CC BY
427
Для корреспонденции
Пучкова Людмила Валентиновна - доктор биологических наук, профессор биохимии, руководитель лаборатории метаболизма микроэлементов ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики», ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», профессор кафедры биофизики ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»
Адрес: 197101, г. Санкт-Петербург, Кронверкский пр., д. 49 Телефон: (812) 552-79-64 E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0958-2812
Ильичева Е.Ю.1-3, Канаш Л.А.1, Тимирова З.Р.1, Цымбаленко Н.В.2, Орлов Ю.А.1, Клюева Н.Н.2, Скоморохова Е.А.1, Денисенко А.Д.2, Пучкова Л.В.1-3
Особенности метаболизма меди у крыс, содержавшихся на низко- или высококалорийном рационе
The changes of copper metabolism in rats fed with low- or high-calorie ration
Ilyechova E.Yu.i-3, Kanash L.A.1, Timirova Z.R.1, Tsymbalenko N.V.2, Orlov Yu.A.1, Klyuyeva N.N.2, Skomorokhova E.A.1, Denisenko A.D.2, Puchkova L.V.1-3
1 ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики», Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
3 ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», Санкт-Петербург, Россия
1 Peter the Great St.Petersburg Polytechnic University, St. Petersburg, Russia
2 Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russia
3 Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University, St. Petersburg, Russia
Медь относится к эссенциальным микронутриентам, так как является каталитическим и структурным кофактором ферментов, контролирующих базовые процессы во всех клетках, а также участником сигнальных путей. Токсические свойства ионов меди, обусловленные их химической природой, проявляются при нарушении ее гомеостаза в клетках и в целом организме.
Цель работы - выявление связи между калорийностью корма, статусом меди в крови, метаболизмом меди в печени и белой жировой ткани (БЖТ) крыс. Материал и методы. Работа выполнена на 3 группах (в каждой п=5) белых беспородных крыс (средняя масса тела 220+15 г), содержавшихся в течение 75 дней на стандартном, низкокалорийном (НКР) или высококалорийном (высокожировом) (ВКР) рационах. Концентрацию мРНК определяли методом
Для цитирования: Ильичева ЕЮ., Канаш Л.А., Тимирова З.Р., Цымбаленко Н.В., Орлов Ю.А., Клюева Н.Н., Скоморохова Е.А. Денисенко А.Д., Пучкова Л.В. Особенности метаболизма меди у крыс, содержавшихся на низко- или высококалорийном рационе // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 1. С. 41-48. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10004. Статья поступила в редакцию 07.08.2018. Принята в печать 27.12.2018.
For citation: Ilyechova E.Yu., Kanash L.A., Timirova Z.R., Tsymbalenko N.V., Orlov Yu.A., Klyuyeva N.N., Skomorokhova E.A., Denisenko A.D., Puchkova L.V. The changes of copper metabolism in rats fed with low- or high-calorie ration. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (1): 41-8. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10004. (in Russian) Received 07.08.2018. Accepted for publication 27.12.2018.
полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией. Содержание церулоплазмина (ЦП) определяли методом иммуноэлектрофореза, иммуноблоттинга и по оксидазной активности. Концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии.
Результаты и обсуждение. Показано, что в сыворотке крови крыс, содержавшихся на НКР, увеличивался уровень триглицеридов, а при ВКР снижались основные показатели статуса меди (концентрация атомной меди, уровень холо-ЦП и содержание иммунореактивного ЦП). В печени ни один из рационов не влиял на уровень экспрессии гена ЦП. В клетках подкожной жировой клетчатки при НКР достоверно повышалась концентрация обеих сплайс-форм ЦП-мРНК. В висцеральной жировой клетчатке при НКР концентрация ЦП-мРНК, кодирующей секреторный ЦП, не менялась, но содержание мРНК, кодирующей ЦП, связанный с мембраной, по сравнению с контрольной группой падало почти до нуля. При ВКР достоверных изменений в уровне обеих сплайс-форм ЦП-мРНК не было. Обсуждаются особенности метаболизма меди в клетках печени и БЖТ, обусловленные калорийностью корма.
Заключение. У крыс связь между метаболизмом меди и калорийностью рациона в печени проявляется в изменении экспрессии гена ЦП на уровне трансляции, а в БЖТ - на уровне транскрипции и посттранскрипционного созревания пре-мРНК этого гена.
Ключевые слова:метаболизм меди, церулоплазмин, экспрессия гена церуло-плазмина, статус меди сыворотки крови, белая жировая ткань, низко- и высококалорийный рацион
Copper is an essential micronutrient, because it is a catalytic and structural cofactor of enzymes that control the basic processes in all cells, and moreover it is a participant in signaling pathways. The toxic properties of copper ions, due to their chemical nature, are manifested when the cellular and/or organism systems for copper homeostasis are disturbed.
