CC BY
82
Особенности генотипов штаммов Helicobacter pylori, циркулирующих в Ростовской области
Е.А. Березняк1 ([email protected]), В.М. Сорокин1, И.О. Карпова2, Н.А. Ступина3,
А.Н. Терентьев1 ([email protected])
1 ФКУЗ «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
2 НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Ростов-Главный ОАО РЖД», г. Ростов-на-Дону
3 Филиал ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по Ростовской области в г. Ростове-на-Дону»
Резюме
Представлены результаты исследования генетических особенностей штаммов Helicobacter pylori, выделенных от больных с гастродуоденальной патологией в Ростовской области. Проведен анализ встречаемости генов патогенности cagA, vacA, iceA, babA и их сочетаний в региональных штаммах H. pylori.
В результате проведенного типирования 33-х региональных штаммов H. pylori по генам факторов патогенности (cagA, iceA, babA и аллелям ml, m2 и s1, s2 гена vacA) обнаружено 19 разных генотипов.
Доля высокопатогенных штаммов с генотипом vacAsl составила 85%. Инфицирование двумя и более штаммами имело место в 33% случаев.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, региональные штаммы, генотипы
Genotype Peculiarities of Regional Helicobacter Pylori Strains from the Rostov District
Е.А. Bereznyak1([email protected]), V.M. Sorokin1, I.O. Karpova2, N.A. Stupina3, A.N. Terentiev1 ([email protected])
1 Rostov-on-Don Antiplague Research Institute of Federal Service for Surveillance of Consumers Rights Protection and Human Well-Being
2 Railroad Clinical Hospital, Rostov-on-Don
3 Federal State Institution of Healthcare «Centre for Hygiene and Epidemiology for Rostov Region in Rostov-on-Don» Abstract
The results of genotype peculiarities study of Helicobacter pylori strains from the gastroduodenal patients of the Rostov district and the analysis of incidence of pathogenicity genes cagA, vacA, iceA, babA and their combinations in the regional H. pylori strains are presented. 19 different genotypes were found in the result of 33 regional strains typing of pathogenicity genes (cagA, iceA, babA and m1, m2 and s1, s2 vacA gene alleles). Percentage of highly pathogenic vacAs1 genotype strains was found to be 85%. Coinfection by two or more strains took place in 33% of cases. Key words: Helicobacter pylori, regional strains, genotypes
Введение
Helicobacter pylori ассоциируют с такими заболеваниями, как хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, лимфома и рак желудка [2, 6]. Этим возбудителем инфицировано около 60% населения планеты, что позволяет считать хеликобактериоз одной из наиболее распространенных в мире инфекций [5]. Инфицированность H. pylori взрослого населения России варьирует от 50 до 80%, а в некоторых регионах приближается к 100% [4, 7].
Высокая степень распространенности хели-кобактериоза среди различных групп населения, эпидемиологические пути передачи инфекции обуславливают внимание, которое уделяется внедрению современных методов диагностики
Н. руСп-ассоциированных заболеваний и мониторинга инфекции на федеральном и региональном уровнях [9].
Являясь чрезвычайно диверсивным бактериальным видом со значительными различиями генотипов штаммов, в частности в различных географических зонах [15], Н. ру/сп обладает множеством факторов патогенности, обеспечивающих колонизацию слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, а также персистирование в кислой среде желудка.
Определение факторов патогенности штаммов H. pylori, выделенных от пациентов, проживающих в различных регионах России, исследование их прогностического значения, создание генотипической карты расцениваются как определяющие факто-
ры в эпидемиологии и лечении H. ру/ог/-инфекции. Такого рода исследования в России осуществлены в ряде регионов [1, 3, 8].
Цель настоящей работы - определение особенностей генотипов клинических изолятов штаммов H. ру/ог/, циркулирующих в Ростовском регионе.
