CC BY
84
УДК 615.011
С.А. Чукаев, О.А. Роднаева
оценка спектра антиоксидантной активности гипорамина iN vitro
Бурятский государственный университет (Улан-Удэ)
В серии экспериментов продемонстрировано наличие у гипорамина (сухого экстракта листьев облепихи крушиновидной) комплексного механизма антиоксидантного действия, определяемого способностью фитосредства перехватывать липидные радикалы, «тушить» активные формы, кислорода и снижать содержание свободных ионов двухвалентного железа, что в итоге предопределяет также и эффект торможения накопления. ТБК-реактивных продуктов при добавлении, фитоэкстракта в модельную систему in vitro. Ключевые слова: антиоксиданты, хемилюминесценция, традиционная медицина, гипорамин
the estimation of antioxidant activity’s spectrum of hiporamine in vitro
S.A. Chukaev, O.A. Rodnaeva
Buryat State University, Ulan-Ude
It was shown, in series of experimental investigations, that pharmacological remedium, «hiporamine» (dry extract of Hippophae rham.naid.es leafs) demonstrates antioxidative properties. This kind of pharmacological activity of hiporamine bases on its capacity to trap the lipid, radicals and active oxygen species as well as on effect of drug to decrease the free ferrous ions concentration, in medium, of model system, in vitro.
Key words: antioxidants, chemiluminescence, traditional medicine, hiporamine
ВВЕДЕНИЕ
Одной из актуальных задач современной фармакологии является разработка новых эффективных и безопасных средств растительного происхождения. В частности, перспективным видом лекарственного растительного сырья является облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnaides L.). Биологически активные вещества, выделяемые из различных частей данного растения обладают антимикробными, ранозаживляющими, капилляроукрепляющими, антиревматически-ми свойствами [5], а также противолучевой активностью [4]. В настоящее время в клинической практике в качестве лечебно-профилактического средства при гриппе используется препарат гипорамин, представляющий собой сухой экстракт листьев облепихи крушиновидной) [9]. Его фармакологическая активность обусловлена присутствием в составе фитоэкстракта полифенольного комплекса галлоэлаготанинов. Тем не менее, следует отметить, что молекулярнобиохимические механизмы действия данного фармакологического средства изучены к настоящему времени явно недостаточно, что ограничивает его использование в экспериментальной и клинической фармакологии. Данные, приводимые в различных литературных источниках, свидетельствуют о том, что присутствие биологически активных веществ, относящихся к группе фенолов или полифенолов, в фармакологических средствах природного происхождения определяет наличие у них антиоксидант-ных свойств [2, 7, 8, 12]. В связи с этим, целью данного исследования явилось проведение количественной оценки способности гипорамина ингибировать реакции свободнорадикального окисления.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В данном исследовании были изучены фармакологические свойства гипорамина (сухого
экстракта листьев облепихи крушиновидной) производства ЗАО «Фармцентр ВИЛАР» (Россия). В серии экспериментов in vitro способность тестируемого фармакологического средства перехватывать липидные радикалы определяли с использованием метода Fe2 + -индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) [3]. Степень выраженности антирадикальных свойств в отношении активных форм кислорода (АФК) оценивали по динамике изменения интенсивности процессов генерации радикальных интермедиантов в системе цитрат натрия (45 мМ), фосфатный буфер (КН2РО4 20 мМ; KCI 105 мМ; рН = 7,45), люминол (10 мМ) [1]. Динамику изменения содержания свободных ионов двухвалентного железа определяли в цветной реакции с о-фенантролином [12] при добавлении в реакционную среду тестируемых средств в концентрациях 0,1 г/л и 0,3 г/л и ионов Fe2+ 20 мкМ, 40 мкМ и 60 мкМ. Кроме этого, общую антиоксидантную способность гипорамина определяли по методике, приведенной в работе [6], определяя концентрационную зависимость содержания ТБК-реактивных продуктов (ТБКРП) в суспензии липосом, приготовленных из желточных липопротеидов. Измерение интенсивности ХЛ проводили на установке «PXL-01» (Россия), а спектрофотометрические исследования на приборе СФ-46 (ЛОМО, Россия).