Aim of the work was to study the relationships between the diet caloric and the copper status in the blood serum, the copper metabolism in the liver and white adipose tissue (WAT) of rats.
Material and methods. The work was performed on three groups (each n=5) of white outbred rats (average body weight220 + 15g), kept for 75 days on a standard, low-calorie (LCR) or high-calorie (high-fat) (HCR) rations. mRNA concentration was measured by qRT-PCR technology. The сeruloplasmin (CP) content was determined by the method of immune electrophoresis, immune blotting and by oxidase activity. The copper concentration was measured by atomic absorption spectrometry.
Results and discussion. It has been shown that serum level of triglycerides increased in rats fed LCR. The main indicators of copper status (concentration of atomic copper, the level of holo-CP, and the content of immunoreactive CP) decreased in rats fed HCR. In the liver, none of the diets affected Cp gene expression level. In the cells of the subcutaneous fatty tissue, the concentration of both splice-forms of CP-mRNA significantly increased in rats fed LCR. In visceral adipose tissue the concentration of Cp-mRNA encoding the secretory CP did not change in LCR-rats, but the level of mRNA, encoding CP anchored to plasma membrane, dropped to almost zero as compared to the control group. There was no significant change in the level of both splice-forms of CP-mRNA in HCR-rats. The features of copper metabolism in the cells of the liver and WAT, due to the caloric content of ration, have been discussed.
Conclusions. In rats' liver, the link between copper metabolism and calorie intake is manifested in changes in the expression of the CP gene at the translation level, and in white adipose tissue - at the level of transcription andpost-transcriptional maturation of the pre-mRNA of this gene.
Keywords: copper metabolism, ceruloplasmin gene expression, serum copper status indexes, white adipose tissue, copper metabolism, low and high-calorie rations
В последние 20 лет физиологическая роль белой жировой ткани (БЖТ), которая долго рассматривалась только как инертное депо липидов, важное для поддержания энергетического баланса, в корне пересматривается. Формируется концепция, согласно которой БЖТ
является анатомически гетерогенным эндокринным органом, вовлеченным, помимо терморегуляции, в регуляцию углеводного и липидного обмена, а также в контроль над воспалительным ответом и чувствительностью к инсулину [1]. Недавно было показано, что церулоплазмин (ЦП),
основной медьсодержащий белок крови печеночного происхождения, который включает 95-96% внеклеточной меди [2, 3], является и адипокином [4, 5]. ЦП относится к полифункциональным белкам категории «moonlighting» [2], основными функциями которого являются окисление Fe(II) ^ Fe(III), требуемое для переноса железа через мембраны, регуляция уровня катехоламинов и транспорт меди к клеткам негепатоцитарных рядов. Показано, что клетки БЖТ продуцируют ЦП на низком уровне, однако синтез и секреция ЦП в кровоток многократно повышаются в клетках опухолей, развитие которых связано с ожирением [4, 5]. При хроническом дефиците сывороточного холо-ЦП в клетках подкожной жировой клетчатки (ПЖК) повышается продукция ЦП-мРНК, кодирующей секреторную форму ЦП, что компенсирует дефицит холо-ЦП в крови [6, 7]. У мышей с нокаутированным геном Atp7b в гепатоцитах наряду с накоплением меди и снижением продукции холо-ЦП (фенотипические проявления мутаций в этом гене, болезнь Вильсона) также наблюдали нарушение липидного обмена [8]. Приведенные факты свидетельствуют о существовании межорганной системы, направленной на поддержание гомеостаза меди в организме, в которой наряду с печенью - центральным органом, контролирующим баланс меди, принимает активное участие и БЖТ. Ранее было показано, что повышение концентрации меди в корме млекопитающих, принадлежащих к различным отрядам (жвачные [9], зайцевые [10], грызуны [11], нежвачные парнокопытные [12]), изменяет липидный метаболизм в различных органах, в том числе и в БЖТ. Возможно, это связано с тем, что медь контролирует липолиз через активацию сАМР-зависимого сигнального пути [13]. Многие стороны систем, обеспечивающих безопасный транспорт и утилизацию токсичных и одновременно жизненно необходимых ионов меди, известны [14, 15]. Общепризнанно, что с нарушением гомеостаза меди связано развитие сердечно-сосудистых, нейроде-генеративных, онкологических заболеваний и метаболического синдрома [5, 16]. Сведения о влиянии липидного обмена на метаболизм меди в БЖТ отсутствуют.
Цель работы - выявление связи между калорийностью корма, статусом меди в крови, метаболизмом меди в печени и БЖТ крыс.
