CC BY
28
£Март-июнь 2009 г.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КУЛЬТУР BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM ШТАММ 1 И ESCHERICHIA COLI ШТАММ М-17В БИФИКОЛЕ В ОПЫТАХ IN VIVO НА МОДЕЛИ « ОСТРОЙ» И «ХРОНИЧЕСКОЙ»
токсичности
Ладыгина А.В., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В., Чупринина Р.П.
Институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва
f— — —■ = . - >
Изучено взаимодействие двух культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле на организм подопытных мышей линии Black С/57 на моделях «острой» и «хронической» токсичности. Показана безопасность комплексного препарата бификола при пероральном введении больших доз, которая проявляется в отсутствии признаков токсического действия препарата на центральную нервную систему, органы иммунной системы и другие внутренние органы подопытных животных.
Ключевые слова: бификол, «острая» и «хроническая» токсичность, безопасность
Вследствие увеличивающегося загрязнения окружающей среды, несбалансированного питания, стресса, приема лекарственных препаратов и других факторов, происходит нарушение эволюционно сложившихся микробиоценозов человека. По некоторым оценкам дисбак-териоз пищеварительного тракта среди россиян достигает 90%. Важная роль в лечении и профилактике дисбактериозов отводится пробиотикам, содержащим представителей нормальной микрофлоры человека [3]. Отечественный комплексный препарат бификол разработан на основе двух видов микроорганизмов — В. ЫЛс1ит шт. 1 и Е.соИ шт. М-17. При разработке бификола безвредность его изучалась на белых беспородных мышах массой тела 16-18 г путем перорального введения по 1 дозе препарата ежедневно в течение трех дней, а также на кроликах массой 2,5 кг путем однократного перорального введения каждому 5, 10 и 15 доз в один прием с интервалом в сутки [6]. Известно, что микроорганизмы в смешанной популяции могут обмениваться между собой генетическим материалом, в результате чего у входящих в их состав культур могут усиливаться или ослабляться некоторые биологические свойства по сравнению с монокультурами [2, 5, 7]. В связи с важной ролью биологических свойств культур и их возможной вариабельности и гетерогенности в смешанной популяции целесообразно было изучить механизм воздействия бифидобактерий и кишечной палочки на организм лабораторных животных в комплексном препарате по сравнению с их действием в монокультурах на модели «острой» и «хронической» токсичности.
Э
Исследования проводили в соответствии с международным соглашением о соблюдении правил гуманного отношения к животным.
Материалы и методы_
«Острую» и «хроническую» токсичность исследовали на 187 мышах обоего пола линии Black С/57 массой тела 15±1 г, чувствительных к действию токсических веществ, в соответствии с требованиями РД [4].
В опытах на модели «острой» токсичности исследовали смоделированный бификол и производственные штаммы В.bifidum шт. 1, E.coli шт. М-17. Производственные штаммы В.bifidum шт. 1 и E.coli шт. М-17 выращивали на средах Блаурокка и МПБ, соответственно. Концентрацию микробных клеток (микр. кл.) в 1,0 мл бифидобактерий и кишечной палочки определяли по ООО 42-28-59-85П в сравнении со стандартом мутности 10 ОЕ. Однократно внутрибрюшинно и перорально мышам вводили максимальные дозы: 1,0 мл взвеси кишечной палочки с содержанием 80 ОЕ микр. кл, взвеси бифидобактерий — 40 ОЕ микр. кл. и смоделированный бификол— 60 ОЕ микр. кл. (40 ОЕ E.coii шт. М-17 и 20 ОЕ В.bifidum шт. 1). Для определения LD50 при внутрибрю-шинном введении использовали три разные дозы смоделированного бификола (20 ОЕ, 10 ОЕ и 5 ОЕ микр. кл) и монокультуры E.coli шт. М-17 (10 ОЕ, 5 ОЕ, 2,5 ОЕмикр. кл.). Расчет LD50 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П. и Воробьева A.A. [1].
ПРЕПАРАТЫ
В наших исследованиях на модели «хронической» токсичности перорально вводили в течение 14 сут терапевтические дозы для человека бификола (5x108 бифидо-бактерий + 3x108 колибактерий КОЕ/мл), колибактерина (3x108 КОЕ/мл) и бифидумбактерина (5x108 КОЕ/мл), которые превышают мышиные* в 1000 и более раз.
Контрольной группе животных тем же способом вводили 0,9%-й раствор натрия хлорида, вторую контрольную группу составляли интактные животные.
В опытах на модели «острой» и «хронической» токсичности наблюдение за животными проводили в течение периода введения препарата и последующих 7 сут. Ежедневной регистрации подлежали гибель животных, оценивали внешний вид животных, поведенческие реакции. Для проведения гистологического исследования на 1 и 7 сут после окончания введения препарата забивали по 5 животных соответственно. Забой животных проводили эфирным наркозом с последующей де-капитацией. Вскрытие и осмотр внутренних органов проводили сразу после забоя, обращая внимание на состояние серозных покровов и содержимое полостей. Определяли, сравнивая с контролем, массу, цвет, степень кровенаполнения органов, цвет и вязкость крови, наличие кровоизлияний. Кусочки органов, взятые для гистологического исследования, фиксировали в 10% нейтральном формалине. После стандартной гистологической обработки с заливкой в парафин срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилином-эозином.
