CC BY
1169
Для корреспонденции
Мжельская Кристина Владимировна - лаборант-исследователь лаборатории энзимологии питания ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Россия, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-65 E-mail: kristik13@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-0723-5860
Мжельская К.В.1, Трусов Н.В.1, Апрятин С.А.1, Сото С.Х.1, Гмошинский И.В.1, Тутельян В.А.1, 2
Влияние кверцетина на экспрессию генов ферментов углеводного и липидного обмена в печени у крыс с генетически обусловленным и алиментарным ожирением
1 ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва, Россия
2 ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Россия
1 Federal Research Centre for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow, Russia
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
Кверцетин (Q; 3,3',4',5,7-пентагидроксифлавон) рассматривается как перспективный компонент специализированных диетических лечебных продуктов для коррекции обменных нарушений при ожирении и метаболическом синдроме. Вместе с тем результаты оценки клинической эффективности Q неоднозначны, а механизмы его влияния на липидный и углеводно-энергетический обмен недостаточно изучены.
Цель работы - изучение влияния Q на экспрессию ключевых генов ферментов гликолиза и липогенеза у крыс линии Zucker-Leprfa (Z), характеризуемых наследственным ожирением, в сравнении с крысами «дикого типа» Wistar (W). Материал и методы. 24 самца крыс Z и 32 самца крыс Wвозрастом 8-10 нед были разделены на 4 группы равной численности. В течение 62 дней животные первых групп (контроль) получали сбалансированный рацион по AIN93M, вторых - такой же рацион с добавкой Q в дозе 50 мг на 1 кг массы тела, третьих групп - высокоуглеводный, высокожировой рацион (ВУВЖР) c содержанием 30% по массе жира и с заменой питьевой воды на 20% раствор фруктозы, четвертых групп - ВУВЖР и добавку Q. После выведения животных из эксперимента в печени определяли экспрессию генов углеводного и липидного обмена Khk, Gck,
Для цитирования: Мжельская КВ., Трусов Н.В., Апрятин С.А., Сото С.Х., Гмошинский И.В., Тутельян В.А. Влияние кверцетина на экспрессию генов ферментов углеводного и липидного обмена в печени у крыс с генетически обусловленным и алиментарным ожирением // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 2. С. 6-16. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10012. Статья поступила в редакцию 06.12.2018. Принята в печать 13.03.2019.
For citation: Mzhelskaya K.V., Trusov N.V., Apryatin S.A., Soto C.J., Gmoshinski I.V., Tutelyan V.A. Effect of quercetin on the expression of the carbohydrate and lipid metabolism genes in the liver of rats with genetic and alimentary obesity. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (2): 6-16. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10012. (in Russian) Received 06.12.2018. Accepted 13.03.2019.
Effect of quercetin on the expression of the carbohydrate and lipid metabolism genes in the liver of rats with genetic and alimentary obesity
Mzhelskaya K.V.1, Trusov N.V.1, Apryatin S.A.1, Soto C.J.1, Gmoshinski I.V.1, Tutelyan V.A.1, 2
Pklr, Acaca, Fasn, Scd, Srebfl, Mlxipl, Ppara, Pparg, а также референсных генов Actb и Gapdh методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени. В плазме крови определяли содержание тригли-церидов, холестерина общего и в составе липопротеинов высокой плотности, липолитическую активность, уровень иммунореактивного лептина. Результаты и обсуждение. При сравнении двух линий животных показан статистически значимо более высокий уровень экспрессии Ppara, Pparg, Mlxipl, Acaca, Fasn, Scd у крыс Z в сравнении с W, что согласуется с развитием у первых дислипидемии и повышенными уровнями лептина при потреблении рационов обоих использованных типов. Добавка Q вызывала у крыс W снижение экспрессии Scd, Mlxipl, Khk и Gck, более выраженное в условиях потребления ВУВЖР, тогда как у крыс Z подобные эффекты отсутствовали либо имели противоположную направленность. Помимо этого, у крыс Z потребление Q приводило к усилению экспрессии Pklr, не наблюдавшемуся у крыс W.
Заключение. Модулирующий эффект Q на экспрессию ключевых генов липид-ного и углеводного обмена существенно различается у крыс W «дикого типа» и мутантных крыс Z с наследственным ожирением, причем это различие, по-видимому, потенцируется потреблением избытка жира и фруктозы. Ключевые слова: кверцетин, крысы Zucker, гликолиз, липогенез, транскрипция, ожирение
Quercetin (Q; 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone) is considered as a promising component of specialized products for the correction of metabolic disorders in obesity and metabolic syndrome. At the same time, the results of evaluating the clinical efficacy of Q are ambiguous, and the mechanisms of its influence on lipid and carbohydrate-energy metabolism are not well understood.
