CC BY
69
© Румянцев А.Г., Румянцев СА., 2012
А.Г. Румянцев1'2 ,С.А. Румянцев1'2
ПУПОВИННАЯ КРОВЬ, КАК ИСТОЧНИК ИНФОРМАЦИИ О СОСТОЯНИИ ПЛОДА
1ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздравсоцразвития России, 2ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, Москва
Пуповинная кровь (ПК) является уникальной средой, отражающей колебания параметров в системе «мать-плод». Исследования последних лет показали, что плацента, пуповина и циркулирующая кровь плода содержат большое количество клеток-предшественников, ростовых факторов и цитокинов, определяющих развитие плода в пренатальный и ранний постнатальный период. Физиологические и патологические состояния течения беременности оказывают влияние на клеточный состав ПК доношенных новорожденных [1-3]. Нормальные роды через естественные родовые пути воздействуют на все жизненные системы организма ребенка, обусловливая функциональную их перестройку и подготовку к внеутробно-му существованию. По целому ряду показателей ПК человека, полученная сразу после рождения ребенка и пережатия пуповины, отличается от показателей крови плода [3, 4]. Это в равной степени относится и к гемопоэтической системе. Продолжительность родового стресса может определять количественные и качественные изменения в составе периферической крови новорожденного, исключение родового стресса (оперативное родо-разрешение путем кесарева сечения) приводит к
лабильности показателей периферической крови новорожденных, удлинению сроков их нормализации в неонатальном периоде. В результате воздействия родового стресса система крови отвечает выраженными и в достаточной мере определенными реакциями. Они проявляются в увеличении количества клеток красного ростка и гемоглобина. Помимо увеличения количества эритроид-ных клеток, происходит, хотя и кратковременное, изменение их состава - появление незрелых форм. Обследование детей в первые часы их жизни показало, насколько быстры во времени (в первые часы первых суток) и выражены изменения в системе крови. В исследовании F.T. Lim al. показано влияние длительности родового стресса на количество ядросодержащих клеток, уровень грану-лоцитов и повышение клеток-гемопоэтических предшественников ПК [4].
Из различных воздействий на плод особое внимание заслуживает кислородная недостаточность. Наличие экстрагенитальных и гинекологических заболеваний у женщин, их обострение во время беременности и родов могут существенно влиять на состояние и развитие плода. Как правило, в основе всех патологических состояний плода при ослож-
Контактная информация:
Румянцев Александр Григорьевич - д.м.н., проф., акад. РАМН, директор ФГБУ
«Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и
иммунологии» Минздравсоцразвития России
Адрес: 117997 г. Москва, Ленинский проспект, 117
Тел.: (495) 287-65-70, E-mail: [email protected]
Статья поступила 24.01.12, принята к печати 25.01.12.
*Общее количество наблюдений больше числа рожениц за счет наличия нескольких состояний одновременно.
Таблица 1
Особенности течения беременности (количество наблюдений)
Состояние Кол-во I половина беременности II половина беременности I и II половина беременности
Полностью здоровы 449
Анемия 41 10 28 3
Инфекционные заболевания 205 72 121 12
Угроза прерывания беременности 260 176 41 43
Патология почек у матери 47
Хроническая внутриутробная гипоксия 112
Ожирение у матери 19
Общее количество наблюдений 1133*
Таблица 2
Распределение новорожденных детей по полу и способу родоразрешения
Количество пациентов Мальчики Девочки Всего
Кесарево сечение 26 17 43
Самопроизвольные роды 498 463 961
Итого 524 480 1004
ненном течении беременности (гестозы, сахарный диабет, сердечная недостаточность, иммунологическая несовместимость, инфицирование плода, перенашивание беременности и др.) лежат изменения в плаценте и фетоплацентарная недостаточность, которые в свою очередь ведут к нарушению газообмена плода и его гипоксии [5-9].
Появившиеся в последнее время сообщения о различии клеточного состава ПК в зависимости от способа родоразрешения, а также от пола и массы тела новорожденного [10-12] демонстрируют, что остаются неясными множество факторов, влияющих на клеточный состав ПК.
Целью настоящего исследования служило изучение влияния различных состояний острой и хронической гипоксии плода на количество и жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток ПК доношенных новорожденных.
ПК получали при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных, родившихся в ГУЗ Центр планирования семьи и репродукции человека ДЗ г. Москвы (главный врач - член-корр. РАМН, проф. М.А. Курцер) на 37-41-й неделе гестации (медиана -40 недель) с учетом информированного согласия матери и отсутствия стандартных противопоказаний. После пережатия и пересечения пуповины проводили пункцию сосудов пуповины специальной системой для забора ПК, содержащей 35,5 мл антикоагулянта CPDA
(Green Cross, Южная Корея). Сбор крови осуществляли в течение 2-15 мин после родов (менее 5 мин - 847 случаев (84,4%), от 5 до 10 мин - 89 случаев (8,7%) и более 10 мин - 68 (6,9%)), до отделения плаценты (n=993 (98,5%)). В случае сбора крови после отделения плаценты (n=15 (1,5%)) плаценту помещали в специальную стерильную стойку и проводили аналогичную процедуру сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 18 ч после процедуры сбора ПК.
Течение беременности проанализировано у 1004 рожениц (табл. 1).
Из 1004 новорожденных 585 родились в результате первых родов, 340 - вторых, 63 - третьих и 16 - четвертых и более (12 - 4-е роды, 2 - 5-е и 2 - 6-е). Процент мальчиков и девочек среди групп, составленных по паритету, не отличался. В каждой из групп девочек и мальчиков было приблизительно поровну. Медиана длительности безводного промежутка составила 5 ч (от 20 мин до 19 ч 20 мин). Медиана длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) составила 30 мин (от 10 мин до 1 ч 35 мин).
