CC BY
159
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM 1, ESCHERICHIA COLI М-17 В БИФИКОЛЕ ПРИ СОВМЕСТНОМ ИХ ВЫРАЩИВАНИИ
А.В. Ладыгина
Лаборатория бактерийных вакцин и препаратов из нормофлоры Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича Пер. Сивцев Вражек, 41, Москва, Россия, 119002 8(903)2448567
На модели биосовместимости выявлен сложный механизм взаимодействия культур B. bifidum 1 и E. coli М-17 в смешанной популяции при совместном их культивировании: бифидобактерии и продукты их метаболизма ингибируют рост кишечной палочки, а кишечная палочка и продукты ее метаболизма стимулируют рост бифидобактерий.
Ключевые слова: бификол, взаимодействие культур B. bifidum 1 и E. coli М-17, метаболиты, ингибирующее и стимулирующее влияние.
Постоянное влияние неблагоприятных факторов на жизнедеятельность человека, нередко превышающее компенсаторные возможности состояния системы «окружающая среда — макроорганизм — микробиоциноз», способствует развитию дисбиотического состояния и, как следствие этого, проявлению заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. Для профилактики и лечения таких состояний в медицинской практике широко используют пробиотики [1]. Представители нормофлоры принимают самое непосредственное участие в биохимических, метаболических и иммунологических процессах макроорганизма за счет продукции ими различных ферментов, витаминов, биологически активных (антибио-тикоподобных) веществ и других, разных по действию, продуктов метаболизма
Лечебное действие монопрепарата ограничено индивидуальным спектром биологической активности штамма, на основе которого изготовлен пробиотик. Для повышения и расширения лечебного действия пробиотиков в практику здравоохранения внедрены комплексные препараты, изготовленные на основе двух и более штаммов одного вида или разных видов представителей нормофлоры: бификол, ацилакт, аципол, флорин форте.
Отечественный комплексный препарат бификол разработан на основе двух видов микроорганизмов: Bifidobacterium bifidum 1 и Escherichia coli М-17 [1]. Несмотря на длительный срок производства препарата, серии бификола отличаются друг от друга по показателям количественного содержания живых бифидобакте-рий и кишечной палочки в дозе. Это может быть обусловлено несовершенством технологии изготовления бификола, использованием различных по составу питательных сред, изменением свойств микроорганизмов при совместном их культивировании, несовместимостью используемых штаммов и другими факторами. Механизм взаимодействия культур в смешанной популяции бификола недостаточно изучен. В этой связи, целью настоящего исследования явилось изучение взаимовлияния культур B. bifidum 1 и Е. coli М-17 и продуктов их жизнедеятельности друг на друга при совместном их культивировании.
Ладыгина А.В. Особенности взаимодействия Bifidobacterium bifidum 1, Escherichia coli М-17...
Материалы и методы исследования. Для исследования использовали коммерческие серии бифидумбактерина и колибактерина.
Питательные среды: Блаурокка, Блаурокка с натрия азидом, казеиново-дрож-жевую — КД-5а, МПБ, приготовленные в соответствии с утвержденными нормативными документами.
Взаимодействие бифидобактерий и кишечной палочки в бификоле изучали в смоделированных опытах: 1) при одномоментном посеве в среды Блаурокка или КД-5а по 1 дозе бифидумбактерина и колибактерина (смоделированный бификол (СБ) — первый вариант (1В)) или культуры 1-го пассажа бифидобактерий и кишечной палочки засевали одновременно по 1 мл в пробирки с 18 мл среды Блаурокка и КД-5а — (СБ-2В); 2) при посеве 1 дозы колибактерина в центрифугат и фильтрат культуральной жидкости, полученной от суточной, двух- и трехсуточной культуры В. bifidum 1; 3) при посеве 1 дозы бифидумбактерина в центрифугат и фильтрат культуральной жидкости суточной культуры E. coli M-17. Количество выросших колоний в каждом опыте подтверждали путем высева десятикратных разведений выросшей культуры на питательные среды Блаурокка, Блаурокка с азидом натрия, МПБ. Центрифугаты и фильтраты культуральной жидкости (КЖ) би-фидобактерий и кишечной палочки получали путем центрифугирования бактериальной взвеси при 3500 об/мин. в течение 10 мин. с последующей фильтрацией через фильтр миллипор (размер пор 0,2 мкм). В исследованиях использовали цент-рифугаты и фильтраты суточной, двух- и трехсуточной культуральной жидкости бифидобактерий (ЦБ1, ЦБ2, ЦБ3) и суточной культуральной жидкости кишечной палочки (ЦК).