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методов вариационной статистики; о степени достоверности различий между экспериментальными группами судили по результатам численного определения параметра U (применяя непараметрический критерий Вилкоксона — Манна — Уитни).
результаты исследования
На первом этапе исследований изучали влияние гипорамина на динамику изменения параметров Fe^-индуцированной ХЛ в модельной системе, содержащей суспензию многослойных липосом из желточных липопротеидов. Эффекты фитопрепарата оценивали в широком диапазоне концентраций, имея ввиду необходимость предварительного определения диапазона эффективных действующих концентраций. Выявлено, что гипорамин in vitro практически не влияет на амплитуду «быстрой вспышки» ХЛ; при этом прослеживается концентрационная зависимость изменения параметров характеризующих интенсивность «медленной вспышки» сверхслабого свечения. Добавление в модельную систему тестируемого средства в наименьшей из исследованных концентраций (0,01 г/л) обусловливает тенденцию к некоторому увеличению максимальной скорости увеличения интенсивности ХЛ (параметр tg d); при этом амплитуда «медленной вспышки» (параметр Нм.в.) остается практически на уровне контрольных величин. Дальнейшее повышение концентрации тестируемого средства обусловливает монотонное снижение величин исследуемых показателей до нулевых значений (табл. 1).
Отмеченный фазный характер изменения интенсивности ХЛ соответствует данным, приводимым в ряде литературных источников [7, 11], согласно которым результирующий эффект соединений фенольной и полифенольной природы может иметь как про-, так и антиоксидантный характер и определяться в каждом конкретном случае химической природой биологически активного вещества и металла переменной валентности, их концентрационными соотношениями и типом модельной биологической системы.
Рассчитанное численное значение концентрации гипорамина, вызывающей двукратное уменьшение величины регистрируемых параметров (параметр С1/2 ) составило: 0,054 г/л — по tg 8 и
0,048 г/л — Нм.в.
На следующем этапе исследований изучали влияние гипорамина на интенсивность люми-нолзависимой ХЛ, индуцированной добавлением перекиси водорода и оценивали, таким образом, способность тестируемого средства к «тушению» АФК. Выявлено, что фитоэкстракт при добавлении в модельную систему в наименьшей из исследо-
ванных концентраций (0,01 г/л) не изменяет интенсивность ХЛ (рис. 1). Дальнейшее повышение концентрации гипорамина обусловило монотонное снижение величины исследуемого показателя до значений, близких к нулевым.
Концентрация гипорамина, в г/л
Рис. 1. Влияние гипорамина на интенсивность люминолза-висимой хемилюминесценции.
Как известно, одним из механизмов непрямого антиоксидантного действия химических соединений является их комплексообразующая способность по отношению к ионам двухвалентного железа. В этой связи в отдельной серии экспериментов было изучено влияние гипорамина на содержание Fe2+ в модельной системе in vitro. Выявлено, что добавление тестируемого фармакологического средства в реакционную среду в концентрациях 0,1 — 0,3 г/л обусловливает снижение содержания свободных ионов двухвалентного железа в среднем на 29,5 — 43,2 % по сравнению с уровнем контрольных значений (20 — 60 мкМ) (рис. 2). Эффект является статистически значимым при всех исследованных концентрационных соотношениях добавляемых в модельную систему реагентов, однако умеренный характер его выраженности не позволяет, в отличие от двух пр едыдущих серий экспериментов, рассчитать численное значение параметра C1/2.
Результаты ТБК-теста свидетельствуют о том, что гипорамин в концентрациях 0,03 г/л и 0,1 г/л практически не изменяет содержание ТБКРП в модельной системе in vitro, добавление тестируемого фитосредства в больших количествах вызывает
Таблица 1
Влияние гипорамина на параметры Fe^-индуцированной хемилюминесценции
Концентрация гипорамина (г/л) tg а (% от контроля) H м.в. (% от контроля)
0,01 110,7 ± 8,5 101,2 ± 9,8
0,025 81,0 ± 6,1* 82,3 ± 6,5*
0,05 56,9 ± 4,7* 48,6 ± 4,1*
0,1 23,0 ± 2,8* 20,1 ± 1,9*
0,3 0* 0*
Примечание: * - статистически достоверное отклонение от контроля (р < 0,05).