Из 1004 новорожденных мальчиков и девочек было 524 (52,2%) и 480 (47,8%) соответственно. Все новорожденные были разделены на группы согласно способу родоразрешения: самопроизвольные роды и роды путем кесарева сечения (табл. 2).
Таблица 3
Клеточный состав ПК наблюдаемых новорожденных детей (n=1004)
WBC, NEU, NEU, LYM, LYM,
•109/л % •109/л % •109/л
17,24±0,16 48,48±0,25 8,41±0,1 32,45±0,22 5,54±0,06
MON, MON, EOS, EOS, BAS,
% •109/л % •109/л %
14,02±0,11 2,42±0,03 3,83±0,06 0,64±0,01 1,22±0,02
BAS, RBC, HGB, HCT, MCV,
•109/л •1012/л г/л % фл
0,23±0,01 4,4±0,01 157,4±0,46 32,29±0,14 105,81±0,12
MCH, MCHC, RDW, PLT, MPV,
пг г/л % •109/л фл
35,82±0,04 338,6±0,24 12,71±0,02 307,54±1,97 7,18±0,02
Данные представлены в виде M±m; WBC - общие число лейкоцитов, NEU - ней-трофилы, LYM - лимфоциты, MON - моноциты, EOS - эозинофилы, BAS - базо-филы, RBC - эритроциты, HGB - гемоглобин, HCT - гематокрит, MCV - средний объем эритроцита, MCH - среднее содержание гемоглобина в эритроците, MCHC - средняя концентрация гемоглобина в эритроците, RDW - показатель гетерогенности эритроцитов, PLT - тромбоциты, MPV - средний объем тромбоцита.
Подсчет клеток крови проводили двумя методами:
• все 1004 образца ПК были подвергнуты анализу автоматическим счетчиком клеток крови ABX Pentra 60 C+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров;
• для точной морфологической характеристики клеток ПК использовали мазки ПК, окрашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского).
Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100 лейкоцитов).
Колониеобразующую активность (КОЕ) лейкоцитарной фракции ПК определяли при помощи культивирования в течение 14 сут в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, Stem Cell Tehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-mix, КОЕ-ГМ (гранулоцитарно-макрофагальные), КОЕ-Г (гранулоцитарные), КОЕ-М (макрофагальные), КОЕ-Э (эритроидные).
Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1-105 эксплантированных клеток.
Для определения абсолютного количества гемопоэ-тических предшественников в 1 мл ПК полученные величины ЭК умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.
Исследование степени некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов ПК проводили при помощи проточной цитофлюоримет-рии двумя методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidiumiodid (PI) и определение числа локусов связывания мембранного фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием
Annexin V FITC («Pharmingen») согласно инструкциям производителей.
Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре FACS Calibur («Becton Dickinson», США). Степень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гра-нулоцитов и лимфоцитов ПК определяли как сумму PI+/Annexin V+ и PI-/Annexin V+ клеток, а уровень некроза - как количество PI+/Annexin V- клеток.
Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэ-тических стволовых клеток определяли по экспрессии мембранных маркеров (CD - clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с монокло-нальными антителами CD3, CD4, CD8, CD13, CD14, CD16, CD19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD61, CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR («Becton Dickinson», США) при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur («Becton Dickinson», США).
Для количественного определения концентрации гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), интерлейкина 8 (IL8), матриксных метал-лопротеиназ - MMP-9, MMP-2, тканевых ингибиторов металлопротеиназ - TIMP-1, TIMP-2 в сыворотке крови проводили реакцию ИФА «сэндвич»-типа. В качестве ферментных меток использовали пероксида-зу. В настоящем исследовании использовали следующие наборы реагентов: «Human MMP-9 (total)», «Human/ mouse MMP-2 (total)», «Human TIMP-2» («Quantikine®» R&D Systems Inc., USA), «Human TIMP-1» (Biosource International Inc., USA), «Human IL-8 ELISAKitII» (BDOptEIA™ BD Biosciences Pharmingen, USA).
Статистическую обработку данных проводили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариаци-
Таблица 4
Количество CD34+ клеток в ПК доношенных новорожденных
Параметры CD34, % CD34, 103/мм3
Количество наблюдений 618 618
Среднее значение 0,827 1,1
Медиана 0,7 0,078
Стандартное отклонение 0,562 0,079
Стандартная ошибка среднего 0,023 0,003
Минимальное значение 0,12 0,009
Максимальное значение 4,52 0,714
Таблица 5
Взаимосвязь количества лимфоцитов и КОЕ ПК
Параметры Количество лимфоцитов
r р
КОЕ-ГЕММ 0,399 0,0001
КОЕ-ГМ 0,4993 0,0001
КОЕ-Г 0,4467 0,0001
КОЕ-М 0,4995 0,0001
КОЕ-Э 0,2068 0,0018
Суммарное количество КОЕ 0,5634 0,0001
онных рядов с непараметрическим распределением - с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.
Учитывая тот факт, что состав клеток ПК в определенной степени является отражением процессов, протекающих во время беременности и родов, в настоящем исследовании предпринята попытка охарактеризовать состав ПК у доношенных новорожденных при различных состояниях и особенностях течения беременности и родов, которые могут влиять на адаптацию плода к процессу родов. В нашем исследовании результаты исследования морфологического состава ПК при помощи автоматического гематологического анализатора полностью совпадали с многочисленными литературными данными (табл. 3).