Материалы и методы
Группу обследования составили 33 пациента в возрасте от 13 до 69 лет, проживающих в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области. Диагноз (язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки, хронический гастрит) поставлен врачом-гастроэнтерологом на основании результатов дыхательного теста и гастродуоденоскопии, в процессе которой производилось взятие биоптата слизистой оболочки желудка. У больных было получено согласие на участие в исследовании.
Биопсийный материал засевали на Колумбийский агар (Columbia Blood Agar Base, Himedia). Посевы инкубировали в микроаэрофильных условиях при 37 0С. Чашки просматривали на 3-и и 5-е сутки. При получении культуры, по морфологии схожей с H. ру/ог/, проводили ее идентификацию (уреазный, каталазный, оксидазный тесты). Если все тесты были положительными, то выделенную культуру идентифицировали как H. ру/ог/.
Генотипирование выделенных штаммов проводили в лаборатории «Литех» (Москва) под руководством доктора биологических наук, профессора В.М. Говоруна и в Ростовском-на-Дону научно-исследовательском противочумном институте. Клинические изоляты были проанализированы методом ПЦР на одновременное присутствие генов cagA, vacA (аллельные типы vacAsl и vacAs2 и ал-лельные типы vacAml и vacAm2), /ceA (аллельные типы /ceA1 и /ceA2) и babA.
Выделение ДНК из клинических изолятов H. ру/ог/ проводили с помощью набора «Хеликопол II» производства НПФ «Литех» (Москва). Для гено-типирования генов вирулентности cagA, vacA, /ceA
и babA2 использовали коммерческие наборы НПФ «Литех» (Москва). Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» НПФ «ДНК-Технология» (Москва) в условиях, рекомендованных производителем. Продукты амплификации разделяли в 7,5%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Результаты документировали с помощью видеосистемы E-Box (Vilber Lourmat) и обрабатывали с использованием пакета программ E-Capt (Vilber Lourmat). При статистической обработке полученных результатов использовали t-критерий Стьюдента с уровнем доверительной вероятности 0,95.
Результаты и обсуждение
В группе обследованных пациентов было обнаружено 19 разных генотипов H. pylori. Доля пациентов, от которых были выделены cagA-позитивные штаммы (27 из 33 обследованных), составила 0,82 (0,66 - 0,91). Ген vacA встречался у всех исследованных штаммов (в различных аллельных вариантах). Доля пациентов с vacAsl-штаммами (28 из 33 обследованных) составила 0,85 (0,69 - 0,93), c vacAs2-штаммами (7 случаев) - 0,21 (0,11 -0,38). Частота обнаружения штаммов с генотипом vacАml (17 из 33) составила 0,52 (0,35 - 0,68), штаммов с генотипом vacAm2 (22 случая) - 0,67 (0,50 - 0,80). Также 22 изолята (67%) были iceAl-позитивными. Доля /ceA2-позитивных штаммов (17 из 33) составила 0,52 (0,35 - 0,68), babA-положительный генотип выявлен также у 17 штаммов (рис. 1).
Известно, что инфицирование H. pylori- штаммами, содержащими cag-патогенетический островок, обычно связано с более выраженным воспалительным ответом по сравнению с тем, который сопровождает инфицирование cag-негативными штаммами [11, 14]. Известно также, что уровень секреции вакуолизирующего цитотоксина определяется мозаичной структурой гена, кодирующего белок VacA.
Рисунок 1.
Частота выявления генов в штаммах H. pylori, выделенных от больных г. Ростова-на-Дону и Ростовской области
Ген, кодирующий этот цитотоксин, присутствует у всех штаммов, но демонстрирует мозаичность в терминальной и средней (т) областях. Имеются несколько аллелей, соответствующих различным количествам продуцируемого токсина: s1m1 соответствует наивысшей продукции, s1m2 -меньшей, тогда как штаммы с s2m2-аллелью вообще не продуцируют цитотоксин [10, 13]. Показано, что колонизация уасА51-/са£А-позитивными Н. руОп-штаммами связана с воспалением и дегенерацией эпителия слизистой желудка и увеличенным риском развития язвенной болезни, тогда как колонизация vacA з2т2/са£А-негативными штаммами не приводит к существенному риску возникновения язвенной болезни и ассоциируется с умеренной гастритной гистопатологией [12, 14].
