CC BY
123
E.I.Magradze, I. V.Shubina, S.A. Semakina, V.N. Markov
The dynamics dependence of Escherichia coli bacteria growth on conditions of the preliminary joint cultivation with Bifidobacterium bifidum bacteria
It was revealed that the growth of such bacteria as Escherichia coli depends on the time of combined cultivation with such bacteria as Bifidobacterium bifidum and in acidity of culture broth which contains bifidobacteria. It was determined that the antagonism of analyzed bacteria cannot be explained by competition of these kinds for substratum.
Маградзе Елена Ильинична
Шубина Ирина Владимировна
Семакина Светлана Александровна
Удмуртский государственный университет
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1, корп. 1
E-mail: magradze@udm. net
Марков Владимир Николаевич
Ижевская государственная медицинская академия
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281.
E-mail: microbio@igma.udm.ru
15. Arunachalam K., Gill H.S., Chandra R.K. Enhancement of natural immune function by dietary consumption of Bifidobacterium lactis (HN019) // Eur. J. Clin. Nutr. 2000. Vol. 54, № 3. P. 263-267.
16. Borriello S.P., Hammes W.P., Holzapfel W. at al. Safety of probiotics that contain Lactobacilli or Bifidobacteria // Clinical Infectious Diseases. 2003. Vol. 36. P. 775-780.
17. Chang Y.-H., Kim J.-K., Kim H.-J. at al. Selection of a potential probiotic Lactobacillus strain and subsequent in vivo studies // Antonie van Leeuwenhoek. 2001. Vol. 80. P. 193-199.
18. Chung H.S., Kim Y.B., Chung S.L. at al. Screening and selection of acid and bile resistant bifidobacteria // Intern. J. Food Microbiol. 1999. Vol. 47, № 1-2. P. 25-32.
19. Heinemann C. Purification and characterization of a surface-binding protein from Lactobacillus fermentum RC-14 that inhibits adhesion of Enterococcus faecalis 1131 // FEMS Microbiol. Lett. 2000. Vol. 190. P. 177-180.
20. Alander M., Satokari R., Korpela R. at al. Persistence of colonization of human colonic mucosa by a probiotic strain, Lactobacillus ramnosus GG, after oral consumption // App. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, № 1. P. 351-354.
21. Новик Г.И., Самарцев А.А. Сохранение жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при субкультивировании // Микробиология. 1998. Т. 67, № 5. С. 631-637.
22. Олескин А.В. Межорганизменные отношения на разных уровнях эволюции // Вестн. Mоск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1994. № 2. С. 3-14.
23. Смирнов В.В., Рева О.Н., Вьюницкая Е.И. Создание и практическое применение математической модели антагонистического действия бацилл при конструировании пробиотиков // Микробиология. 1995. Т. 64, № 5. С. 661-667.
24. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 567 с.
25. Nardi R.D., Santos A.R.M., Carvalho M.A.R. at al. Antagonism against anaerobic and facultative bacteria through a diffusible inhibitory compound produced by a Lactobacillus sp. isolated from the rat fecal microbiota // Anaerobe. 1999. № 5. P. 409-411.
26. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.
27. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее нормализующие и защитные функции // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. № 3. С. 179-183.
28. Chick H., Shin H.S., Ustunol Z. Growth and acid production by lactic acid bacteria and bifidobacteria grown in skim milk containing honey // J. of food science. 2001. Vol. 66, № 3. P. 478-481.
29. Etoh S., Sonomoto K. Ishizaki A. Complementary effects of bifidogenic growth stimulators and ammonium sulfate in natural rubber serum powder on Bifidobacterium bifidum // Biosci Biotechnol. biochem. 1999. Vol. 63, № 4. P. 627-631.
30. Wang Y.C., Yu R.-C., Chou C.-C. Growth and survival of Bifidobacteria and Lactis acid bacteria during the fermentation and storage of cultured soymilk drinks // Food Microbiol. 2002. № 19. P. 501-508.
Поступила в редакцию 10.09.05
бифидобактерии, тем больше времени требуется для достижения бактерицидного действия на Escherichia coli.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Новик Г.И., Астапович Н.И., Самарцев А.А. Исследование физиологобиохимических особенностей бифидобактерий на поздних стадиях развития популяций // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.70, № 3. С. 495-502.
