CC BY
33
ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ (IL-1 И IL-10) У БОЛЬНЫХ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНЬЮ И ИХ АССОЦИАЦИИ С ПЕРСИСТЕНЦИЕЙ MYCOPLASMA HYORHINIS И ГЕНОТИПАМИ HELICOBACTER PYLORI
Э. Р. Абузарова1, О. В. Горшков1, О. А. Чернова1, В. М. Чернов1, Н. И. Акберова2, Р. А. Абдулхаков3
'Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН 2Казанский Государственный Университет 3Казанский государственный медицинский университет
РЕЗЮМЕ
В результате наших исследований впервые показано, что у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки достоверно чаще встречаются комбинации генотипов IL-1B-511C/C,IL-1B+3954C/C, IL-1RN1/1, IL-10-1082A/A, а у представителей контрольной группы — IL-1B-511T/C, IL-1B+3954C/C, IL-1RN1/2, IL-10-1082A/G. Между штаммами Тох- (cagA- vacAs1-) H. pylori и комбинацией генотипов IL-1B — 511Т/С, IL-1B +3954С /С, IL-1RN1/1, IL-10-1082G/G установлена достоверная ассоциация (р <0,05). У 19% больных обнаружена сочетанная инфекция H. pylori+ М. hyorhinis. В отношении комбинации генотипов IL-1B-511T/T, IL-1B+3954C/C, IL-1RN2/2, IL-10-1082A/G и сочетанной инфекции H. pylori+М. hyorhinis установлена достоверная связь (р <0,05).
Ключевые слова: факторы вирулентности Helicobacter pylori, полиморфизм генов IL-1, IL-10, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, Mycoplasma hyorhinis.
SUMMARY
It was found for the first time in our study that there is a significant prevalence of combinations of IL-1 and IL-10 genotypes — IL-1B-511C/C, IL-1B+3954C/C, IL-1RN1/1, IL-10-1082A/A and IL-1B-511T/C, IL-1B+3954C/C, IL-1RN1/2, IL-10- 1082A/G — in the group of patients with gastric and duodenal ulcer disease and control one, respectively. The correlation between the Тох- (cagA- vacAs1-) strains of H. pylori and the combinations of genotypes IL-1B — 511T/C, IL-1 В +3954C/C, IL-1 RN1/1, IL-10-1082G/G was shown (p <0,05). Co-infection with H. pylori and М. hyorhinis was detected in 19% of patients. The association between combinations of genotypes IL-1B-511Т/Т, IL-1B+3954C/C, IL-1RN2/2, IL-10- 1082A/G and co-infection with H. pylori and М. hyorhinis was also found (p <0,05).
Key words: Helicobacter pylori virulence factors, polymorphism of IL-1, IL-10 genes, gastric and duodenal ulcer, Mycoplasma hyorhinis.
ВВЕДЕНИЕ
Выяснение факторов восприимчивости и чувствительности к персистенции H. pylori представляет особенный интерес как для фундаментальных исследователей, так и практических разработок способов контроля хеликобактерных инфекций. Колонизация слизистой оболочки желудка хеликобактериями может быть причиной развития хронического гастрита, пептической язвы, а также аденокарциномы
желудка и первичной В-лимфомы [15]. Вместе с тем, у многих инфицированных H. pylori клинические проявления инфекции отсутствуют [10].
Причинами разнообразия клинических последствий инфекции могут быть вариабельность генотипов H. pylori в отношении факторов вирулентности H. pylori и полиморфизм генов иммунного ответа хозяина [4, 9].