Основными отличиями ПК от крови взрослого являются большее содержание лейкоцитов, наличие нормобластов и большая осмотическая резистентность эритроцитов [12-16]. Количественное содержание нормобластов в ПК, определенное нами при помощи световой микроскопии, оказалось 5,62±0,33/100 лейкоцитов (n=339).
Количество CD34+ клеток (мобилизованные стволовые клетки) в ПК определяли с помощью проточной цитометрии и оценивали как два параметра: процент от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество CD34+ клеток в 1 мл ПК (табл. 4).
Степень спонтанного апоптоза и пролифера-тивный потенциал - это противоположные процессы, поддерживающие стабильность клеточного состава, и, как следствие, нормальное функционирование любой биологической системы. Следовательно, эти процессы, при адекватной способности организма реагировать на внешние и внутренние раздражители, предположительно, должны быть однонаправленными: чтобы обеспечить компенсацию повышения гибели клеток биологическая система должна усилить процессы деления и созревания клеток; напротив, при повышенной пролиферации клеток необходимо обеспечить их адекватное «умирание», чтобы клеточная масса не вышла из-под контроля [3]. В настоящем исследовании было показано, что во всей исследованной группе образцов ПК (п=1004) степень некроза лейкоцитов ПК составила 3,49±0,28%, при этом степень некроза лимфоцитов была ниже значений всех лейкоцитов (2,99±0,34%) и статистически значимо отличалась от степени некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшей 5,59±0,72 и 6,12±0,65% соответственно (р<0,0001) (рис. 1). Степень спонтанного апоптоза лейкоцитов составила 9,18±1,19%, при этом степень спонтанного апоптоза лимфоцитов была также ниже значений в общей группе (4,32±0,7%) и также статистически значимо отличалась от степени спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, составившей 15,35±2,02 и 28,22±2,51% соответственно (р<0,0001) (рис. 1), и не отличалась от показателей периферической крови здоровых доноров.
Такое соотношение показателей позволяет предположить большую жизнеспособность лим-
Таблица 6
Количество лейкоцитов в ПК в зависимости от пола новорожденного
Пол •109/л Лейкоцитарная формула, %
ЫЕи LYM МОЫ ЕОБ ВАБ
Мальчики п 524 524 524 524 524 524
М±т 17,74±0,24 49,97±0,35 31,57±0,31 13,75±0,15 3,48±0,07 1,26±0,03
Девочки п 480 480 480 480 480 480
М±т 16,80±0,23 47,10±0,34 33,23±0,30 14,29±0,17 4,16±0,09 1,18±0,03
р 0,005 <0,001 <0,001 <0,018 <0,001 <0,06
Пол WBC, •109/л Лейкоцитарная формула, -109/л
ЫЕи LYM МОЫ ЕОБ ВАБ
Мальчики п 524 524 524 524 524 524
М±т 17,74±0,24 8,93±0,14 5,53±0,09 2,44±0,04 0,60±0,01 0,24±0,01
Девочки п 480 480 480 480 480 480
М±т 16,80±0,23 7,94±0,12 5,54±0,09 2,40±0,05 0,68±0,02 0,22±0,01
р 0,005 <0,001 0,938 0,537 <0,001 0,158
фоцитов, что представляется позитивным результатом, учитывая тот факт, что популяция гемо-поэтических стволовых клеток находится в пуле лимфоцитов. Это предположение подтверждается положительной корреляционной взаимосвязью количества лимфоцитов и КОЕ ПК (табл. 5).
В работе обнаружены различия клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела новорожденного, совпадающие с данными литературы [10, 17]. Результаты исследования количества клеток и их основных параметров при помощи автоматического гематологического анализатора проанализированы в ПК 1004 доношенных новорожденных. При анализе половых различий отмечено, что у мальчиков уровень лейкоцитов выше (17,74±0,24 • 109/л; М±т), чем у девочек (16,8±0,23-109/л; р=0,005), преимущественно за счет нейтрофилов, которых у мальчиков больше, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов - меньше (табл. 6).
Количество эритроцитов (4,33±0,02 • 1012/л) и содержание гемоглобина (155,1±0,7 г/л) у девочек меньше, чем у мальчиков (4,46±0,02-1012/л; 159,5±0,6 г/л; р<0,0001). Гематокрит у девочек (31,79±0,2%) также меньше, чем у мальчиков
Рис. 1. Степень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК.
1-й столбик - лимфоциты, 2-й столбик - моноциты, 3-й столбик - гранулоциты.
(32,76±0,19%; р=0). Различий в эритроцитарных индексах (средний объем эритроцита - МСУ, среднее содержание гемоглобина в эритроците - МСН, средняя концентрация гемоглобина в эритроците
- МСНС, показатель гетерогенности эритроцитов
- RDW) в зависимости от пола новорожденного не обнаружено. Количество тромбоцитов у девочек (314,87±2,98-109/л) больше, чем у мальчиков (з00,72±2,62-109/л; р<0,0001). Средний размер тромбоцитов не имеет различий. Из 611 новорожденных, для которых были получены данные относительно количества CD34+ клеток в ПК, мальчиков было 314 (51,39%), девочек - 297 (48,61%). При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков CD34+ клеток больше в процентном (0,88±0,03 - мальчики; 0,77±0,03
- девочки; р=0,01) и в абсолютном количестве (0,106±0,005 - мальчики; 0,095±0,005 - девочки; р=0,002).