2. Пахомова М.В. Нуклеотидный состав и содержание метилированных оснований в ДНК шести штаммов рода Bifidobacterium // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1999. № 1. С. 28-34.
3. Самарцев А. А. Особенности роста и образования внеклеточных протеиназ Bifidobacterium adolescentis 94-БИМ // Микробиология. 1997. Т. 66, № 5. С. 635-639.
4. Самарцев А.А., Новик Г.И. Продукция ассоциированных с клеточной стенкой протеиназ Bifidobacterium adolescentis 94-БИМ // Микробиология. 2000. Т. 69, № 6. С. 774-777.
5. Bouhnik Y., Flourie B., Riottot M. at al. Effects of fructo-oligosaccharides ingestion on fecal bifidobacteria and selected metabolic indexes of colon cancerogene-sis in healthy humans // Nutr. Cancer. 1996. Vol. 26, № 1. P. 21-29.
6. Салахетдинова О.Я. Топологические изменения ДНК как отражение адаптации к окислительному стрессу в условиях голодания по глюкозе и при переходе к росту // Микробиология. 2000. Т. 69, № 1. С. 70-74.
7. Сорокин А.А., Федорова Е.Р. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника. Казань, 1990. 34 с.
8. Тараканов Б. В. Характеристика энтеробактерий, продуцирующих микроци-токины - низкомолекулярные антибиотики // Микробиология. 2004. Т. 73, № 2. С. 188-194.
9. Coconnier M-H., Lievin V., Hemery E. at al. Antagonistic activity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the humav lactobacillus acidophilus Strain LB // App. Environ. Microbiol. Vol. 64, № 11. P. 4573-4580.
10. Kailasapathy K., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organsms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. // Immunol. Cell Biol. 2000. Vol. 78, № 1. P. 80-88.
11. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microflora: introducing the concept of prebiotics // J. Nutr. 1995. Vol. 125. P. 1401-1412.
12. Hopkins M.J., Sharp R., Macfarlane G.T. Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and communiti cellular fatty acid profiles // Gut. 2001. Vol. 48. P. 198-205.
13. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Журн. микр. эпидемиол. иммунол. 1999. № 6. С. 102-105.
14. Соколова К.Я., Соловьева И.В., Белова И.В. и др. Конструирование пробиотика, совместимого с антибиотикотерапией // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2005. № 1-2. С. 132.
Для уточнения характера антагонистических свойств B. bifidum были проанализированы средние начальные оптические плотности культур, измеренные при разбавлении совместных культур в бульоне в контроле и в опытах при кислотности культуральной жидкости, содержащей бифидобактерии, равной 100°Т (см. табл.). Начальная оптическая плотность культуры в контроле отличается приблизительно на 0,1 от подобного показателя в опыте. Из этого следует, что при совместном культивировании обе культуры практически не растут. Поэтому антагонизм исследуемых бактерий нельзя объяснить конкуренцией за субстрат. Для B. bifidum мясопептонный бульон с культурой E. coli не является питательной средой, поэтому бифидобактерии не могут конкурировать с E. coli за питательные вещества. Кишечные палочки хорошо растут на бифидум-среде, однако в присутствии бифидобактерий их рост подавляется. По видимому, и в кишечнике бактерии рода Bifidum не могут составлять E. coli конкуренцию за питательные вещества. Из научных данных и наших опытов следует, что биомасса E. coli растет быстрее, чем биомасса бифидобактерии. Это означает, что кишечные палочки быстрее потребляют субстрат и, таким образом, сами могут являться конкурентами за питательные вещества. Скорее всего механизм антагонистического действия бактерий рода Bifidobacterium на E. coli объясняется способностью бифидобактерий выделять в окружающую среду продукты метаболизма, подавляющие жизнедеятельность других микроорганизмов, среди которых уксусная и молочная кислоты играют не последнюю роль [1; 14; 18; 21; 27-29]. При этом следует помнить и то, что бифидобактерии обладают адгезивными свойствами [5; 10; 19; 20; 30]. Это дает им преимущество в борьбе за выживание в кишечнике: адгезированные к эпителию кишечной стенки бифидобактерии вымываются из кишечника в меньшей степени, чем бактерии, находящиеся в просвете кишечника, среди которых находятся большей частью кишечные палочки.