Таким образом, есть основания считать высокопатогенными штаммы с генотипом часАв1/т1 (или vacAs1/m2), как са£-позитивные, так и са£-негативные, тогда как vacA з2т2/са£А-негативные штаммы можно рассматривать как низкопатогенные, ассоциируемые с умеренной гастритной гистопатологией. В настоящем исследовании высокопатогенные штаммы были обнаружены у 28 из 33-х обследованных пациентов (85%) (рис. 2).
У 27 больных были зарегистрированы саёА-позитивные штаммы, из них инфицирование штаммом с генотипом cagAvacAs1 имело место в 25 случаях. Генотип cagAvacAs1m1 наблюдался у 17 больных (52%). У десяти пациентов из этой группы обнаружено инфицирование несколькими штаммами Н. руОг\. У одного пациента смешанный по vacA-гену генотип обнаружен при инфицировании cagA-негативными штаммами. Таким образом, у 11 (33,3%) пациентов выявлены смешанные генотипы, свидетельствующие об инфицировании более чем одним штаммом Н. ру1оп (рис. 3).
В отдельных регионах России показатель инфи-цированности населения Н. ру1оп достигает 90 -100%, при этом смешанные генотипы встречаются в 30 - 40% случаев. Отмечается, что риск коин-
фекции смешанными штаммами может быть выше в регионах с высоким уровнем инфицирования населения Н. ру1оп [3]. Высокая частота обнаружения смешанных генотипов Н. ру1оп в Ростовской области позволяет предположить и высокий показатель инфицированности населения. Это согласуется с данными о том, что общая заболеваемость органов пищеварения в Ростовской области несколько выше, чем в среднем по России [9].
Сравнение результатов, полученных нами для Ростовского региона, с данными по другим регионам Российской Федерации [1, 3] показывает, что имеются некоторые географические особенности в распределении генотипов Н. руОп.
Так, генотип vacAs1 в Центральном регионе РФ встречается в 100% клинических изолятов Н. руОп, в Казани - в 77% случаев. В нашем исследовании этот генотип был обнаружен у 85% штаммов.
Распределение vacAm1 варьирует от 20 (г. Казань) до 33% (г. Красноярск и г. Уфа). В нашем исследовании доля штаммов с этим генотипом была несколько выше и составила 52%, причем все указанные штаммы были позитивными по s1-региону.
Инфицирование несколькими штаммами Н. руОп, имеющими разные генотипы, в исследованиях по РФ обнаруживается в 30 - 40% случаев. В нашем исследовании обнаружение нескольких штаммов имело место у трети всех обследованных.
Полученные к настоящему времени сведения о распределении cagA-негативных штаммов по регионам РФ неоднозначны. Так, по данным одних авторов, cagA-негативные штаммы не были обнаружены ни в одном из исследованных регионов РФ [3], по данным других - такие штаммы обнаружены в 35% клинических изолятов [1]. В Ростовском регионе cagA-негативные штаммы были выявлены нами в 18% случаев.
Генотип \ceA1 варьирует в регионах России от 46 (Москва) до 100% (Красноярск и Уфа, в Казани -60%). В Ростовском регионе доля таких штаммов составила 67%. Штаммы с генотипом \ceA2 ранее
Рисунок 2.
Соотношение между высоко- и низкопатогенными штаммами H. pylori
□ Низкопатогенные штаммы - 15%
□ Высокопатогенные штаммы - 85%
Рисунок 3.