Результаты исследования и их обсуждение. Технология изготовления би-фикола предусматривает совместное культивирование B. bifidum 1 и E. coli М-17 на последнем этапе получения производственной биомассы. В специальных опытах по изучению биосовместимости штаммов использованы два варианта смоделированного бификола (СБ-1В и СБ-2В). Установлено, что при совместном культивировании обе культуры в смешанной популяции вели себя по-разному. Так, культура 1-го пассажа бифидобактерий в смоделированном бификоле 2В ингиби-ровала рост кишечной палочки: через 24 ч совместного культивирования содержание коликомпонента в бификоле 2В было на два порядка меньше по сравнению с суточной культурой (СК) (рис. 1-2В). В то же время кишечная палочка стимулировала рост бифидобактерий: через 24 ч (вместо 48—72 ч) содержание бифидобактерий достигало 108 живых микробных клеток в 1 мл (микр. кл/мл) (рис. 1-1В, 2В). Особенно четко эта закономерность наблюдалась при оценке взаимовлияния их продуктов метаболизма на рост при использовании центрифу-гатов и фильтратов культуральных жидкостей.
При посеве в центрифугаты ЦБ1, ЦБ2, ЦБ3 по 1 мл колибактерина с содержанием 109 микр. кл/мл обнаружен рост кишечной палочки в количестве 104— 103 микр. кл/мл. На фоне слабого роста кишечной палочки содержание бифидо-бактерий существенно увеличилось (до 107, 105, 103 микр. кл/мл соответственно вместо исходного — 101 микр. кл/мл в ЦБ). Посев в МПБ колибактерина подтвердил содержание живых бактерий кишечной палочки в количестве 109 микр. кл/мл (контроль) (рис. 2).
Количество жизнеспособных бактерий, logmKOE/доза
1 2 1 2 П П СК СК ОСО
Контроль
Н Коликомпонент смоделированного бификола Н Бифидумбактерин
И Колибактерин □ ОСО бифидумбактерина
Щ Бифидокомпонент смоделированного бификола
Рис. 1. Содержание живых бифидобактерий и кишечной палочки через 24 ч при совместном культивировании двух штаммов:
1 — КД-5; 2 — Блаурокка; 1В — одномоментный посев по 1 дозе коли- и бифидумбактерина; 2В — одномоментный посев 24-часовых культур коли- и бифидобактерий; П — монопрепарат, СК — 24-часовая культура
Рис. 2. Содержание выросших бактерий E. coli М-17 и В. bifidum 1 в мл при посеве в центрифугаты культуральной среды бифидобактерий через 24 ч культивирования
Ладыгина А.В. Особенности взаимодействия Bifidobacterium bifidum 1, Escherichia coli М-17.
При коррекции рН с 4,5 до 7,0 содержание кишечной палочки возрастало в ЦБ2 до 106 микр. кл/мл (на два порядка выше) по сравнению с ее содержанием при росте в ЦБ2 с кислой реакцией, но было на три порядка ниже, чем в контроле (109 микр. кл/мл).
Аналогичные результаты были получены при использовании фильтратов культуральной жидкости бифидобактерий. При отсутствии в фильтратах бифидо-бактерий содержание кишечной палочки увеличилось на два порядка (до 106 микр. кл/мл), однако было значительно ниже их содержания в контроле (1010 микр. кл/мл).