При анализе данных КОЕ ПК выявлено, что у мальчиков статистически значимо больше количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК (745,71±65,11 - девочки; 1216,7±185,45 - мальчики; р=0,022) и имеется тенденция к увеличению (статистически незначимо) количества КОЕ-М (691,64±78,6 - девочки; 1052,1±252,09 - мальчики; р=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 - девочки; 6070,8±691 - мальчики; р=0,16) в 1 мл образца ПК. При анализе эффективности клонирования (на 105 ММС) у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 - девочки; 22,42±1,6 - мальчики; р=0,058). В процентном соотношении имеется тенденция к увеличению количества КОЕ-ГЕММ (р=0,11) у девочек и уменьшению у них КОЕ-ГМ (р=0,13) и КОЕ-Э (р=0,14).
Можно предположить, что выявленные различия клеточного состава ПК в зависимости от пола новорожденного связаны с тем, что новорожденные мальчики крупнее новорожденных девочек. Действительно, средняя масса тела (МТ)
при рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25 г; диапазон 2270-5000 г), чем у девочек (3467,23±18,17 г; диапазон 2300-4650 г) (р<0,0001). При разделении на группы по МТ при рождении мальчиков было больше в группе с МТ>4000 г (р=0,001), а девочек - в группе 2500-3000 г (р=0,008). Однако, при исследовании групп сходных по МТ при рождении и различия в параметрах крови между мальчиками и девочками сохранялись. Таким образом, различия в клеточном составе ПК в зависимости от пола не могут быть объяснены различной МТ мальчиков и девочек при рождении.
Различия клеточного состава ПК и крови новорожденного первых суток, у которого отмечается снижение количества многих клеточных элементов, позволяет предположить, что повышенное содержание многих клеточных элементов в ПК может быть следствием мобилизации, сходной с мобилизацией периферической крови взрослых, вызванной адаптацией к процессу родов, а различия количества клеток ПК в зависимости от пола новорожденного - различной способностью девочек и мальчиков адаптироваться к процессу родов. Исходя из этого предположения, могут быть оценены многие особенности течения беременности и родов как причины усиления или ослабления родового стресса. Известно, что прохождение плода по естественным родовым путям является более сильным стрессовым фактором по сравнению с оперативными родами путем кесарева сечения. При сравнении показателей ПК в зависимости от способа родоразрешения показано, что при оперативных родах путем кесарева сечения наблюдается меньшее количество лейкоцитов (14,29±0,57-109/л против 17,38±0,17-109/л; р<0,0001) за счет меньшего количества нейтро-филов (р<0,0001), лимфоцитов (р=0,02), моноцитов (р=0,003) и эозинофилов (р=0,002). Также при оперативных родах отмечается меньшее количество эритроцитов (4,3±0,05 • 1012/л против 4,4±0,01 • 1012/л; р=0,04) и тромбоцитов (284,88±9,55-109/л против 308,59±2,01 • 109/л; р=0,015). Средний объем тромбоцита (MPV) при этом имеет статистически значимо большее значение (р=0,039). Доля мальчиков и девочек в группах оперативных и физиологических родов не отличалась (табл. 2). При исследовании групп мальчиков и девочек по отдельности все вышеописанные различия для способов родоразреше-ния сохранялись.
Известно, что повторные роды проходят с меньшей нагрузкой для плода, поскольку родовые пути более приспособлены для его прохождения. Установлено, что при увеличении паритета уменьшается количество лейкоцитов в ПК (18,14±0,22 • 109/л - первые роды; 16,22±0,25-109/л - 2-е; 15,44±0,61 • 109/л - 3-и и 15,1±1,37-109/л - 4-е и более; р<0,0001). Также
0,12 р=°,°3
% 1 0711 0105
Л -¡¡д-■-
! И ■ И
§0 2 I I I I
--!--!--!--
1-е роды 2-е роды 3-е роды 4-е роды
Рис. 2. Абсолютное количество CD34+ клеток ПК в зависимости от паритета.
уменьшается абсолютное количество нейтро-филов (с 8,91±0,13 • 109/л при первых родах до 6,86±0,65-109/л при 4-х; р<0,0001); абсолютное количество лимфоцитов (с 5,8±0,09 • 109/л при первых родах до 5,17±0,58 • 109/л при 4-х; р<0,0001); абсолютное количество моноцитов (с 2,54±0,04 • 109/л при первых родах до 2,1±0,09-109/л при 3-х; р<0,0001) и абсолютное количество базофилов (с 0,24±0,01 • 109/л при первых родах до 0,16±0,01 • 109/л при 3-х; р=0,017), что подтверждает гипотезу о снижении стрессового воздействия при последующих родах. Параметры красной крови и тромбоцитов в зависимости от паритета не изменялись. Процент мальчиков и девочек среди групп, составленных по паритету, не отличался. При исследовании групп, составленных только из девочек и мальчиков, различия сохранялись, что исключает влияние пола новорожденного на различия клеточного состава ПК в зависимости от паритета.
Количество CD34+ клеток повторяет закономерности, обнаруженные для лейкоцитов ПК. Обнаружена тенденция к уменьшению процентного содержания и статистически значимое уменьшение абсолютного количества CD34+ клеток при 4-х и более родах (рис. 2).
При сравнении количества CD34+ клеток в ПК при физиологических и оперативных родах статистически значимых различий не получено. Тенденция к уменьшению абсолютного количества CD34+ клеток в ПК при родах путем кесарева сечения, вероятно, связана с уменьшением общего количества лейкоцитов в данной группе.