Средние начальные оптические плотности совместных культур в бульоне в контроле и в опытах при кислотности культуральной жидкости, содержащей бифидобактерии, равной 100°Т
Начальная оптическая плотность Время совместного культиви ювания, ч
1 3 6 12 24 Контроль
0,294 0,288 0,326 0,317 0,315 0,215
Выводы
Антагонистическое действие бифидобактерий на кишечную палочку зависит от времени совместного культивирования. Длительность воздействия В. bifidum на Е. соИ коррелирует с длительностью ^-фазы роста кишечной палочки при последующем культивировании на мясопептонном бульоне. В зависимости от кислотности корреляция носит линейный либо логарифмический характер. Чем ниже кислотность культуральной жидкости, содержащей
Рис.2. Кривые роста Escherichia coli на мясопептонном бульоне после совместного культивирования с Bifidobacterium bifidum с начальной кислотностью 100±10°Т: —♦----1 час совместного культивирования; —■ 3 часа совместного культивирования; —▲----------------------------------------6 часов совместного культивирования; —х
12 часов совместного культивирования; —ж— 24 часа совместного культивирования; —|---------48часов совместного культивирования; —• контроль
Рис.3. Зависимость продолжительности lag-фазы от времени совместного культивирования исследуемых культур при кислотности культуральной жидкости, содержащей Bifidobacterium bifidum, 100°Т и 150°Т: —▲-------
lag-фазы (15G °Т); —■ lag-фазы (1GG °Т); — линии корреляции
зе зависимости длительности ^-фазы от времени совместного культивирования исследуемых культур при кислотности культуральной жидкости, содержащей В. bifidum, 150°Т (рис. 3), выявлено, что зависимость имеет линейный характер с коэффициентом корреляции, равным 0,9914.
Рис.1. Кривые роста Escherichia coli на мясопептонном бульоне после совместного культивирования с Bifidobacterium bifidum с начальной кислотностью 150±10°Т: —♦----1 час совместного культивирования; —■------------------3 часа совместного культивирования; —▲-----------------------------------------------6 часов совместного культивирования; —•-
12 часов совместного культивирования; —х--контроль
Во втором эксперименте культуральная жидкость, содержащая бифидобактерии, имела кислотность 100±10°Т. В рамках эксперимента были проведены опыты, в которых совместное культивирование E. coli и B. bifidum осуществлялось в течение 1, 3, 6, 12, 24 и 48 часов. На рис. 2 показаны кривые роста бактерий вида E. coli на мясопептонном бульоне после совместного культивирования с бифидобактериями. Для сравнения представлена кривая роста культуры E. coli, являющейся контролем. На рис. 3 показана зависимость длительности lag-фазы от времени совместного культивирования E. coli и B. bifidum при кислотности культуральной жидкости, содержащей бифидобактерии, 100°Т, которая имеет логарифмический характер с коэффициентом корреляции, равным 0,9756. На основании проведенных экспериментов можно утверждать, что чем длительнее воздействие культуры B. bifidum на E. coli, тем позднее кишечные палочки восстанавливают свою жизнедеятельность при последующем культивировании на мясопептонном бульоне. При понижении кислотности культуральной жидкости, содержащей B. bifidum, длительность lag-фазы при культивировании E. coli уменьшается.