терапевтическая гастроэнтерология
therapeutic gastroenterology
Генетически опосредованная восприимчивость и чувствительность к инфекциям в значительной мере зависит от ключевых иммуномедиаторов — IL-1 и IL-10, которые контролируют про- и противовоспалительные реакции, определяющие стимуляцию и ингибирование иммунного ответа, соответственно [2]. Генетический полиморфизм IL-1B-511C>T, IL-1B+3954 C>T, IL-1RN (VNTR) и IL-10- 1082G>A, обусловленный единичными нуклеотидными заменами и/или изменениями числа копий повторяющихся последовательностей в кодирующей и промоторной зоне, обусловливает различный уровень экспрессии генов интерлейкинов и, соответственно, характер иммунного ответа, контролируемый продуктами генов [2, 4, 9].
Предполагается, что носители определенных комбинаций генотипов колонизируются специфичными в отношении факторов вирулентности штаммами H. pylori [11, 12]. При этом в последнее время появились сообщения, что дополнительным фактором предрасположенности к персистенции H. pylori и связанной с ней гастродуоденальной патологии может быть колонизация слизистой оболочки желудка микоплазмами [5, 8]. Однако систематические исследования для проверки вышеуказанных предположений не проводились. В связи с этим целью наших исследований был анализ биоптатов больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H. pylori, на наличие микоплазм, выяснение особенностей распределения частот генотипов факторов вирулентности хеликобактера, а также ключевых иммуномедиаторов IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN (VNTR) и IL-10- 1082G>A у носителей инфекционных агентов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Группу обследования составили 123 больных (жителей г. Казани) язвенной болезнью желудка (ЯБЖ, n=35) и двенадцатиперстной кишки (ЯБД, n=88) в возрасте от 20 до 78 лет (средний возраст 42,3±12,9, мужчины/женщины = 66/57). Забор и анализ биоптатов слизистой оболочки желудка производился согласно рекомендации Momynaliev K. и соавт. [10]. При сравнении распределения частот полиморфных локусов генов цитокинов контролем послужила группа индивидов (n=123, средний возраст 41,1±10,5, мужчины / женщины = 42/ 81), отобранных по данным анамнеза (отсутствие язвенной патологии у них и их ближайших родственников).
Для экстракции и очистки ДНК использовали набор реагентов НПФ ЛИТЕХ «ХЕЛИКОПОЛ» (Москва). Выявление H. pylori проводили с помощью ПЦР с использованием специфичных праймеров на нуклеотидную последовательность гена ureC этих микроорганизмов. Детекцию M. hyorhinis проводили согласно Timenetsky J. с соавт. [13]. Для ге-нотипирования штаммов H. pylori в отношении cagA и vacA использовали набор реагентов НПФ «ЛИТЕХ» (Москва). Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей «DNA Analyzer».
Генотипирование IL-1 и IL-10 осуществляли с помощью ПЦР, а также ПДРФ [3, 4, 6]. Праймеры для амплификации нуклеотидных последовательностей соответствующих генов были синтезированы в НПФ «Литех» (Россия). Амплификацию полиморфных локусов IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN (VNTR) и IL-10- 1082G>A выполняли в соответствии с описанными протоколами [3, 4, 6].
Рис.1. Распределение комбинаций генотипов полиморфных локусов IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN (VNTR)) и IL-10-1082A>G в группе контроля и в группе инфицированных H. pylori больных язвенной болезнью.
* — р <0,05.
о
(N
tt/cc/11/gg tc/cc/12/gg tc/cc/11/gg cc/tt/11/gg cc/cc/11/gg tt/cc/11/ag tc/tt/12/ag tc/tc/12/ag tc/cc/22/ag tc/cc/12/ag tc/cc/ll/ag cc/tc/11/ag cc/cc/12/ag cc/cc/11/ag tt/cc/12/aa tc/cc/12/aa tc/cc/11/aa cc/tt/11/aa cc/tc/ll/aa cc/cc/11/aa
□ Tox-
□ Tox+
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
Рис.2. Распределение штаммов H. pylori с генотипом Tox+ (cagA+vacAs1+) и Tox- (cagA-vacAsl-) при носительстве разных комбинаций генов IL-1 и IL-10 у инфицированных H. pylori больных язвенной болезнью. * — р <0,05.