Длительность периода изгнания при самостоятельных родах также является одним из основных стресс-индуцирующих факторов. Данные о длительности периода изгнания (от начала потуг до рождения ребенка) были известны у 368 рожениц. Медиана длительности этого периода составила 30 мин (диапазон - от 10 мин до 1 ч 15 мин). Роженицы были разделены на группы по длительности II периода родов: менее 15 мин; 15-30 мин и более 30 мин. При сравнении параметров ПК между группами были получены следующие результаты: при увеличении длительности этого периода увеличивалось количество лейкоцитов в перифери-
ческой крови (15,23±0,72 • 109/л при 1<15 мин; 18,29+0,6-109/л при 1>30 мин; р=0,014), в основном за счет абсолютного количества лимфоцитов (4,7+0,24-109/л при К15 мин; 6,24±0,3 • 109/л при 1>30 мин; р<0,0001). Отмечалась также тенденция к увеличению абсолютного количества нейтрофилов (7,61+0,43-109/л при 1<15 мин; 8,56+0,34-109/л при 1>30 мин; р=0,318) и моноцитов (2,06±0,11 • 109/л при 1<15 мин; 2,52+0,09-109/л при 1>30 мин; р=0,065). Также при увеличении периода изгнания отмечалось увеличение гематокрита (31,53±0,72% при 1<15 мин; 33,58+0,51°% при 1>30 мин; р=0,009). Среди остальных показателей достоверных различий не получено. Имеется тенденция к снижению процентного содержания CD34+ клеток при длительности периода изгнания более 30 мин (рис. 3). При определении ЭК (на 105 ММС) отмечено увеличение числа КОЕ-ш1х при увеличении длительности периода изгнания (различия статистически незначимы), а также недостоверное увеличение общего количества колоний и КОЕ-ГМ при длительности более 15 мин. Также отмечается тенденция со стороны КОЕ-М сначала к увеличению при длительности периода изгнания более 30 мин - изменения недостоверны. При определении ЭК (абс./мл) также отмечается тенденция со стороны КОЕ-ГМ и КОЕ-Э сначала к увеличению (длительность 15-30 мин), а затем к уменьшению (>30 мин), количество КОЕ-ш1х, наоборот, сначала уменьшается, затем увеличивается. Количество КОЕ-Г увеличивается при длительности более 15 мин, а КОЕ-М - при длительности более 30 мин (различия статистически незначимы). В процентном соотношении доля КОЕ-ш1х постепенно увеличивается с увеличением длительности периода изгнания; КОЕ-М сначала уменьшается (1530 мин), а затем увеличивается (>30 мин), а КОЕ-Э, наоборот, сначала увеличивается, затем уменьшается. При анализе полученных результатов определения уровня спонтанного апоптоза и некроза клеток ПК выявлена тенденция к увеличению количества лейкоцитов и лимфоцитов в состоянии некроза с увеличением длительности периода изгнания (рис. 4).
Гипоксия является мощным стрессовым фактором и, предположительно, должна приводить
Рис. 3. Абсолютное количество CD34+ клеток в зависимости от длительности периода изгнания.
I I
<15 мин 15-30 мин >30 мин
Рис. 4. Степень спонтанного некроза лейкоцитов ПК в зависимости от длительности периода изгнания. 1-й столбик - WBC-некроз, 2-й столбик - LYM-некроз.
не только к повышению количества эритроцитов с компенсаторной целью, но и к повышению количества других клеток крови как следствие цитокиновой мобилизации в ответ на стресс. В работе были проанализирован ряд состояний острой и хронической гипоксии плода. Установлено, что при острой гипоксии повышается количество эритроцитов 4,55+0,05-1012/л против 4,35±0,02 • 1012/л (p<0,0001), концентрация гемоглобина - 162,2±1,7 г/л против 156,1±0,9 г/л (p=0,001), уровень гематокрита - 32,98±0,46% против 31,86+0,24°% (p=0,027). Количество CD34+ клеток статистически значимо выше при острой и ниже - при хронической внутриутробной гипоксии плода. При внутриутробной гипоксии повышается как ЭК, так и уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК. При острой гипоксии плода жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэти-ческих стволовых клеток ПК не изменяется. При повышении степени зрелости плаценты ЭК имеет тенденцию к снижению, а степень спонтанного апоптоза - к повышению.
Внутриутробная гипоксия приводит к увеличению количества нормобластов в ПК -11,94+3,11/100 лейкоцитов против 5,42+0,53/100 лейкоцитов (p<0,0001). Однако повышение количества нормобластов происходит только в случаях хронической гипоксии плода, что свидетельствует о стимуляции эритропоэза. Увеличения количества нормобластов в ПК при острой гипоксии в родах не выявлено - 6,21+0,66/100 лейкоцитов против 5,32+1,25/100 лейкоцитов (p=0,55), что совпадает с данными исследования J.M. McCarthy al. [9]. Состояние острой гипоксии плода не отражается повышением количества нормобластов в ПК, поскольку система кроветворения не успевает ответить пролиферацией эритроидных предшественников. Исследование влияния различных факторов, приводящих к длительной гипоксии, позволило выявить корреляцию повышения нор-мобластов в ПК с рН ПК, низкой оценкой новорожденного по шкале Апгар [16, 18-21].