Материалы и методика исследования
Объекты исследования: бактерии Bifidobacterium bifidum № 1
(H.Tissier,1899) (препарат лиофильно высушенных бактерий, производитель -г. Москва) и лабораторный штамм бактерий Escherichia coli (Escherich,1885). Лиофильно высушенные бифидобактерии предварительно выращивали на бифидум-среде (производитель - г. Оболенск) для вывода из анабиоза. Активные бифидобактерии культивировали на бифидум-среде при температуре 37±1°С до достижения кислотности, определенной начальными условиями опыта. Время культивирования определяли по кривым роста B. bifidum на бифидум-среде, полученным в более ранних экспериментах. Кислотность определяли титрованием 0,1н. раствором NaOH и выражали в градусах Тернера. Одновременно для активации пересевали на мясопептонный агар культуру E. coli, хранящуюся в холодильнике, и культивировали 24 часа. Через сутки культуру E. coli переносили с твердой питательной среды в пробирку с мясопептонным бульоном, доводили концентрацию бактериальной суспензии до требуемого значения. Концентрацию клеток определяли по оптической плотности суспензии, измеряемой на ФЭКе при длине волны 590 нм. Суспензии E. coli и B. bifidum сливали в равных объемах и осуществляли совместное культивирование определенное в каждом конкретном эксперименте время, при температуре 37±1°С. Затем совместную культуру разводили в 5 раз мя-сопептонным бульоном, отбирали пробы через равные промежутки времени, измеряли оптическую плотность на ФЭКе при длине волны 590 нм. Контролем при измерении оптической плотности служил стерильный мясопептон-ный бульон. Так как бифидобактерии не растут на мясопептонном бульоне, а для кишечных палочек, факультативных анаэробов, бульон является хорошей питательной средой, то изменение во времени оптической плотности бактериальной суспензии в нем отражает изменение биомассы только кишечных палочек. Контролем в опыте служила совместная культура, которую после сливания не культивировали в термостате, а сразу развели мясопептонным бульоном. Для сравнения опытов полученные результаты перевели в условные единицы, принимая начальные значения оптических плотностей за 1. Статистическая обработка производилась по методу Лакина [26].
Результаты и их обсуждение
Было проведено два эксперимента. В первом эксперименте культуральная жидкость, содержащая бифидобактерии, имела кислотность 150±10°Т. В рамках эксперимента были проведены опыты, в которых совместное культивирование E. coli и B. bifidum осуществлялось в течение 1, 3, 6, 12 и 24 часов. На рис. 1 представлены кривые роста E. coli на мясопептонном бульоне после совместного культивирования с бифидобактериями. Для сравнения приведена кривая роста контрольных бактерий E. coli. Кривая роста E. coli после совместного культивирования в течение 24 часов не приведена, так как в данном случае бактерии на мясопептонном бульоне не росли. Результаты свидетельствуют о зависимости длительности lag-фазы роста E. coli от продолжительности их совместного культивирования с B. bifidum. При анали-
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Микробиология
УДК 577.48 (045)
Е.И. Маградзе, И.В. Шубина, С.А. Семакина, В.Н. Марков
ЗАВИСИМОСТЬ ДИНАМИКИ РОСТА БАКТЕРИЙ ВИДА ESCHERICHIA COLI ОТ ПАРАМЕТРОВ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ С БАКТЕРИЯМИ ВИДА BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM
Выявлена зависимость роста бактерий вида Escherichia coli от времени совместного культивирования с бактериями вида Bifidobacterium bifidum и от кислотности культуральной жидкости, содержащей бифидобактерии. Установлено, что антагонизм исследуемых бактерий нельзя объяснить конкуренцией этих видов за субстрат.
Ключевые слова: бифидобактерии, совместное культивирование, антагонизм.
Бактерии рода Bifidobacterium bifidum являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных, выполняющей защитную и физиологическую функции [1-5]. Снижение количества бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте приводит к дисбактериозу кишечника, при котором снижается иммунный статус, ухудшаются обменные процессы в организме. Снижение количества представителей нормальной микрофлоры при дисбактериозах сопровождается колонизацией кишечника человека условно-патогенной и патогенной микрофлорой, резистентной к неблагоприятным факторам, в том числе к антибиотикам [6-12]. Поэтому для лечения дисбактериозов кишечника до полного выздоровления, сопровождающегося нормализацией микрофлоры кишечника, требуется длительное время. В последние годы для лечения дисбактериозов используют препараты, основным компонентом которых являются бифидобактерии [11-20]. Для оценки эффективности таких препаратов необходимо изучение антагонистических свойств бифидобактерий против патогенной и условно-патогенной микрофлор. Обычно антагонистические свойства изучаются с помощью методов, которые указывают на качество взаимоотношений микроорганизмов (влияют друг на друга - не влияют друг на друга) и являются статическими [1; 9; 21-25].
Цель данного исследования - изучение влияния бактерий Bifidobacterium bifidum на динамику роста лабораторного штамма Escherichia coli. Разработанная нами методика для изучения скорости роста биомассы кишечной палочки после совместного культивирования Escherichia coli и Bifidobacterium bifidum позволяет проследить динамику взаимоотношений этих двух микроорганизмов.