Результаты и обсуждение_
На модели «острой» токсичности установлено, что внут-рибрюшинное введение больших доз смоделированного препарата бификола (60 ОЕ/мл) и культуры Е.соН шт. М-17 (80 ОЕ/мл) приводило в течение суток к гибели животных, обусловленной развитием выраженных сосудистых и дистрофических изменений во внутренних органах, тяжелых гемодинамических нарушений, относящихся к разряду шоковых реакций. После введения больших доз взвеси культуры В.ЫЯс1ит шт. 1 (40 ОЕ /мл) обнаружены схожие морфологические изменения во внутренних органах, но они были выражены в меньшей степени и не сопровождались гибелью животных.
Для определения Ш50 мышам внутрибрюшинно вводили три разные дозы взвеси смоделированного бификола (20 ОЕ, 10 ОЕ, 5 ОЕ) и культуры Е.соН шт. М-17 (10 ОЕ, 5 ОЕ, 2,5 ОЕ) в объеме 0,5 мл. При макро- и микроскопическом исследовании выявлено, что внутриб-рюшинное введение смоделированного бификола и взвеси культуры Е.соН шт. М-17 в дозах 20 ОЕ и 10 ОЕ, соответственно, вызывало развитие выраженных сосудистых и дистрофических изменений во внутренних органах, что приводило к гибели животных. При уменьшении дозировки (для бификола — до 10 ОЕ и 5 ОЕ, для культуры Е.соН шт. М-17 — до 5 ОЕ и 2,5 ОЕ) характер морфологических изменений в ЦНС и внутренних органах сохранялся, но выраженность их была значительно ниже (рис. 1.1-1.8). По-видимому, сосудистые и дистрофические изменения во внутренних органах были обусловлены, с одной стороны, большой антигенной нагрузкой при внутрибрюшинном введении высоких концентраций испытуемых препаратов и, с другой стороны, наличием липополисахарида кишечной палочки.
Рис. 1.1.
Контрольные животные. Легкие, отсутствие изменений. Увеличение 1x100, окраска гематоксилин-эозином
Рис. 1.2.
Контрольные животные. Печень, отсутствие изменений. Увеличение 1x100, окраска гематоксилин-эозином
Следует отметить, что содержание в бификоле бифидо-бактерий приводило к снижению гибели животных и выраженности морфологических изменений во внутренних органах: LD50 для бификола составляет 14,13 ОЕ, для Е.соН шт. М-17 —6,41 ОЕ.
На модели «острой» токсичности выявлено, что пе-роральное введение больших доз смоделированного
€
-июнь 2009 г.
Ч' н\„*
* Г
/; .¿V* , • - Л- г
1 Г * * г * ^ ^ t * *
* «433 ¿>
UP ».. а
-t
Af" i
&
! > Hl
Рис. 7.3.
ß. bifidum 1, доза 40 ОЕ. Умеренное полнокровие в легких, кровоизлияния в межальвеолярных перегородках. Увеличение 1x100, окраска гематоксилин-эозином
Рис. 7.4.
В. bifidum 1, доза 40 ОЕ .Полнокровие в паренхиме печени, умеренные дистрофические изменения гепатоцитов. Увеличение 1x400, окраска гематоксилин-эозином
Рис. 7.5.
Е. coli шт. М-17, доза 5 ОЕ. Выраженное полнокровие в легких, образование участков микроателектазов и эмфиземы. Увеличение 1x100, окраска гематоксилин-эозином
бификола (40 ОЕ + 20 ОЕ), взвеси культур E.coli шт. М-17 (80 ОЕ) и В.bifidum шт. 1 (40 ОЕ) не приводило к развитию шоковых реакций. Через 1 сут после перорального введения больших доз смоделированного бификола и испытуемых штаммов все животные оставались клинически здоровыми. На вскрытии при
Рис. 7.6.
Е. coli шт. М-17, доза 5 ОЕ. Выраженное полнокровие в паренхиме печени, очаговые кровоизлияния, дистрофические изменения гепатоцитов. Увеличение 1x100, окраска гематоксилин-эозином
макроскопическом изучении внутренних органов отмечено умеренное полнокровие внутренних органов, особенно слизистой кишечника. При микроскопическом изучении внутренних органов у всех животных были обнаружены сосудистые изменения в легких с развитием на фоне полнокровия очаговых эмфизематозных реак-
Э
БИС™
ПРЬТАРАТЫ
Рис. 1.7.