Исследования группы новорожденных с изменением цвета околоплодных вод (наличие меко-ния в амниотической жидкости), что является косвенным признаком внутриутробной гипок-
сии, также показали увеличение содержания нормобластов, уменьшение числа тромбоцитов и увеличение ширины распределения тромбоцитов и эритроцитов по объему, что соответствовало литературным данным [19, 22-24]. Так, при изменении цвета околоплодных вод отмечается тенденция к увеличению количества лейкоцитов (16,78±0,27-109/л - без патологии; 18,05±0,78 •109/л - изменение цвета вод; р=0,08) за счет достоверного увеличения абсолютного количества лимфоцитов (5,34±0,1-109/л - без патологии; 5,95±0,34-109/л - изменение цвета вод; р=0,029) и базофилов (0,19±0,01 • 109/л - без патологии; 0,27±0,04-109/л - изменение цвета вод; р=0,006). Количество эозинофилов, наоборот, имеет тенденцию к уменьшению (0,65±0,02-109/л - без патологии; 0,56±0,05 • 109/л - изменение цвета вод; р=0,08). Со стороны параметров красной крови отмечается достоверное увеличение гематокрита при изменении цвета околоплодных вод (р=0,042) и уменьшение RDW (р=0,05). Ряд исследователей связывают снижение уровня тромбоцитов в ПК при гипоксии с конкурентными механизмами эритропоэза и тромбопоэза [23-25].
При изучении степени повышения количества нормобластов и количества CD34+ клеток все образцы ПК были поделены на 2 группы: менее 15 нормобластов на 100 лейкоцитов и более 15 нормобластов на 100 лейкоцитов. При сравнении получены статистически значимые различия в абсолютном количестве CD34+ клеток в ПК (0,11±0,007 - при менее 15 нормобластов; 0,17±0,032 - при более 15 нормобластов; р=0,034). При проведении регрессионного анализа получена достоверная положительная корреляционная взаимосвязь абсолютного количества CD34+ клеток в ПК и количества нормобластов в ПК (г=0,3352; р=0,001). Кроме того, получена статистически значимая положительная корреляционная взаимосвязь между количеством нормобластов в ПК и количеством предшественников миелоид-ного ростка кроветворения - КОЕ-ГМ (г=0,6778; р=0,0004), КОЕ-Г (г=0,7833; р=0,00001) и КОЕ-М (г=0,7811; р=0,00001), а также суммарным количеством КОЕ (г=0,6367; р=0,0011). Таким образом, обнаруженное рядом авторов влияние количества нормобластов в ПК на скорость приживления миелоидного ростка кроветворения после трансплантации стволовых гемопоэтических кле-
ток ПК [26] нашло биологическое подтверждение в нашей работе.
Известно, что ПК не может отождествляться с кровью новорожденного даже в первые часы жизни, поскольку особенности клеточного состава ПК являются быстропроходящими последствиями процесса родов, а сыворотка ПК обладает выраженной цитокиновой активностью [27]. Если рассматривать ПК с точки зрения идентичного механизма мобилизации при помощи того же набора цитокинов, как при мобилизации периферической крови в постнатальном периоде, то, вероятно, такая картина может натолкнуть на мысль, что особенности течения беременности и родов, усиливающие родовой стресс, должны сопровождаться более высокими концентрациями мобилизующих цитокинов.
При сравнении концентрации Г-КСФ в периферической крови и ПК оказалось, что в ПК концентрация Г-КСФ составляет 44,8±12,2 пг/мл (п=45), что превышает нормальную концентрацию сывороточного Г-КСФ в периферической крови. Таким образом, концентрация Г-КСФ в сыворотке ПК доношенных новорожденных, отличающаяся от его нормальной концентрации в сыворотке здоровых доноров, что в сочетании с данными, свидетельствующими об увеличении количества лейкоцитов и CD34+ клеток в ПК при наличии ряда осложнений беременности и родов, а также физиологических состояний при нормальном течении родов, удлиняющих родовой процесс, позволяет предположить изменение уровня других цитокинов и ферментов, участвующих в Г-КСФ индуцированной мобилизации лейкоцитов и CD34+ клеток. При изучении уровня 1Ь8 в сыворотке ПК было показано, что концентрация 1Ь8 в сыворотке ПК была статистически значимо выше, чем у здоровых доноров, тогда как концентрация ММР-9 и ММР-2 в сыворотке ПК не отличалась от таковой в крови здоровых доноров (табл. 7).
Несмотря на отсутствие различий в концентрации основных мобилизующих цитокинов между ПК и кровью здоровых доноров, при ряде состояний, усиливающих родовой стресс, обнаружено повышение концентрации 1Ь8, ММР-9 и Г-КСФ (табл. 8).
Такое соотношение концентрации мобилизующих цитокинов в сочетании с количеством CD34+ клеток в результате мобилизации в ПК позво-
Таблица 7
Концентрация цитокинов в сыворотке ПК и здоровых доноров
Цитокины, пг/мл ПК (п=45) Доноры (п=25) р
]Ъ8 19,83±4,93 6,07±0,39 0,022
ММР-9 182,4±23,7 225,4±33,6 0,521
ММР-2 114,6±36,4 96,3±27,8 0,622
Г-КСФ 44,8±12,2 21,7±8,6 0,042
Таблица 8
Концентрация цитокинов в сыворотке ПК при некоторых особенностях течения беременности и родов
Факторы Цитоки-ны, пг/мл Наличие фактора Отсутствие фактора р
Внутриутробная гипоксия плода гипоксия (п=6) без гипоксии(п=31)
IL8 21,87±16,44 17,62±5,73 0,761
MMP-9 192,4±48,2 166,4±24,8 0,598
G-CSF 49,1±27,3 39,8±14,1 0,74
Острая гипоксия плода гипоксия (п=8) без гипоксии(п=31)
IL8 56,21±14,17 17,62±5,73 0,006
MMP-9 232,4±39,4 116,4±24,8 0,035
G-CSF 97,3±18,7 39,8±14,1 0,026
Пол новорожденного мальчики(п=16) девочки(п=15)
IL8 26,32±6,81 16,43±4,89 0,253
MMP-9 194,1±28,7 176,4±24,8 0,646
G-CSF 59,8±16,1 39,8±12,3 0,336
Способ родоразрешения самопроизвольные роды (п=22) плановое кесарево сечение(п=9)
IL8 20,62±6,82 12,14±3,88 0,449
MMP-9 201,8±32,3 93,2±44,2 0,071
G-CSF 48,2±16,2 32,6±18,8 0,584
ляет предположить, что хотя адаптация плода к процессу родов и позволяет объяснить многие тенденции в изменениях клеточного состава ПК в зависимости от ряда анте- и интранатальных факторов, но, вероятно, не является единственной причиной особенностей ПК.
