С.23-29.
3. Райкина Е.В., Румянцев С.А. Экспрессия рецепторов к Г-КСФ и IL8 на клетках крови в динамике терапии Г-КСФ // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. -№2. - С.61-63.
4. Shimoda K, Okamura S, Harada N. et al. High-frequency granu-loid colony-forming ability of G-CSF receptor possessing CD 34 antigen positive human umbilical cord blood hematopoietic progenitors //Exp Hematology. - 1992. - №23. - P.226-228.
5. Shinjo K, Takeshita A, Ohnishi K. et al. Granulocyte colony-stimulating factor receptor at a various differentiation stages of normal and leukemic hematopoietic cells //Leuk Lymphoma. -1997. - №25. - P.37-46.
6. Райкина Е.В., Румянцев С.А. Концентрация IL-8 и матрикс-металлопротеиназ в сыворотке крови в динамике
терапии Г-КСФ //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. - №2. - С.43-45.
7. Chakrabarti S., Patel KD. Regulation of matrix metalloprotein-ase-9 release from IL-8-stimulated human neutrophils //Journal of Leukocyte Biology. - 2005. - №78. - P.279-288.
8. Domanovic D., Wozniak G., Cernelc P. et al. Matrix metallopro-teinase-9 and cell kinetics during the collection of peripheral blood stem cells by leukapheresis //Transfusion and Apheresis Science. - 2005. - №33. - P.37-45.
9. Imamura R., Miyamoto T., Yoshimoto G. et al. Mobilization of human lymphoid progenitors after treatment with granulocyte colony-stimulating factor //J Immunol. - 2005. - №175. - P.2647-2654.
10. Jilma B., Hergovich N., Homoncik M. et al. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) downregulates its receptor (CD 114) on neutrophils and induces gelatinase B release in humans //Br J Haematol. - 2000. - №111. - P.314-320.
11. Pruijt JF, Fibbe WE, Opdenakker G. et al. Prevention of interleu-kin-8-induced mobilization of hematopoietic progenitor cells in rhesus monkeys by inhibitory antibodies against the Metallopro-teinase gelatinase B (MMP-9) //ProcNatlAcadSci USA. - 1999. -№96. - P.10863-10868.
12. Robinson SN, Pisarev VM, Chavez JM. et al. Use of matrix me-talloproteinase-9 (MMP-9) knockout mice demonstrates that MMP-9 activity is not absolutely required for G-CSF or FLT-3 ligand-induced hematopoietic progenitor cell mobilization or en-graftment //Stem Cells. - 2003. - №21. - P.417-427.
13. Robinson SN, Seina SM, Gohr JC. et al. Hematopoietic progenitor cell mobilization by granulocyte colony-stimulating factor and erythropoietin in the absence of matrix metalloproteinase-9 //Stem Cells and Development. - 2005. - №14. - P.317-328.
14. Thomas DB, Yoffey JM. Human fetal haemopoiesis. I. The cellular composition of fetal blood //Br.J.Haemat. - 1962. - №8. - P.290-295.
15. Watanabe T., Kawano Y., Kanamaru S. et al. Endogenous interleu-kin-8 (IL-8) surge in granulocyte colony-stimulating factor-induced peripheral blood stem cell mobilization //Blood. - 1999. -№93(4). - P.1157-1163.
16. Roberts AW, Metcalf D. Noncycling state of peripheral blood progenitor cells mobilized by granulocyte colony-stimulating factor and other cytokines //Blood. - 1995. - №86. - P.1600.
17. Philpott NJ., Prue RL., Marsh JC. et al. G-CSF-mobilized CD34 peripheral blood stem cells are significantly less apoptotic then unstimulated peripheral blood CD34 cells: role of G-CSF as survival factor //Br J Haematol. - 1997. - №97(1). - P.146-152.
18. Maianski NA, Mul FP, van Buul JD, Roos D, Kuijpers TW. Granu-locyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils //Blood. - 2002 Jan 15. - №99(2). - P.672-9.
19. Maianski NA, Roos D, Kuijpers TW. Bid truncation, bid/bax targeting to the mitochondria, and caspase activation associated with neutrophil apoptosis are inhibited by granulocyte colony-stimulating factor //J Immunol. - 2004 Jun 1. - №172(11). -P.7024-30.
ПОСТУПИЛА: 18.10.2010