Противоположные результаты были получены при изучении влияния метаболитов кишечной палочки на рост бифидобактерий. В центрифугат и фильтрат суточной культуральной жидкости кишечной палочки засевали по 1 мл бифидум-бактерина (рис. 3-а, 1) или суточной культуры бифидобактерий 1-го пассажа (рис. 3-а, 2) и выращивали в течение 24 ч.
Рис. 3. Содержание живых бифидобактерий и кишечной палочки в 1 мл при посеве в центрифугаты и фильтраты суточной культуральной жидкости кишечной палочки: а) центрифугат кишечной палочки; б) фильтрат кишечной палочки; 1 — посев 1 мл препарата бифидумбактерина; 2 — посев 1 мл суточной культуры бифидобактерий
Культура в центрифугатах и продукты метаболизма кишечной палочки оказывали стимулирующее действие на рост бифидобактерий: через 24 ч количество их достигало 109 микр. кл/мл вместо 108 микр. кл/мл; в контроле рост бифидобактерий учитывали через 72 ч (рис. 3-а). Эта же закономерность отмечена при использовании фильтрата КЖ кишечной палочки (рис. 3-б).
Из данных литературы известно, что метаболиты E. coli M17 могут стимулировать рост различных штаммов эшерихий, бифидобактерий и лактобацилл [2]. Наибольший эффект они оказывали на штамм продуцент. Аномально высокие ин-
дексы стимуляции были получены и для бифидобактерий. Хроматографический анализ состава препаратов показал, что из всех содержащихся в культуральной жидкости компонентов максимальной способностью стимулировать рост штамма-продуцента (E. coli M17) обладает янтарная кислота, являющаяся типичным продуктом брожения E. coli. Менее активным стимулятором оказалась глутами-новая кислота. В дальнейшем было исследовано более 20 компонентов культураль-ной жидкости и показано, что по характеру индивидуального действия на рост штамма-продуцента эти соединения можно условно разделить на 3 группы: 1) автостимуляторы роста (сукцинат, глутамат, ацетат, метионин, лизин); 2) автоингибиторы (аланин, аспартат, гистидин, формиат, цистеин); 3) нейтральные соединения. Совокупное действие указанных выше стимуляторов было значительно выше, чем каждого из них, при этом активность композиции возрастала, если в ее состав включали «нейтральные» соединения [2].
Проведенные нами исследования выявили сложный механизм взаимодействия бифидобактерий и кишечной палочки при их совместном выращивании. Накопление биомассы E. ^li M17 и B. bifidum 1 при совместном культивировании зависит от посевной дозы, физиологического состояния культур в посевном материале и образования различного типа метаболитов, что может отразиться на соотношении живых бактерий E. coli M17 и B. bifidum 1 и создавать условия получения нестандартного препарата. Стимуляция роста бифидобактерий метаболитами E. coli M17 в данном случае связана, по-видимому, с автостимуляторами роста: сукцинатом, глутаматом, ацетатом, метионином и лизином.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И. и др. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2004. — 3. — С. 83—87.
[2] Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты // Журн. микробиол. — 2005. — 5. — С. 108—114.
INVESTIGATION OF THE INTERACTION
OF BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM 1 AND ESCHERICHIA COLI M-17 IN THE BIFICOL PRAPARATION DURING THEIR SIMULTANEOUS CULTIVATION
A.V. Ladygina
L.A. Tarassevich Institute Sivtsev Vraghek, 41, Moscow, Russia, 119002
Using the model of biocompatibility the complicated mechanism of interaction between the B. bi-fidum 1 and E. coli M-17 was revealed during the simultaneous cultivation of these strains. Bifidobacteria and the products of their metabolism were shown to inhibit the growth of E. coli, at the same time the products of metabolism of E. coli stimulate the growth of Bifidobacteria.
Key words: Bificol, cooperation B. bifidum and E. coli M-17 cultures, metabolites, inhibiting and stimulating effects.