Кроме того, в ряде работ было показано, что выраженная гипоксия (концентрация O2 0,9-1%) in vitro способствует самообновлению мышиных и человеческих гемопоэтических стволовых клеток [28, 29], при этом она не ведет к их дифферен-цировке. Ответом на сильную гипоксию CD34+ клеток ПК (концентрация O2 3%) in vitro было деление [30]. Количество CD34+ клеток, инкубированных в условиях гипоксии (концентрация O2 1%), было значимо больше, чем в культурах, инкубированных без гипоксии [31]. Таким обра-
зом, баланс между дифференцировкой и самообновлением стволовых клеток сдвинут в сторону последнего. Показано, что концентрация кислорода регулирует дифференцированную экспрессию белков cd34FL и cd34TFmRNA, что может объяснить лучшую выживаемость примитивных гемо-поэтических клеток при низкой концентрации кислорода [32].
Таким образом, можно считать, что клеточный состав ПК доношенного новорожденного, являясь следствием стресс-индуцированной мобилизации клеток крови, в том числе и CD34+ гемопоэтических предшественников, из костного мозга в периферический кровоток отражает не только течение периода родов, но и является следствием многих процессов, протекавших во время беременности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Broxmeyer HE. Cord Blood: Biology, Immunology, Banking, and Clinical Transplantation. Maryland: American Association of Blood Banks Bethesda Maryland, 2004: 455 p.
2. Broxmeyer HE, Gluckman E, Auerbach A, et al. Human umbilical cord blood: a clinically useful source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells [review]. Int. J. Cell Cloning. 1990; 8 (Suppl. 1): 76-91.
3. Румянцев СА. Гемопоэтические стволовые клетки пупо-винной и периферической крови у детей (характеристика, процессинг и моделирование биологических свойств для клинического использования): Автореф. дисс....докт. мед. наук. М., 2007.
4. Lim FT, Scherjon SA, van Beckhoven JM, et al. Association of stress during delivery with increased numbers of nucleated cells and hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood. Am. J. Obstet. Gynecol. 2000; 183 (5): 1144-1152.
5. D'Souza S№, Black P, MacFarlane T, Jennison RF. Hematological values in cord blood in relation to fetal hypoxia. Br. J. Obstet. Gynaecol. 1981; 88: 129-132.
6. Salafia CM, Minior VK, Lopez-Zeno JA, et al. Relationship between placental histologic features and umbilical cord blood
gases in preterm gestations. Am. J. Obstet. Gynecol. 1995; 173 (4): 1058-1064.
7. Thilaganathan B, Athanasiou S, Ozmen S, et al. Umbilical cord blood erythroblast count as an index of intrauterine hypoxia. Arch. Dis. Child Fetal Neonatal Ed. 1994; 70 (3): F192-194.
8. Blackwell SC, Refuerzo JS, Ahn MO, Martin GI. Nucleated red blood cell count and early onset neonatal seizures. Am. J. Obstet. Gynecol. 2000; 182: 1452-1457.
9. McCarthy JM, Capullari T, Thompson Z, et al. Umbilical cord nucleated red blood cell counts: normal values and the effect of labor. J. Perinatol. 2006; 26 (2): 89-92.
10. Aroviita P, Teramo K, Hiilesmaa V, Kekomaki R. Cord blood hematopoietic progenitor cell concentration and infant sex. Transfusion. 2005; 45 (4): 613-621.
11. Maconi M, Rolfo A, Cardaropolo S, et al. Haematologic values in healthy and small for gestational age newborns. Lab. Hematol. 2005; 11 (2): 152-156.
12. Perri T, Ferber A, Digli A, et al. Nucleated red blood cells in uncomplicated prolonged pregnancy. Obstetrics Gynecology. 2004; 104: 372-376.
13. Solves P, Perales A, Moraga R, et al. Maternal, neonatal
and collection factors influencing the haematopoietic content of cord blood units. Acta Haematol. 2005; 113 (4): 241-246.
14. Axt R, Ertan K, Hendrik J, et al. Nucleated red blood cells in cord blood of singleton term and post-term neonates. J. Perinat. Med. 1999; 27 (5): 376-381.
15. Green DW, Elliott R, Mandel D, et al. Neonatal nucleated red cell in discordant twins. Am. J. Perinatol. 2004; 21 (6): 341-345.
16. Ferns SJ, Bhat BV, Basu D. Value of nucleated red blood cells in predicting severity and outcome of perinatal asphyxia. Indian J. Pathol. Microbiol. 2004; 47 (4): 503-505.