Представленная работа фокусируется на экспрессии гена ЦП в клетках печени и БЖТ у крыс, содержавшихся на низко- или высококалорийном рационе (НКР и ВКР соответственно). Поскольку ПЖК и висцеральная жировая клетчатка (ВЖК) различаются по многим параметрам (анатомическому строению, клеточному составу, паттернами экспрессирующихся генов, способностью утилизировать жирные кислоты, чувствительностью к инсулину, к катехоламинам и др. [5]), исследование проведено на обоих подтипах БЖТ.
Материал и методы
Животные и их содержание. Исследование было одобрено Комитетом по этике ФГБНУ «Институт экспери-
ментальной медицины» (Санкт-Петербург, Россия), который руководствовался приказом Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики», проведено с соблюдением Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой Европейским союзом в 1986 г
Работа выполнена на белых беспородных самцах крыс, приобретенных в питомнике Рапполово (Ленинградская область, Россия). Крысы адаптировались в течение 1 мес в виварии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Их содержали в пластиковых клетках на древесных опилках. В помещении поддерживали 12:12-часовой цикл свет-темнота и 60% влажность. После карантина крысы (средняя масса тела 220±15 г) были разделены на 3 группы (в каждой n=5). Животные контрольной группы получали стандартный рацион - сухой полнорационный экструдированный комбикорм (ООО «Лабораторкорм», Россия) (СК-крысы), в котором содержалось 19% белка, 5% жиров, 4,9% клетчатки, энергетическая ценность 295 ккал/100 г. Крысы 2-й группы получали НКР (НКР-крысы) - комбикорм (ООО «Лабораторкорм», Россия) с калорийностью 195 ккал/100 г и содержанием белка 18,5%, клетчатки -11,76%. Крысы 3-й группы получали высококалорийный рацион (ВКР-крысы) - 420 ккал/100 г, который готовили из пшенной каши и сала в соотношении 100 г сырого свиного сала на 100 г сухой крупы (масса которой после варки увеличивается в 3 раза), в готовом корме содержание сала составляло 25%. Все животные получали воду и корм без ограничения. Учет потребления корма не проводили. Крысы ежесуточно получали 40-50 г корма на 1 животное, который не съедали полностью. Концентрация меди в корме составила соответственно 12,5; 20 и 9 мг/кг, т.е. со всеми рационами животные получали количество меди, соответствующее физиологической норме.
Эксперимент длился 75 дней. В течение этого времени животных взвешивали через каждые 7 дней. Крыс гильотинировали, собирали образцы тканей и крови. Кровь оставляли при комнатной температуре до образования сгустка, затем центрифугированием собирали сыворотку. Все биологические образцы хранили при -80 °С.
Тотальную рибонуклеиновую кислоту (РНК) выделяли с помощью реагента TRIzol в соответствии с рекомендациями производителя (Ambion, США). Степень чистоты препаратов РНК оценивали по отношению экстинкций A26o/A28o, которое не было ниже 1,8. Измерение проводили на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Scientific, США), о нативности препаратов РНК судили по соотношению зон 18S/28S рРНК, выявляемых при электрофорезе в 1,4% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Синтез кДНК на полученных препаратах РНК проводили с помощью обратной транскрипции. Реакционная смесь (25 мм3) содержала 500 нг тотальной РНК, 200 единиц M-MLV обратной транскриптазы, однократный буфер для обратной транскриптазы, эквимолярную смесь 4 dNTP
500
400
300
200
10
0
250 200 150 100 50 0
-1
—п
■о- СК
НКР
ВКР
0 10 20 30 40 50 60 70 80 Время, дни
■ СК
□ НКР
□ ВКР
ПЖК
ВЖК
Рис. 1. Динамика массы тела (А) и изменение массы жировой ткани (Б) у крыс, содержавшихся на различных рационах
* - статистически значимые (р<0,05) отличия по сравнению с показателем СК-крыс. Здесь и на рис. 2, 3: расшифровка аббревиатур дана в тексте.
по 500 мкМ каждого, 0,5 мкМ случайных праймеров и 0,5 мкМ 16-членных олиго-dT в присутствии 25 единиц ингибитора РНКаз (Promega, США). Относительное и абсолютное содержание молекулярных форм ЦП-мРНК измеряли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе CFX96TM (Bio-Rad, США) с использованием неспецифического интеркалирующего красителя EVA Green по прописи производителя («Синтол», РФ). Праймеры для ЦП-мРНК (F: ttg-ctg-ggt-aac-aga-atc-gct; R: gaa-gag-ttg-gag-aca-gtt-tag-tgg-a) и ЦП-мРНК, кодирующей ЦП, связанный с мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП) (F: tac-caa-gga-gta-gcc-agg-aaa-ata-a; R: aga-ata-tagctt-ttg-agg-ggc-aaa-g), были подобраны по программе «Primer-BLAST» (NCBI, США) и изготовлены фирмой «Синтол» (Москва, Россия).