Рестрикцию ампликонов полиморфных локусов IL-1B проводили с использованием эндонуклеаз Aval и TaqI («Fermentas», Литва) [4]. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 2% агарозном геле («Хеликон», Россия) при напряжённости электрического поля 5-8 В/см. Анализ ампликонов осуществляли с помощью видеосистемы для регистрации гелей «DNA Analyzer» (НПФ «Литех», Россия).
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения MS Excel (Microcoft), программы MedCalc (v. 8.1.1.0). При сравнении частот генотипов и аллелей в контрольной группе и группе пациентов с ЯБД и ЯБЖ использовался критерий х2 (p) с поправкой Йейтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов (OR), а также рассчитывали его 95%-ный доверительный интервал (95%CI).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате тестирования биоптатов на наличие H. pylori микроорганизм был обнаружен у всех 123 пациентов.
На рис.1 представлены данные определения частот встречаемости разных комбинаций генотипов IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN (VNTR) и IL-10- 1082G>A у больных язвенной болезнью, ассоциированной с H. pylori, и у представителей контрольной группы. У больных язвенной болезнью обнаружены 36, а у представителей контрольной группы — 31 из 81 возможной комбинации генотипов IL-1 и IL-10. У больных язвенной бо-
лезнью достоверно чаще встречается комбинация генотипов IL-1B-511C/C, IL-1B+3954C/С, IL-1RN1/1, IL-10- 1082А/А, тогда как у представителей контрольной группы — IL-1B-511T/C, IL-1B+3954C/С, IL-1RN1/2, IL-10-1082А/G (рис.1).
Известно, что аллель G IL-10-гена в позиции -1082 (IL-10- 1082*G) обусловливает повышенную экспрессию гена противовоспалительного цитокина [9, 12], тогда как аллели Тв позиции -511 и С в позиции +3954 гена IL-1B — повышенную секрецию провос-палительного цитокина [16]. Генотип IL-1RN2/2 независимо от версий IL-1B определяет повышение секреции провоспалительного иммуномедиатора IL-ip [3, 11]. Таким образом, у больных язвенной болезнью, ассоциированной с H. pylori, наиболее часто встречаются генотипы, определяющие повышенный уровень IL-1, обусловливающего активацию иммунореактивности, а также повышенный уровень IL-10, опосредующего подавление иммунного ответа в отношении инфекционного агента.
На основании представлений о механизмах иммунореактивности в отношении инфекционных агентов, определяющих формирование и эволюцию системы «паразит- хозяин», было выдвинуто предположение об эволюционно закрепленной ассоциации генотипов ключевых иммуномедиаторов индивидов и генотипов штаммов H. pylori [8, 11]. Согласно этому предположению, слизистая оболочка желудка у индивидов с повышенной экспрессией IL-1 колонизируется «неагрессивными» штаммами H. pylori cagA-vacAs1- (Tox -); колонизация индивидов с повышенной экспрессией IL-1 «высокоагрессивными» штаммами H. pylori сопровождается вычленением генов вирулентности и, таким образом, превращением штаммов бактерий Тох+ в Тох — [11].
терапевтическая гастроэнтерология
therapeutic gastroenterology
о
со
Рис.3. Детекция ДНК Mycoplasma hyorhinis в биоптатах методом ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров.
1 -4, 6-9 — образцы ДНК из биоптатов слизистой оболочки желудка; 5 — отрицательный контроль, М — маркер молекулярной массы.
В противном случае может быть стремительное развитие фатальных событий вследствие высокой провоспалительной реактивности, индуцируемой факторами вирулентности H. pylori.
