CC BY
64
УДК 577.29:615 + 577.334 С.А. Чукаев, О.А. Роднаева,
Л.Р. Абидуева, Л.А. Нагаслаева
ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
В серии экспериментов in vitro проведена сравнительная оценка степени выраженности антиоксидантных свойств ряда препаратов растительного происхождения, полученных из флоры Байкальского региона. Проведено количественное определение активности тестируемых средств в отношении липидных радикалов и активных форм кислорода. Обоснована целесообразность их использования для профилактики и лечения состояний свободнорадикальной патологии.
Ключевые слова: антиоксиданты, фармакологические средства растительного происхождения, хемилюми-несценция.
S.A. Chukaev, O.A. Rodnaeva, L.R. Abidueva, L.A. Nagaslaeva
EVALUATION OF ANTIOXIDANT PROPERTIES OF PHARMACOLOGICAL REMEDIES OF PLANT ORIGIN IN EXPERIMENTS IN VITRO BY CHEMILUMINESCENT METHOD
In the series of experiments in vitro the comparative estimation of antioxidative properties of a number of remedies ofplant origin taken from the flora of Baikal region has been conducted. The quantitative definition of activity of tested remedies in relation to lipid radicals and to active oxygen forms has been carried out. The expediency of their use for prophylaxis and treatment of free-radical pathology has been proved.
Keywords: antioxidants, pharmacological remedies of plant origin, chemiluminescence.
Одной из актуальных задач современной биологии и медицины является разработка и внедрение в клиническую практику новых эффективных и безопасных лекарственных и парафармацевти-ческих средств растительного происхождения, предназначенных для профилактики и лечения распространенных заболеваний, большинство из которых, согласно, данным литературы являются разновидностями так называемой «свободнорадикальной патологии» [2] и требует применения фармакологических средств из группы антиоксидантов [5]. Исходя из вышеизложенного, необходимым этапом исследований является определение антиоксидантной активности (АОА) фармакологических средств в сериях скрининговых исследований in vitro; причем предпочтительными являются схемы, позволяющие проводить сравнительную оценку данного параметра в ряду препаратов [8] и предполагающие использование методов хемилюминесцентного анализа [3, 4, 7].
Целью данного исследования явилась сравнительная оценка степени выраженности антиоксидантных свойств ряда фармакологических средств растительного происхождения, полученных из флоры Байкальского региона.
Материалы и методы. В данном исследовании были изучены фармакологические свойства ряда фармакологических средств растительного
происхождения: листьев облепихи крушиновидной экстракта сухого (ЭОК), корней шлемника байкальского экстракта сухого (ЭШБ), корней кровохлебки лекарственной экстракта сухого (ЭКЛ), цветков пижмы обыкновенной экстракта сухого (ЭПО) и листьев крапивы двудомной экстракта сухого (ЭКД). Все тестируемые фармакологические средства были синтезированы в Отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
В серии экспериментов in vitro способность тестируемого фармакологического средства перехватывать липидные радикалы определяли с использованием метода Fe2+-индyциpoвaннoй хеми-люминесценции (ХЛ) [6]. Степень выраженности антирадикальных свойств в отношении активных форм кислорода (АФК) оценивали по динамике изменения интенсивности процессов генерации радикальных интермедиантов в системе цитрат натрия (45 мМ), фосфатный буфер (КН2РО4 20 мМ; KCI 105 мМ; рН=7,45), люминол (10 мМ) [1]. Измерение интенсивности ХЛ проводили на установке «PXL-01» (Россия).
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методов вариационной статистики; для оценки степени достоверности различий между сериями экспериментальных наблюдений использовали непараметри-
ческий и-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
Результаты исследований
1. Влияние фитоэкстрактов на кинетику Fe2+-индуцированной ХЛ
В качестве субстрата окисления в эксперименте была использована суспензия многослойных липосом из липопротеидов яичного желтка. Для оценки влияния фитоэкстрактов на кинетику сверхслабого свечения определяли скорость нарастания интенсивности ХЛ на начальной стадии «медленной вспышки» (^ 5), амплитуду данного участка кинетической кривой (Н ), а также производили расчет численных значений антио-кислительной активности испытуемых средств путем анализа динамики изменения численных
Влияние фитоэкстрактов на па
значений двух указанных выше параметров при добавлении в реакционную систему возрастающих количеств испытуемых фармакологических агентов.
Как следует из полученных и представленных в таблице 1 данных, фитоэкстракты в низких концентрациях (0,01-0,025 г/л) практически не влияют на кинетику сверхслабого свечения; при этом ЭКЛ обусловливает некоторое снижение интенсивности «медленной вспышки» Fe2+-индyциpoвaннoй хе-милюминесценции, а ЭОК - наоборот, тенденцию к росту данного показателя (в среднем на 10,7%). Умеренные количества растительных средств обусловливают монотонное снижение уровня значений параметров tg 5 и Нмв.