Иммуноблоттинг с антителами к высокоочищенному препарату ЦП крысы [17], определение относительного содержания холо-ЦП в геле окрашиванием ор-тодианизидином, измерение оксидазной активности колориметрическим методом с парафенилендиамином, количественный иммуноэлектрофорез и измерение концентрации меди методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ZEEnit 650P, Analytik Jena, Германия) описаны ранее [18]. Содержание общего холестерина, тригли-
церидов и холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) определяли на анализаторе «Chem Well» (Awareness Technology, США).
Статистический анализ данных проводили с применением пакета программ Statistica 8. Данные представлены как среднее ± стандартное квадратичное отклонение. При сравнении двух групп применяли критерий Стьюдента для неравных дисперсий. Различия считали значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
За динамикой массы тела животных следили в течение всего эксперимента. На рис. 1А показано, что масса тела СК-крыс росла равномерно и к концу эксперимента увеличилась почти в 1,5 раза. Чтобы исключить влияние естественного роста крыс на результаты измерений, все нижеописанные исследования были проведены на образцах печени и БЖТ, взятых у СК-крыс в начале и в конце эксперимента. Поскольку изменений не было найдено (данные не приводятся), в работе в качестве контроля использовали СК-крыс одного возраста с НКР- и ВКР-кры-сами. В течение первых 2 нед масса тела крыс групп НКР и ВКР изменялась одинаково с контрольной группой (см. рис. 1А). После 3-й недели крысы в группе НКР прогрессивно теряли массу тела, а в группе ВКР набирали ее. Через 75 дней НКР-крысы отличались по массе тела от ВКР-крыс почти в 2 раза (р<0,05). Для оценки изменения массы подкожных жировых отложений использовали жир, располагающийся в области бедра, внутренних жировых отложений - жир, локализованный в брюшной полости в области брыжейки. За 100% принимали изменение массу этих участков БЖТ у СК-крыс этого же возраста. Данные, приведенные на рис. 1Б, показывают, что масса подкожного жира у НКР-крыс была почти в 3 раза ниже, а у ВКР-крыс в 1,5 раза выше, чем у животных на СК. Масса висцерального жира у НКР-крыс была в 2 раза ниже, а у ВКР-крыс в 2 раза выше, чем у СК-крыс. Данные позволяют считать, что диета с высоким содержанием сала и углеводов индуцировала рост БЖТ.
Концентрация общего холестерина и холестерина, связанного с ЛПВП, в сыворотке крови крыс всех групп была примерно одинаковой (см. таблицу). У НКР-крыс повышалось содержание триглицеридов по сравнению с крысами, находившимися на стандартном или высококалорийном рационе. В обеих экспериментальных группах, но не в СК-группе наблюдали широкие индивидуальные колебания значений регистрируемых параметров.
В качестве показателей статуса меди в сыворотке крови использовали атомную концентрацию меди, а также содержание оксидазного и иммунореактивного ЦП. Данные, приведенные на рис. 2А, показывают, что концентрация меди в сыворотке крыс всех групп была одинаковой. У ВКР-крыс концентрация оксидазного ЦП, по данным колориметрических измерений с парафе-нилендиамином (рис. 2Б) и окрашивания гелей орто-дианизидином (данные не приводятся), была снижена
А
Б
*
Биохимические показатели экспериментальных животных
Показатель Группа животных
СК НКР ВКР
Концентрация меди в органах, мкг/г:
- печень 3,74±0,42 3,82±0,47 3,40±0,25
- ПЖК 0,37±0,05 0,70±0,09 (а) 0,48±0,10
- ВЖК 0,34±0,05 0,92±0,35 (а) 0,31 ±0,18
- почки 5,53±1,34 5,16±1,06 5,63±1,22
- легкие 1,15±0,14 1,18±0,05 1,06±0,07
- сердце 3,87±0,11 3,15±0,79 4,17±0,14
- селезенка 0,91 ±0,03 0,83±0,19 0,93±0,02
- мышцы 0,52±0,04 0,49±0,07 0,46±0,03
- семенники 1,10±0,20 0,94±0,18 1,22±0,17
Профиль липидов в сыворотке крови:
- холестерин, мг/100 см3 61,6±6,02 70,4±14,2 65,8±12,1
- триглицериды, мг/100 см3 124,4±15,6 132,4±8,5 (б) 95,8±8,4
- холестерин ЛПВП, мг/100 см3 27,8±2,1 30,2±3,3 27,9±2,4
- холестерин ЛПВП, % 45,3±2,7 43,6±4,6 43,3±6,8
- холестерин, не связанный с ЛПВП, мг/100 см3 35,0±5,2 40,4±10,9 38±11,4
- холестерин, не связанный с ЛПВП, % 54,7±6,1 56,4±5,9 56,7±4,7
Концентрация ЦП-мРНК/актин-мРНК в печени, отн. ед. 1,1±0,03 0,8±0,02 0,9±0,02
П р и м е ч а н и е. Статистически значимые (р<0,05) отличия по сравнению с показателем: а - СК-крыс; б - ВКР-крыс; расшифровка аббревиатур дана в тексте.