Частота инфицирования одним, двумя или более штаммами H. pylori
□ Инфицирование двумя или более штаммами - 33,3%
□ Инфицирование одним штаммом - 66,7%
не были выделены в исследованиях по РФ, в настоящей работе штаммы с таким генотипом были обнаружены в 17 случаях (52%), причем у пяти обследуемых имело место инфицирование штаммами с генотипом, содержащим только iceA2-аллель, а в 12 случаях отмечено инфицирование смешанными штаммами по /сеА-гену.
Генотип babA2 был обнаружен нами в 52% клинических изолятов H. pylori, в г. Уфе и г. Казани -в 33%, в г. Красноярске - в 100% изолятов.
Выводы
1. В результате проведенного типирования 33-х региональных штаммов H. pylori по генам факторов патогенности (cagA, iceA, babA и аллелям ml, m2 и s1, s2 гена vacA) обнаружено 19 разных генотипов.
2. Доля высокопатогенных штаммов с генотипом vacAsl составила 85%. Инфицирование двумя и более штаммами имело место в 33% случаев.
Литература
1. Абузарова Э.Р. Особенности генотипов Helicobacter pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки: Автореф. дис. ... к.б.н. - Казань, 2008. - 23 с.
2. Аруин Л.И. Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori / 2-й Международный симпозиум «Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения». - М., 1999. C. 33 - 37.
3. Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Смирнова О.В. и др. Современные подходы к молекулярной диагностике и типированию клинических изолятов Helicobacter pylori в России // РЖГГК. 2002. № 3. С. 57 - 65.
4. Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Helicobacter pylori: гастрит, дуоденит (гастродуоденит), язвенная болезнь и другие геликобактер-ассоциированные заболевания // Рос. гастроэнтерол. журн. 1999. № 4. С. 92 - 98.
5. Кишкун А.А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori (Обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. № 8. C. 41 - 46.
6. Кожанова М.Г. Helicobacter pylori: роль в развитии гастродуоденальных заболеваний и методы дигностики // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. № 11. C. 52 - 55.
7. Пархоменко Л.К., Яруш Л.И., Глебова Т.А. и др. Частота выявления у подростков хеликобактериоза при гастродуоденальных заболеваниях и болезнях, не связанных с органами пищеварения // Клин. мед. 1996. № 4. C. 50, 51.
8. Пасечников В.Д., Котелевец С.М., Чуков С.З. и др. Прогностическое значение факторов патогенности Helicobacter pylori при различной гастродуоденальной патологии // Известия вузов: Естественные науки (Северо-Кавказский регион). 2005. Спецвыпуск. С. 42 - 44.
9. Atherton J.C., Peek R.M. Jr., Tham K.T. et al. Clinical and pathological importance of heterogeneity in vacA, the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori // Gastroenterol. 1997. V. 112 (1). P 92 - 99.
10. Blaser M.J. The biology of cag in the Helicobacter pylori-human interaction // Gastroenterology. 2005. V. 128. P. 1512 - 1515.
11. Chen X.J., Yan J., Shen Y.F. Dominant cagA/vacA genotypes and coinfection frequency of H. pylori in peptic ulcer or chronic gastritis patients in Zhejiang province and correlations among different genotypes, coinfection and severity of the diseases // Chin. Med. J. (Engl). 2005. V. 118 (6) . P. 460 - 467.
12. Guruge J.L., Falk PG., Lorens R.G. et al. Epithelial attachment alters the outcome of Helicobacter pylori infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95 (7). P. 3925 - 3930.
13. Tham K.T., Peek R.M. Jr., Atherton J.C. et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease // Hum. Pathol. 2001. V. 32 (3). P. 264 - 273.
14. Yamaoka Y., Osato M.S., Sepulveda A.R. et al. Molecular epidemiology of Helicobacter pylori: separation of H. pylori from East Asian and non-Asian countries // Epidemiol. Infect. 2000. V. 124. P 91 - 96.