Таблица 1
етры Ре2±-индуцированной ХЛ
Экстракт Концентрация (г/л) tg 5 (% от контроля) H м.в. (% от контроля)
ЭКЛ 0,01 85,6+6,1* 81,6+10,5
0,03 48,1+5,2* 53,5+4,0*
0,05 27,7+0,6* 31,6+3,7*
0,1 16,2+3,1* 26,3+2,6*
0,3 1,9+1,3* 2,6+1,8*
ЭШБ 0,01 82,2+12,2 101,3+9,3
0,025 66,9+2,7* 56,9+17,0*
0,05 35,6+13,2* 58,0+12,4*
0,1 11,0+4,2* 17,2+5,2*
0,3 0* 0*
ЭКД 0,05 88,8+12,0 79,1+6,2*
0,1 81,0+17,1* 66,7+9,2*
0,25 36,2+2,2* 44,4+5,2*
0,5 15,6+3,5* 26,8+5,5*
1,0 9,5+4,8* 10,8+5,7*
ЭОК 0,01 110,7+12,5 101,2+16,8
0,025 81,0+18,1 82,3+6,5*
0,05 56,9+6,1* 48,6+4,1*
0,1 23,0+7,5* 20,1+6,0*
0,3 0* 0*
ЭПО 0,01 86,8+14,4 89,2+6,5*
0,05 48,4+7,6* 62,4+3,1*
0,1 30,3+6,1* 40,3+6,0*
0,3 10,2+2,8* 16,5+1,6*
1,0 0,5+0,2* 1,2+0,3*
Примечание: * - статистически достоверное отклонение от контроля (р<0,05).
Фитосредства в максимальных концентрациях (0,3 г/л и выше) в большинстве наблюдений вызывают полное ингибирование сверхслабого свечения. Исключение составляет ЭКЛ, который даже в концентрации 1,0 г/л, не вызывает снижения интенсивности ХЛ до нулевых величин.
Как свидетельствуют результаты, представленные в таблице 2, эффективная действующая концентрация растительных экстрактов колеблется в пределах от 0,028 г/л до 0,180 г/л (по данным анализа динамики изменения параметра tg 5) и от
0,032 г/л до 0,188 г/л (по данным анализа динамики изменения параметра Н ).
Рассчитанный показатель антиоксидантной активности (АОА) для пяти изученных фармакологических средств колеблется в пределах от 5,56 (г/л)-1 до 35,71 (г/л)-1 (по данным анализа динамики изменения параметра tg 5) и от 5,32 (г/л)-1 до 31,25 (г/л)-1 (по данным анализа динамики изменения параметра Нмв).
Проведенный корреляционный анализ свидетельствует о том, что проявляется строгая взаимозависимость в изменении двух регистрируемых показателей «медленной вспышки» ХЛ. Так, значение коэффициента корреляции (г ) между параметрами АОА (по tg 5) и АОА (по Нмв) составляет 0,907, что указывает на существование функциональной зависимости между ними. Вместе с тем, данные литературы указывают на то, что динамика изменения максимальной скорости ингибирования «медленной вспышки» ХЛ в большей степени соответствует реальной способности фармакологических агентов ингибировать реакции ПОЛ [6]. Поэтому, очевидно, концентрационную зависимость параметра tg 5 следует учитывать, в первую очередь, при оценке степени выраженности антиоксидантных свойств тестируемых средств.
Таблица 2
Значения концентраций половинного ингибирования фитоэкстрактов по данным хемилюминесцентного анализа
Фито экстракты С1/2 (по tg 5), г/л С|/7 (по Н ), г/л 1/2 у м.в/’
ЭКД 0,180 0,188
ЭОК 0,054 0,048
ЭПО 0,048 0,075
ЭШБ 0,037 0,033
ЭКЛ 0,028 0,032
2. Влияние фитоэкстрактов на показатели лю-минолзависимой ХЛ.
Как известно, инициирующей стадией развития различных форм свободнорадикальной патологии в большинстве случаев является генерация активных форм кислорода, в первую очередь - су-пероксидного анион-радикала (02?) [2; 7]. В этой связи, представлялось важным оценить с помощью хемилюминесцентного анализа способность фитоэкстрактов «тушить» АФК. В данной серии экспериментов для численной оценки фармакологических эффектов по результатам анализа концентрационной зависимости интенсивности люминол-зависимой ХЛ рассчитывали величины антирадикальной активности (АРА) изучаемых растительных средств.
Полученные данные свидетельствуют о том, что тестируемые средства обладают достаточно выраженными антирадикальными свойствами.
Отличительной установленной особенностью действия ряда фитоэкстрактов (ЭТТТБ. ЭКЛ, ЭКД) явилась некоторая активация сверхслабого свечения в пробах, содержащих относительно малые количества исследуемых средств. Дальнейшее повышение концентрации данных средств обусловило монотонное снижение величины исследуемого показателя до значений, близких к нулевым.