Смоделированный бификол, доза 20 ОЕ. Выраженное полнокровие в легких, очаговые кровоизлияния, образование участков с эмфиземой. Увеличение 1x100, окраска гематоксилин-эозином
Рис. 1.8.
Смоделированный бификол, доза 20 ОЕ. Выраженное полнокровие в паренхиме печени, дистрофические изменения гепатоцитов. Увеличение 1x100, окраска гематоксилин-эозином
ций. В печени отмечалось полнокровие и умеренные дистрофические изменения гепатоцитов. Тимус и селезенка сохраняли свое обычное строение, с небольшой макрофагальной реакцией в корковом слое тимуса и краевом синусе селезенки. В ЦНС и других внутренних органах изменения отсутствовали. Через 7 сут все животные оставались клинически здоровыми. При макро- и микроскопическом изучении внутренних органов морфологических изменений не обнаружено.
Полученные данные макроскопических и микроскопических исследований указывают на развитие шоковых реакций при внутрибрюшинном введении больших доз исследуемых препаратов, которые отсутствуют при пероральном введении этих же доз препаратов.
На модели «хронической» токсичности при многократном (14 сут) пероральном введении мышам разовой дозы для человека смоделированного бификола, бифидумбактерина и колибактерина все животные оставались клинически здоровыми. На 1 сут и 7 сут после последнего введения испытуемых препаратов макро- и микроскопическое исследования не выявили патологических изменений и признаков токсического действия на ЦНС, дыхательную и иммунную системы, другие внутренние органы.
Сравнительный анализ результатов исследований показывает, что на модели «острой» токсичности при пероральном введении комплексного препарата и входящих в его состав культур, в дозах, превышающих терапевтическую дозу для человека, не отмечали гибели животных, каких-либо клинических проявлений, а также морфологических изменений в ЦНС и внутренних органах, указывающих на наличие у них токсических свойств. Гибель животных и выраженные гемодинами-ческие нарушения, при отсутствии выраженных дистрофических или деструктивных изменений во внутрен-
них органах при внутрибрюшинном введении испытуемых препаратов в больших дозах обусловлены, вероятнее всего, шоковой реакцией из-за большой антигенной нагрузкой. Доза 2,5 ОЕ, также превышающая терапевтическую дозу для человека, при внутрибрюшинном введении не приводит к гибели лабораторных животных, вызывает развитие умеренно выраженных гемодинамических нарушений в ЦНС и внутренних органах на 1 сут опыта и сопровождается полной нормализацией морфологической картины на 7 сут.
Следует отметить, что только внутрибрюшинное введение больших доз позволило выявить феномен взаимовлияния двух культур в комплексном препарате: LD50 для бификола составляет 14,13 ОЕ, для E.coli шт. М-17 — 6,41 ОЕ. Введение больших доз взвеси культуры B.bifidum шт. 1 (40 ОЕ/мл) в данном случае не сопровождалось гибелью животных.
При изучении «хронической» токсичности при пероральном введении исследованных препаратов в дозах, значительно превышающих терапевтические, все животные оставались клинически здоровы, а морфологические признаки, указывающие на наличие «хронической» токсичности, отсутствовали.
Таким образом, по результатам испытания «острой» и «хронической» токсичности комплексный препарат бификол, содержащий смешанную популяцию двух штаммов, безопасен, что проявляется в отсутствии признаков токсического действия препарата на центральную нервную систему и внутренние органы подопытных животных.
^Примечание. Суточную дозу эквивалентную человеческой (Эд) на кг массы тела животного, рассчитывают следующим образом: Эд = Мжх ЧД/Мч, где
£
-июнь 2009 г.
Мж — масса тела животного, ЧД — человеческая доза, Мч — масса тела человека (масса тела взрослого человека — 70 кг, масса тела ребенка — 10 кг).
Пример расчета:
Мж = Юг; Мч = 10 кг = 1x104; ЧД = 1x109
ЭД = 10x1x109/1x104 = 1x106
Литература
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А.//Статистические методы в микробиологических исследованиях. — Ленинград, Медгиз. — 1962. — 180 с.
2. Ганина В.И.//Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии. — Москва, 2001.
3. Грачева Н.М., Ющук Н.Д., Чупринина Р.П., Мацу-левич Т.В., Пожалостина Л.В.//Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов. Пособие для врачей и студентов. — М.— 1999. — 44 с.
4. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов: Руководящий документ 42-28-8-89. — С. 8-10.
5. Петров Л.Н., Галкин Г.Н., Петров Н.Л.//Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. — Санкт-Петербург. — 2008. — С. 136.
6. Рахимова Н.Г.//Разработка комплексного препарата бификол и его эффективность при кишечных расстройствах, связанных с дисбактериозом. Дисс. канд биол. наук. — Москва. — 1977.
7. Чупринина Р.П., Осипова И. Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина A.B.//Доклиническая оценка безопасности (безвредности) производственных штаммов и лекарственной формы пробиотиков. Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. — Москва. — 2006. — С. 105.
28 I