Данные о встречаемости генотипов Тох+ и Тох —
H. pylori у носителей разных генотипов IL-1 и IL-10 представлены на рис. 2.
Действительно, у носителей генотипов IL-1B-511Т/С, IL-1B+3954C/С, IL-1RN1/1, IL-10- 1082G/G, обусловливающих высокий уровень секреции про-воспалительного и противовоспалительного цито-кинов — IL-1ß, — чаще встречаются штаммы Тох-. При этом между штаммами Тох — H. pylori и комбинацией генотипа IL-1B-511T/С, IL-1B+3954C/С, IL-
1RN1 /1, IL-10-1082G/ G обнаруживается достоверная связь (р <0,05).
Между тем, в последнее время появились сообщения, что формирование и эволюция системы «паразит — хозяин», определяющей гастродуоденальную патологию, ассоциированную с H. pylori, может быть связана не только с генотипами H. pylori и иммуномедиаторов носителей данного микроорганизма, но и другими факторами, в частности, с персистенцией в слизистой желудка микоплазм [5, 8] — бактерий, способных модулировать иммунореактивность организма хозяина [1].
В результате тестирования биоптатов 123 больных язвенной болезнью на наличие микоплазм методом ПЦР (рис.3) было обнаружено, что 23 больных инфицированы М. hyorhinis (19%), — микоплазмой, ассоциированной с онкогенезом в желудке и двенадцатиперстной кишке у человека [5, 7, 8].
На рис.4 представлены результаты определения частоты встречаемости генотипов IL-1 и IL-10 у больных язвенной болезнью, ассоциированной с хеликобактериями, как в случае инфицирования М. hyorhinis, так и при отсутствии микоплазмы. Как следует из полученных данных, М. hyorhinis встречается у носителей разных генотипов, превалирующих у больных язвенной болезнью и иных, что может быть связано с уникальными возможностями микоплазмы преодолевать иммунный контроль независимо от особенностей иммунореактивности хозяина [1].
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
□ H.pylori+M.hyorhinis+ ■ H.pylori+M.hyorhinis-
ш.
Ui
а
ts "a £ "a "a "a
■a "a
ГЧ f- I- <4 IN
Ъ t3 u u
£ i 'S S
^ и и
■a
■a 'S
iN r- r-
'S
S I
£ -M
Г- ГЧ
tr
■a
■a tj tj tj
H H
Рис.4. Распределение комбинаций генотипов полиморфных локусов IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN (VNTR)) и IL-10-1082A>G у больных язвенной болезнью при сочетанной инфекции Н. pylori +M. hyorhinis.
* — p <0,05.
Тем не менее, в отношении комбинации генотипов IL-1B-511T/T, IL-1B+3954C/C, IL-1RN2/2, IL-10- 1082A/G, определяющих повышенную экспрессию провоспалительного и противовоспалительного цитокинов, и сочетанной инфекции
H. pylori+M. hyorhinis обнаружена достоверная ассоциация (р <0,05). Однако причинно-следственные связи персистенции М. hyorhinis и гастродуоденальной патологии, ассоциированной с H. pylori, еще предстоит выяснить.
Таким образом, в результате наших исследований впервые показано,что:
1. У больных язвенной болезнью достоверно чаще встречается комбинация генотипов IL-1B-511C/C, IL-1B+3954C/C, IL-1RN1/1, IL-10- 1082А/А, а у предста-
ЛИТЕРАТУРА
I. Борхсениус С. Н., Чернова О. А., Чернов В. М. Взаимодействие микоплазм с иммунной системой животных и человека.//Цито-логия. — 2001. — Т.43. — № 3. — С. 219-243.
2. ФрейдлинИ. С. Цитокины и межклеточные контакты в противо-инфекционной защите организма.//Соросовский образовательный журнал. — 1996. — № 7. — С.19-22.
3. El-OmarE. M., Carrington M., Chow W. et al. Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer./
/Nature. — 2000. — Vol.404. — P.398-402.
4. Garcia-Gonzalez M. A., Lanas A., Savelkoul P. H. M., Santolaria S., Benito R., Crusius J. B. A., Peña A. S. Association of interleukin 1 gene family polymorphisms with duodenal ulcer disease.//Clin. Exp. Immunol. — 2003. — Vol. 134. — P. 525-531.