Так, например, в экспериментах по определению уровня антирадикальной активности ЭКД снижение интенсивности сверхслабого свечения отмечается уже при добавлении фитоэкстракта в реакционную среду в концентрации 0,03 г/л; величина исследуемого показателя уменьшается на 69,9%. Отмеченный эффект сохраняется и при использовании более высоких концентраций экстракта (0,05-0,1 г/л); наблюдается уменьшение интенсивности Н202-индуцированной ХЛ (в среднем на 75,5-94,2% по сравнению с контролем).
Таблица 3
Антирадикальная активность фитоэкстрактов по отношению К активным формам кислорода
Название фармакологического средства Параметры, характеризующие антиоксидантные свойства фитоэкстрактов
С1/2, мг/л АРА, (г/л)'1
ЭКД 28,4 35,2
ЭОК 15,5 64,5
ЭПО 19,0 52,6
ЭШБ 11,2 89,3
ЭКЛ 4,2 238,1
Рассчитанные численные значения параметров С1/2 и АРА изученных растительных средств в отношении активных форм кислорода приведены в таблице 3. Полученные данные свидетельствуют о том, что фитоэкстракты способны достаточно эффективно «тушить» активные формы кислорода в диапазоне более низких концентраций (в сравнении с теми, в которых они проявляют свою активность по отношению к липидным радикалам) (табл. 1-3).
Заключение. По активности в отношении радикальных интермедиатов в порядке возрастания все изученные фитоэкстракты можно расположить в ряду: ЭКД < ЭПО < ЭОК < ЭШБ < ЭКЛ, по способности «тушить» АФК - в ряду: ЭКД < ЭПО < ЭОК < ЭШБ << ЭКЛ; причем данный вид активности является преобладающим у всех тестируемых средств.
ЭКД можно отнести к фармакологическим агентам с умеренно выраженными антиокси-дантными свойствами, а 4 других фитоэкстракта: ЭПО, ЭОК, ЭШБ и ЭКЛ - к средствам с высокой антиокислительной активностью.
Литература
1. Абдрашитова Н.Ф., Фархутдинов Р.Р., Загидул-лин Ш.З., Камилов Ф. Сравнительный анализ влияния антибиотиков на свободно-радикальное окисление in vitro и in vivo // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1998. -Т.125. - №3. - С. 297-299.
2. Журавлев А.И., Зубкова С.М. Антиоксиданты. Свободно-радикальная патология. - М.: Изд-во ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008. - 272 с.
3. Владимиров Ю.А. Активированная хемилюми-несценция и биолюминесценция, как инструмент в медико-биологических исследованиях // Соросов. образовав журн. - 2001. - Т.7. - №1. - C. 16-23.
4. Золотов Н.Н., Залилов К.Ю., Мухтаров Б.Э. и др. Определение антирадикальной активности химических соединений методом хемилюминесценции // Хим.-фарм. журнал. - 1989. - Т.23. - №11. - С. 1285-1289.
5. Колесова В.Г., Дадали В.А., Лойко В.И., Марченко В.А. Антиоксидантная терапия растениями // Эфферентная терапия. - 1996. - Т.2. - №1. - С. 67-71.
6. Лопухин Ю.М., Владимиров Ю.А., Молоденков М.Н. и др. Регистрация хемилюминесценции составных частей сыворотки крови в присутствии двухвалентного железа // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1983.
- Т.95. - №2. - С. 61-63.
7. Нанаева М.Т., Зурдинов А.З., Сабирова Т.С. и др. Использование метода активированной хемилюминесценции при изучении фармакологических свойств лекарственных препаратов // Вопр. мед. химии. - 1995.
- Т.41. - Вып.5. - С.48-50.
8. Сергеев П.В., Чукаев С.А. Сравнительное изучение антиоксидантных свойств фармакологических препаратов, блокирующих гистаминовые рецепторы, в модельной системе in vitro // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1996. - Т.122. - №12. - С.638-641.
Чукаев Сергей Александрович - кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой фармакологии и традиционной медицины Бурятского госуни-верситета, тел: 89021683164, e-mail: s_chukaev@mail.ru
Роднаева Ольга Анатольевна - кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры зоологии Бурятского госуниверситета, тел: 8902659348, e-mail: biology001@mail.ru
Абидуева Лыгжима Ранжуровна - кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры инфекционных болезней Бурятского госуниверситета, тел.: 89503841718.
Нагаслаева Лариса Андреевна - научный сотрудник Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
Chukaev Sergei Alexandrovich - candidate of medical sciences, associate professor, head of department of pharmacology and traditional medicine, Buryat State University. tel: 8(9021) 683164. E-mail: s_chukaev@ mail.ru
Rodnaeva Olga Anatolevna - candidate of biological sciences, senior lecturer, department of zooology, Buryat State University. tel: 8902659348; e-mail: biology001@ mail.ru