Концентрация гипораыина, в г/л
Рис. 2. Влияние гипорамина на содержание свободных ионов Fe2+.
существенное уменьшение исследуемого показателя (в среднем на 31,4 — 82,8 %) (рис. 3). При этом, в отличие от результатов, полученных при проведении хемилюминесцентного анализа, достижения нулевых величин исследуемого параметра даже в диапазоне высоких концентраций (1,0 — 3,0 г/л) не регистрируется. Рассчитанное методом интерполяции численное значение параметра С1/2 (по результатам ТБК-теста) составляет 0,68 г/л.
Таким образом, в серии экспериментов in vitro установлена способность гипорамина ингибировать реакции свободнорадикального окисления и установлены молекулярно-биохимические механизмы его антиоксидантного действия, состоящие в наличии у него как прямой радикалперехватывающей активности в отношении липидных радикалов, так и непрямых антиоксидантных свойств (а именно, способности «тушить» активные формы кислорода и снижать содержание свободных ионов двухвалентного железа). Указанные виды активности определяют также и способность фитоэкстракта тормозить накопление ТБКРП в модельной системе in vitro. В сравнительном плане — в максимальной степени выражены эффекты взаимодействия ги-порамина с АФК, в минимальной — способность регулировать содержание ионов двухвалентного железа и тормозить образование продуктов пере-кисного окисления липидов. По всей видимости антиоксидантные свойства фитоэкстракта определяются наличием в его составе полифенольного комплекса галлоэллаготанинов [5]. Учитывая тот факт, что фармакологический эффект в данном случае определяется суммарным действием целого ряда биологически активных веществ, с нашей точки зрения, при проведении численной оценки степени выраженности действия гипорамина и подобных ему средств природного происхождения более правомерно использовать термин «антиоксидантная способность» [10], а не антиоксидантная активность, как это принято для химически чистых биологически активных веществ.
Следует также отметить, что диапазон концентраций, в которых регистрируются указан-
Концентрация гипорамина, в г/л
Рис. 3. Влияние гипорамина на содержание ТБК-реактивных продуктов.
ные выше эффекты соответствует диапазону экспериментально-терапевтических доз, в которых данное фармакологическое средство применяется in vivo. Таким образом, способность гипорамина к комплексной регуляции процессов свободнорадикального окисления является одним из основных механизмов его фармакологического действия, предопределяющим потенциально широкие показания к его применению в качестве средства профилактики и коррекции состояний свободнорадикальной патологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдрашитова Н.Ф. [и др.] // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1998. - Т. 125, № 3. - С. 297-299.
2. Колесова В.Г. [и др.] // Эфферентная терапия. - 1996. - Т. 2, № 1. - С. 67-71.
3. Лопухин Ю.М. [и др.] // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1983. - Т .95, № 2. - С. 61-63.
4. Мизина Т.Ю. / Т.Ю. Мизина, С.Г. Ситни-кова // Раст. ресурсы. - 1999. - Т. 35, Вып. 3. -С. 85-92.
5. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири / Минаева В.Г. - 5-е изд., перераб. и доп. - Но-восибсрск: Наука. Сиб. отделение, 1991. - 431 с.
6. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопро-теидов / Клебанов Г.И. [и др.] // Лаб. дело. - 1988.
- № 5. - С. 59-62.
7. Сыров В.Н. [и др.] // Хим.-фарм. журнал. -1987. - Т. 21, № 1. - С. 59-62.
8. Чукаев С.А. [и др.] // Сиб. мед. журнал. -2005. - Т. 53, № 4. - С. 61-64.
9. Щелканов М.Ю. [и др.] // Иммунология. -2001. - № 4. - С. 21-23.
10. Prior R.L. / R.L. Prior, G. Cao // Free Radic. Biol. and Med. - 1999. - Vol. 27, N 11-12. -P. 1173-1181.
11. Sugihara N. [et al.] // Free Radic. Biol. and Med.
- 1999. - Vol. 27, N 11-12. - P. 1313-1323.
12. Yoshino M. / M. Yoshino, K. Murakami //Anal. Biochem. - 1998. - Vol. 257. - P. 40-44.