5. Huang S., Li J. Y., Wu J., Meng L., Shou C. C. Mycoplasma infections and different human carcinomas.//World J. Gastroenterol. — 2001. — Vol.7. — P.266-269.
6. Karhukorpi J. The search for links between immunogenetic factors and recurrent miscarriage./Academic Dissertation. Oulo: University of Oulu, 2005. 75 p.
7. Ketcham C. M., Anai S., Reutzel R. et al. p37 induces tumor invasiveness. //Mol. Cancer Ther. — 2005. — Vol.4 — P.1031 —1038.
8. Kwon H. J., Kang J. O., Cho S. H., Kang H. B., Kang K. K., Kim J. K. et al. Presence of human mycoplasma DNA in gastric tissue samples from Korean chronic gastritis patients.//Cancer Sci. — 2004. — Vol.95. — P.311 - 315.
9. Machado J. C., Figueiredo C., Canedo P., Pharoah P., Carvalho R., Nabais S., Alves C. C., M. L. Campos, van Doorn L-J., Caldas C., Seruca R.,
вителей контрольной группы — IL-1B-511T/C, IL-1B+3954C/C, IL-1RN1/2, IL-10-1082A/G.
2. Между штаммами Тох- (cagA- va-cAs1-) H. pylori и комбинацией генотипов IL-1B-511T/C, IL-1B+3954C/C, IL-1RN1/1, IL-10 - 1082G/G существует достоверная связь (р <0,05).
3. В биоптатах 19% больных обнаружена сочетанная инфекция H. pylori+ М. hyorhinis.
4. Прослеживается достоверная связь (р <0,05) в отношении комбинации генотипов IL-1B-511T/T, IL-1B+3954C/C, IL-1RN2/2, IL-10- 1082A/G и сочетанной инфекции H. pylori+М. hyorhinis.
Carneiro F., Sobrinho — Simo'EsM. A proinflammatory genetic profile increases the risk for chronic atrophic gastritis and gastric carcinoma.//Gastroenterology. — 2003. — Vol.125. —
P.364 - 371.
10. Momynaliev K., Smirnova O., Kudryavtseva L., Govorun V. Helicobacter pylori genotypes in Russia.//Eur. J. Clin. Microbiol. Infec. Dis. — 2003. — Vol. 22. — N. 9. — P.1-8.
11. Rad R., Dossumbekova A., Neu B. et al. Cytokine gene polymorphisms influence mucosal cytokine expression, gastric inflammation, and host specific colonization during Helicobacter pylori infection.//Gut. —
2004. — Vol.53. — P.1082-1089.
12. Rad R., Prinz C., Neu B. et al. Synergistic effect of Helicobacter pylori virulence factors and interleukin-1 polymorphisms for the development of the severe histological changes in the gastric mucosa.//J. Infect. Dis. — 2003. — Vol.188. — P. 272-281
13. Timenetsky J., Santos L. M., Buzinhani M., Mettifogo E. Detection of multiple mycoplasma infection in cell cultures by PCR.//Braz. J. Mol. Biol. Research. — 2006. — Vol. 39. — P. 907-914.
14. Turner D. M., Williams D. M., Sankaran D. et al. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter.//Eur. J. Immunogenet. — 1997. — Vol.24. — P. 1-8.
15. van Doorn L.-J., Figueiredo C., Sanna R., Pena S. Expanding allelic diversity of Helicobacter pylori vacA.//J. Clin. Microbiol. — 1998. — Vol.36. — P. 2597-2603.
16. Wilkinson J. R., Patel P., Llewelyn M. Influence of polymorphism in the genes for the interleukine (IL)-1 receptor antagonist and IL-1ß on tuberculosis.//J. Exp. Med. — 1999.-Vol.189. — P. 1863-18.
Ф
терапевтическая гастроэнтерология
therapeutic gastroenterology