примерно на 30%. Содержание полипептидов ЦП, определенное методом ракетного иммуноэлектрофореза, соответствовало уровню содержания энзиматически активного ЦП (рис. 2В). Данные полностью совпадают с результатами определения относительного содержания иммунореактивного ЦП методом иммуноблоттинга (данные не приводятся). Полученные результаты позволяют заключить, что показатели статуса меди, которые в основном определяются метаболизмом меди в печени, при ВКР снижаются. При этом наблюдается несоответствие между снижением уровня ЦП и не изменяющейся концентрацией меди в сыворотке крови. Возможно, у ВКР-крыс молекула ЦП содержит больше лабильных атомов меди или в крови увеличивается содержание нецерулоплазми-новой меди. Однако, чтобы понять природу этого противоречия, необходимы дополнительные исследования.
Концентрация меди у животных всех групп была измерена в печени, ПЖК, ВЖК, а также в почках, селезенке, сердце, легких, мышцах и семенниках. В печени по сравнению с СК-крысами концентрация меди у крыс обеих групп не менялась. У НКР-крыс концентрация меди повышалась в обоих подтипах БЖТ в большей степени, чем снижалась масса жировой ткани. В то же время у ВКР-крыс концентрация меди в БЖТ не менялась по сравнению с СК-крысами. В других органах, взятых в исследование, концентрация меди у НКР- и ВКР-крыс
по сравнению СК-крысами не менялась (см. таблицу). ->
Рис. 2. Показатели статуса меди в сыворотке крови крыс
А - концентрация меди, мкг/л; Б - концентрация церулоплаз-мина, измеренная с парафенилендиамином; В - содержание иммунореактивного церулоплазмина, определенного методом ракетного иммуноэлектрофореза. За 100% принято содержание церулоплазмина у крыс, получавших сухой полнорационный экструдированный комбикорм. На врезке: протоколы для 2 животных из каждой группы; * - статистическая значимость различий (р<0,05).
А 1500 1200 •5 900 5 600 300 0
Б 1 0,8 ^ 0,6 ^ 0,4 0,2 0
В 200 150
^ 100
и
50 0
■ СК
□ НКР
□ ВКР
■ СК
□ НКР
□ ВКР
ск нкр вкр щ ск
1—^—1 Т □ НКР
ШВКР
А 0,02 0,15
ci
Œ>
È 0,1
О
HZ
0,05 0
Б 0,004 0,003
ci
Œ> :л
° 0,002 i=
s:
ê 0,001 0
■ СК
□ НКР
□ ВКР
ПЖК
ВЖК
LL
■ СК
□ НКР
□ ВКР
ПЖК
ВЖК
Рис. 3. Экспрессия гена церулоплазмина в клетках белой жировой ткани
А - концентрация ЦП-мРНК, кодирующей растворимую форму церулоплазмина в клетках подкожной и висцеральной клетчатки; Б - концентрация мРНК ГФИ-ЦП в клетках подкожной и висцеральной жировой клетчатки. Для расчета относительного содержания молекулярных форм ЦП-мРНК использовали относительное содержание ЦП-мРНК в печени крыс, получавших сухой полнорационный экструдированный комбикорм;
* - статистически значимые (р<0,05) отличия по сравнению с показателем СК-крыс.