17. Cairo MS, Wagner EL, Fraser J, et al. Characterization of banked umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells and lymphocyte subsets and correlation with ethnicity, birth weight, sex, and type of delivery: a Cord Blood Transplantation (COBLT) Study report. Transfusion. 2005; 45 (6): 856-866.
18. Ferber A, Grassi A, Akyol D, et al. The association of fetal heart rate patterns with nucleated red blood cell counts at birth. Am. J. Obstet. Gynecol. 2003; 188: 1228-1230.
19. Jones II CM, Greiss FC. The effect of labor on maternal and fetal circulating cateholamines. Am. J. Obstet. Gynecol. 1982; 144 (2): 149-153.
20. Saracoglu F, Sahin I, Eser E, et al. Nucleated red blood cells as a marker in acute and chronic fetal asphyxia. Int. J. Gynecol. Obstet. 2000; 71 (2): 113-118.
21. Ustun Y, Engin-Ustun Y, Kaya E, et al. Elevated nucleated red cell count: a population-based study. J. Reprod. Med. 2006; 51 (1): 36-40.
22. Bernstein PS, Minior VK, Divon MY. Nucleated red blood cells counts in small-for-gestational age fetuses with abnormal umbilical artery Doppler studies. Am. J. Obstet. Gynecol. 1997; 177: 1079-1084.
23. Dollberg S, Livny S, Mordecheyev N, Minouni F. Nucleated red blood cells in meconium aspiration syndrome. Obstet. Gynecol. 2001; 97: 593-596.
24. Redzko S, Przepiesc J, Zak J, et al. Hematologic parameters in the cord blood labor complicated by meconium-stained amniotic fluid. Ginekol. Pol. 2000; 71 (8): 931-935.
25. MebergA, Jakobsen E, Halvorsen K. Humoral regulation of erythropoiesis and thrombopoiesis in appropriate and small for gestational age infants. Acta Paediatr. Scand. 1982; 71 (5): 769-773.
26. Laughlin MJ, Eapen M, Rubinstein P, et al. Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia. N. Engl. J. Med. 2004; 351 (22): 2265-2275.
27. Jones J, Stevens CE, Rubinstein P, et al. Obstetric predictors of placental/umbilical cord blood volume for transplantation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2003; 188 (2): 503-509.
28. Ivanovic Z, Belloc F, Faucher J-L, et al. Hypoxia maintains and interleukin-3 reduces the pre-colony-forming cell potential of dividing CD34+ murine bone marrow cells. Exp. Hematol. 2002; 30: 67-73.
29. Ivanovic Z, Dello Sbarba PD, Trimoreau F, et al. Primitive human HPCs are better maintained and expanded in vitro at 1 percent oxygen than at 20 percent. Transfusion. 2000; 40: 1482-1488.
30. Ivanovic Z, Hermitte F, de la Grange PB, et al. Simultaneous maintenance of human cord blood SCID-repopula-ting cells and expansion of committed progenitors at low O2 concentration (3%). Stem. Cells. 2004; 22 (5): 716-724.
31. Sun B, Bai CX, Feng K, et al. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of CD34(+) hematopoietic stem/ progenitor cells and their response to cytokines. Sheng Li Xue Bao. 2000; 52 (2): 143-146.
32. Brunet De La Grange P, Barthe C, Lippert E, et al. Oxygen concentration influences mRNA processing and expression of the cd34 gene. J. Cell Biochem. 2006; 97 (1): 135-144.
РЕФЕРАТЫ
ПЕРЕДАЧА ВИРУСА VARICELLA ZOSTER ОТ ДЕТЕЙ С ГЕРПЕТИЧЕСКОМ ИНФЕКЦИЕИ ИЛИ ВЕТРЯНОЙ ОСПОЙ В ШКОЛАХ И ДЕТСКИХ САДАХ
Поскольку частота ветряной оспы (ВО) снизилась после введения вакцинации, случаи инфекции, вызванной вирусом Herpes zoster (ГЗ) могут начать играть большую роль в передаче вируса ВО (ВВО). Мы исследовали, каким образом случаи ГЗ и ВО вносят свой вклад в частоту ВО в школах и детских садах.
Собирали и анализировали данные опросов, проведенных в Филадельфии в сентябре 2003 - июне 2010 гг. Случай ВО в школе или в детском саду расценивали как спорадический, если о нем сообщалось >6 недель после или >10 дней ранее других сообщений о передаче ВВО. Случай ВО расценивали как повторный, если он возникал через 10-21 день после предыдущего случая ГЗ или спорадической ВО. Анализ сравнивал частоту передачи ВВО от больных со спорадической ВО или ГЗ, в зависимости от наличия вакцинации против ВО и тяжести заболевания.
Из 290 зарегистрированных случаев ГЗ 27 (9%)
дали вторичные случаи заболевания ВО. Из 1358 зарегистрированных спорадических случаев ВО 205 (15%) дали вторичные случаи ВО. Доля больных, у которых отмечалась вторичная ВО с легким течением заболевания, была почти одинаковой среди тех, кто контактировал с больными ГЗ и с больными ВО (70 и 72% соответственно). Передача ВВО была наивысшей у невакцинированных больных со спорадической ВО (р<0,01).
Передача ВВО от больных ГЗ вносит свой вклад в заболеваемость ВО. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выделить факторы риска и разработать рекомендации для предупреждения передачи ВВО от больных ГЗ.
Viner K, Perella D, Lopez A, et al. J. Infect. Dis. 2012; 205(9): 1336-1341.