Повышение концентрации меди в клетках БЖТ при изменении калорийности корма и снижение уровня ЦП в крови при ВКР стали основанием для изучения экспрессии гена ЦП в клетках БЖТ. Общая транскрипционная активность, если судить по концентрации тотальной РНК, в печени примерно в 8 раз выше, чем в клетках ПЖК (2,5±0,4 мкг РНК/мг ткани в печени ^ 0,31± 0,08 мкг РНК/мг ткани в ПЖК), а в ПЖК примерно в 3 раза выше, чем в ВЖК (0,31±0,08 мкг РНК/мг ткани в ПЖК го 0,09±0,02 мкг РНК/мг ткани в ВЖК). Измерение в печени концентрации зрелых транскриптов гена ЦП, кодирующих его секреторную форму, показало, что у крыс, содержавшихся как на НКР, так и на ВКР, по сравнению с СК-крысами экспрессия гена ЦП на уровне транскрипции не менялась (см. таблицу). Это может означать, что снижение концентрации полипептидов ЦП в крови у ВКР-крыс (рис. 2) происходит не за счет снижения скорости транскрипции гена ЦП в печени. Возможно, что в клетках печени ВКР-крыс подавлена трансляция ЦП-мРНК. Это предположение согласуется с существованием системы посттранскрипционного подавления активности гена ЦП с помощью управляю-
щих сигналов в З'-нетранслируемой области ЦП-мРНК [19, 20]. В клетках многих тканей, в том числе и в БЖТ, но не в гепатоцитах из первичного продукта транскрипции гена ЦП формируются 2 сплайс-формы ЦП-мРНК: мРНК, кодирующая секреторный ЦП, и ЦП-мРНК, кодирующая синтез ЦП, связанного с поверхностью плазматической мембраны через ГФИ-ЦП [6, 21]. У крыс СК-группы содержание ЦП-мРНК для секреторной формы ЦП в клетках ПЖК почти в 20 раз ниже, чем в печени, а в клетках ВЖК в 3 раза ниже, чем в ПЖК (рис. ЗА, см. таблицу). Уровень секреторной формы ЦП-мРНК повышался в клетках ПЖК у НКР-крыс по сравнению с СК-кры-сами в 5 раз, а в клетках ВЖК-животных, содержащихся на ВКР, концентрация ЦП-мРНК была примерно в 3 раза выше, чем у СК-крыс (см. рис. ЗА). Концентрация ГФИ-ЦП мРНК в ПЖК достоверно повышалась при содержании животных на НКР (рис. ЗБ). В ВЖК крыс, содержавшихся на НКР, сплайс-форма ЦП-мРНК ГФИ-ЦП практически не формировалась, но ее уровень повышался у ВКР-крыс (см. рис. ЗБ).
Заключение
В целом представленные данные позволяют заключить, что при ВКР показатели статуса меди в крови снижаются за счет пропорционального уменьшения концентрации полипептидов холо-ЦП, которое, возможно, происходит за счет снижения скорости трансляции ЦП-мРНК, содержащей в З'-нетранслируемой области регуляторные последовательности, участвующие в посттранскрипционном подавлении активности гена ЦП [19, 20].
ПЖК по сравнению с ВЖК демонстрирует более высокую транскрипционную активность, в частности в отношении экспрессии гена ЦП, центрального белка внеклеточного круговорота меди, металлирование которого зависит от импорта меди в клетку, ее переноса в люмен аппарата Гольджи и корректного включения в апо-ЦП [14, 22].
Повышение концентрации меди в клетках ПЖК и ВЖК при обоих рационах согласуется с увеличением уровня экспрессии гена ЦП. Однако профиль формирования сплайс-форм ЦП-мРНК отличается между ПЖК и ВЖК и зависит от калорийности корма в обоих типах БЖТ.
Представленные данные впервые устанавливают связь между метаболизмом меди в БЖТ и калорийностью корма на фоне сбалансированного содержания меди в рационе. Они подтверждают участие меди в липид-ном метаболизме; результаты этих исследований могут помочь в понимании связи между развитием метаболического синдрома и нарушением гомеодинамики меди в организме млекопитающих.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 18-015-00481 и 16-34-60219) и Президента РФ (грант МК 2718.2018.4).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*
Сведения об авторах
Ильичева Екатерина Юрьевна (Ilyechova Ekaterina Yu.) - кандидат биологических наук, сотрудник лаборатории метаболизма микроэлементов ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики», старший научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», доцент кафедры биофизики ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: ikaterina2705@yandex https://orcid.org/0000-0002-5623-2156
Канаш Людмила Александровна (Kanash Lyudmila A.) - магистр ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: [email protected]
Тимирова Залия Риятовна (TimirovaZaliya R.) - магистр ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: [email protected]
Цымбаленко Надежда Васильевна (Tsymbalenko Nadezhda V.) - доктор биологических наук, профессор, ведущий
научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (Санкт-
Петербург, Россия)
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-0670-5306
Орлов Юрий Александрович (Orlov Yurii A.) - аспирант лаборатории метаболизма микроэлементов ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: [email protected]
Клюева Наталья Николаевна (Klyuyeva Nataliya N.) - старший научный сотрудник отдела биохимии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: [email protected]
Скоморохова Екатерина Александровна (Skomorokhova Ekaterina A.) - аспирант лаборатории метаболизма микроэлементов ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6018-2190
Денисенко Александр Дорофеевич (Denisenko Aleksandr D.) - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела биохимии «Институт экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1613-0654
Пучкова Людмила Валентиновна (Puchkova Liudmila V.) - доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории метаболизма микроэлементов ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики», ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», профессор кафедры биофизики ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого» (Санкт-Петербург, Россия) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0958-2812
Литература
1. Kwok K.H., Lam K.S., Xu A. Heterogeneity ofwhite adipose tissue: molecular basis and clinical implications // Exp. Mol. Med. 2016. Vol. 48. P. e215.
2. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceru-loplasmin: a 'moonlighting' protein // Cell. Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59. N9. P. 1413-1427.
3. Bernevic B., El-Khatib A.H., Jakubowski N., Weller M.G. Online immunocapture ICP-MS for the determination of the metalloprotein ceruloplasmin in human serum // BMC Res. Notes. 2018. Vol. 11, N 1. P. 213-217.
4. Arner E., Forrest A.R., Ehrlund A. et al. Ceruloplasmin is a novel adipokine which is overexpressed in adipose tissue of obese subjects and in obesity-associated cancer cells // PLoS One. 2014. Vol. 9, N 3. Article ID e80274.
5. Gómez-Hernández A., Beneit N., Díaz-Castroverde S., Escribano Ó. Differential role of adipose tissues in obesity and related metabolic and vascular complications // Int. J. Endocrinol. 2016. Vol. 2016. Article ID 1216783.
6. Ilyechova E.Y., Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. The role of subcutaneous adipose tissue in supporting the copper balance in rats with a chronic deficiency in holo-ceruloplasmin // PLoS One. 2017. Vol. 12, N 4. Aricle ID e0175214.
7. Ilyechova E.Y., Saveliev A.N., Skvortsov A.N., Babich P.S. et al. The effects of silver ions on copper metabolism in rats // Metal-lomics. 2014. Vol. 6, N 10. P. 1970-1987.
8. Muchenditsi A. Yang H., Hamilton J.P. et al. Targeted inactivation of copper transporter Atp7b in hepatocytes causes liver steatosis and obesity in mice // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2017. Vol. 313, N 1. P. G39-G49.
9. Engle T.E. Copper and lipid metabolism in beef cattle: a review // J. Anim. Sci. 2011. Vol. 89, N 2. P. 591-596.
10. Lei L., Xiaoyi S., Fuchang L. Effect of dietary copper addition on lipid metabolism in rabbits // Food Nutr. Res. 2017. Vol. 61, N 1. Article ID 1348866.
11. Tinkov A.A., Polyakova V.S., Nikonorov A.A. Chronic administration of iron and copper potentiates adipogenic effect of high
fat diet in Wistar rats // Biometals. 2013. Vol. 26, N 3. P. 447463.
12. Amer M.A., Elliot J.I. Influence of supplemental dietary copper 18. and vitamine E on the oxidative stability of porcine depot fat //
J. Anim. Sci. 1973. Vol. 37, N 1 P. 87-90.
13. Krishnamoorthy L., Cotruvo J.A. Jr, Chan J. et al. Copper regu- 19. lates cyclic-AMP-dependent lipolysis // Nat. Chem. Biol. 2016.
Vol. 12, N 4. P. 586-592.
14. Lutsenko S. Copper trafficking to the secretory pathway // Metal-lomics. 2016. Vol. 8, N 9. P. 840-852. 20.
15. Мазо В.К., Ширина Л.И. Медь в питании человека: абсорбция и биодоступность // Вопр. питания. 2005. Т. 74, № 2.
С. 52-59. 21.
16. Kozlowski H., Kolkowska P., Watly J. et al. General aspects of metal toxicity // Curr. Med. Chem. 2014. Vol. 21, N 33. P. 37213740.
17. Соколов А.В., Костевич В.А., Романико Д.Н. и др. Двух- 22. стадийный метод получения церулоплазмина на основе
его взаимодействия с неомицином // Биохимия. 2012. Т. 77, № 6. С. 775-784.
Zatulovskaia Y.A., Ilyechova E.Y., Puchkova L.V. The features of copper metabolism in the rat liver during development // PLoS One. 2015. Vol. 10, N 10. Article ID e0140797. Tapryal N., Mukhopadhyay C., Das D. et al. Reactive oxygen species regulate ceruloplasmin by a novel mRNA decay mechanism involving its 3'-untranslated region: implications in neurodegenerative diseases // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284, N 3. P. 1873-1883. Mazumder B., Sampath P., Fox P.L. Translational control of ceruloplasmin gene expression: beyond the IRE // Biol. Res. 2006. Vol. 39, N 1. P. 59-66.
Mostad E.J., Prohaska J.R. Glycosylphosphatidylinositol-linked ceruloplasmin is expressed in multiple rodent organs and is lower following dietary copper deficiency // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2011. Vol. 236, N 3. P. 298-308.
Пучкова Л.В. Пищевая роль церулоплазмина молока // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 4. C. 4-17.
References
10.
11.
Kwok K.H., Lam K.S., Xu A. Heterogeneity of white adipose tissue: 12. molecular basis and clinical implications. Exp Mol Med. 2016; 48: e215. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceruloplasmin: a 'moonlighting' protein. Cell Mol Life Sci. 2002; 59 (9): 13. 1413-27.
Bernevic B., El-Khatib A.H., Jakubowski N., Weller M.G. Online immunocapture ICP-MS for the determination of the metallopro- 14. tein ceruloplasmin in human serum. BMC Res Notes. 2018; 11 (1): 213-7. 15.
Arner E., Forrest A.R., Ehrlund A., et al. Ceruloplasmin is a novel adipokine which is overexpressed in adipose tissue of obese subjects and in obesity-associated cancer cells. PLoS One. 2014; 9 (3): e80274. 16. Gómez-HernándezA., Beneit N., Díaz-CastroverdeS., Escribano Ó. Differential role of adipose tissues in obesity and related meta- 17. bolic and vascular complications. Int J Endocrinol. 2016; 2016: 1216783.
Ilyechova E.Y., Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. The role of subcutaneous adipose tissue in supporting the copper balance in rats 18. with a chronic deficiency in holo-ceruloplasmin. PLoS One. 2017; 12 (4): e0175214.
Ilyechova E.Y., Saveliev A.N., Skvortsov A.N., Babich P.S., et al. 19. The effects of silver ions on copper metabolism in rats. Metallomics. 2014; 6 (10): 1970-87.
Muchenditsi A. Yang H., Hamilton J.P., et al. Targeted inactivation of copper transporter Atp7b in hepatocytes causes liver steatosis 20. and obesity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2017; 313 (1): G39-49.
Engle T.E. Copper and lipid metabolism in beef cattle: a review. 21. J Anim Sci. 2011; 89 (2): 591-6.
Lei L., Xiaoyi S., Fuchang L. Effect of dietary copper addition on lipid metabolism in rabbits. Food Nutr Res. 2017; 61 (1): 1348866. Tinkov A.A., Polyakova V.S., Nikonorov A.A. Chronic administra- 22. tion of iron and copper potentiates adipogenic effect of high fat diet in Wistar rats. Biometals. 2013; 26 (3): 447-63.
Amer M.A., Elliot J.I. Influence of supplemental dietary copper and vitamine E on the oxidative stability of porcine depot fat. J Anim Sci. 1973; 37 (1): 87-90.
Krishnamoorthy L., Cotruvo J.A. Jr, Chan J., et al. Copper regulates cyclic-AMP-dependent lipolysis. Nat Chem Biol. 2016; 12 (4): 586-92.
Lutsenko S. Copper trafficking to the secretory pathway. Metallomics. 2016; 8 (9): 840-52.
Mazo V.K., Shirina L.I. Copper in nutrition man: absorption and bioavailability. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2005; 74 (2): 52-9. (in Russian)
Kozlowski H., Kolkowska P., Watly J., et al. General aspects of metal toxicity. Curr Med Chem. 2014; 21 (33): 3721-40. Sokolov A.V., Kostevich V.A., Romanico D.N., et al. Two-stage method for purification of ceruloplasmin based on its interaction with neomycin. Biokhimiya [Biochemistry]. 2012; 77 (6): 631-8. (in Russian)
Zatulovskaia Y.A., Ilyechova E.Y., Puchkova L.V. The features of copper metabolism in the rat liver during development. PLoS One. 2015; 10 (10): e0140797.
Tapryal N., Mukhopadhyay C., Das D., et al. Reactive oxygen species regulate ceruloplasmin by a novel mRNA decay mechanism involving its 3'-untranslated region: implications in neurodegenerative diseases. J Biol Chem. 2009; 284 (3): 1873-83. Mazumder B., Sampath P., Fox P.L. Translational control of ceruloplasmin gene expression: beyond the IRE. Biol Res. 2006; 39 (1): 59-66.
Mostad E.J., Prohaska J.R. Glycosylphosphatidylinositol-linked ceruloplasmin is expressed in multiple rodent organs and is lower following dietary copper deficiency. Exp Biol Med. (Maywood). 2011; 236 (3): 298-308.
Puchkova L.V. The nutrition role of milk ceruloplasmin. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (4): 4-17. (in Russian)
1
2.
4.
6.
7
8
9