The aim of the work was to study the effect of quercetin (Q 3,3',4',5,7-pentahydroxyfla-vone) on the expression of key glycolysis and lipogenesis enzymes' genes in Zucker-Leprfa (Z) rats characterized by hereditary obesity, compared to «wild-type» Wistar (W) rats. Material and methods. 24 male Z rats and 32 male W rats aged 8-10 weeks were used. Animals of each line were divided into 4 groups of equal numbers. For 62 days the animals of the first groups (controls) received a balanced diet according to AIN93M, the seconds -the same diet with Q added in a dose of 50 mg/kg body weight. Animals of the third groups received a high-fat, high-carbohydrate diet (HFCD) with fat 30% by weight and with the replacement of drinking water with a 20% solution of fructose, the fourths groups - the same diet and supplementation with Q. After removing animals from the experiment, expression levels of liver carbohydrate and lipid metabolism genes Khk, Gck, Pklr, Acaca, Fasn, Scd, Srebfl, Mlxipl, Ppara and Pparg were determined by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) with reverse transcription using Actb and Gapdh as reference genes. The levels of triglycerides, total and HDL cholesterol, lipolytic activity and immu-noreactive leptin were determined in plasma.
Results and discussion. When comparing two animal lines, a significantly higher level of expression of Ppara, Pparg, Mlxipl, Acaca, Fasn, Scd was shown in Z rats compared to W rats, which is consistent with the development of dyslipidemia in the first ones and elevated levels of leptin under both types of diets used. The addition of Q caused in W rats a decrease in the expression of Scd, Mlxipl, Khk and Gck, more pronounced on the background of HFCD whereas in Z rats there were no similar effects, or they had the opposite direction. In addition, in Z rats, consumption of Q led to increased expression of Pklr, which was not observed in W rats.
Conclusion. The modulating effect of Q on the expression of key genes of lipid and carbohydrate metabolism enzymes significantly differs in wild-type W rats and mutant Z rats with hereditary obesity, and this difference appears to be potentiated by the consumption of excess fat and fructose.
Keywords: quercetin, Zucker-Leprfa rats, glycolysis, lipogenesis, transcription, obesity
Изучение механизмов влияния нутриентов и содержащихся в пище биологически активных веществ (БАВ) на определяемые генотипом физиологические реакции организма является предметом исследования нутригеномики - быстро развивающейся отрасли современной науки о питании [1, 2]. В настоящее время получен большой объем эмпирических данных о
влиянии БАВ полифенольной природы, содержащихся в растительной пищевой продукции, на накопление массы абдоминального жира, артериальное давление, гликемию и чувствительность к инсулину, липидный профиль плазмы крови в клинике у пациентов c ожирением, метаболическим синдромом и сахарным диабетом 2 типа [3], а также на моделях in vivo у эксперименталь-
ных животных, получающих гиперкалорийные рационы [4]. В частности, кверцетин (Q; 3,3',4',5,7-пентагидрок-сифлавон), один из основных флавоноидов красного лука, яблок, многих ягод, цитрусовых, чая и красного вина, в дозах, характерных для его содержания в пищевых продуктах, может облегчать симптомы метаболического синдрома, вызванного потреблением избытка легкоусвояемых углеводов [5-7]. Однако результаты оценки клинической эффективности специализированных продуктов, обогащенных Q, при различных алиментарно-зависимых заболеваниях неоднозначны, а интерпретация этих фактов невозможна в отсутствие данных о механизмах воздействия этого вещества на энергетический гомеостаз организма, которые могут быть получены на адекватных in vivo моделях у лабораторных животных.
Одной из наиболее популярных моделей генетически детерминированного ожирения у грызунов является крыса Zucker-Leprfa (Z), характеризуемая рецессивной мутацией fa в гене Lepr, кодирующем рецептор лептина. У этих крыс лептин, синтезируемый клетками жировой ткани, не может оказать своего анорексигенного действия на нейроны гипоталамуса, вследствие чего данные животные характеризуются гиперфагией, спонтанно развивающимся ожирением по абдоминальному типу, гиперлипидемией и резко повышенными уровнями циркулирующего лептина [8, 9].
Цель работы - изучение влияния потребления Q на экспрессию ключевых генов ферментов гликолиза и липогенеза у крыс линии Z в сравнении с крысами Wistar (W) с ненарушенной рецепцией лептина при потреблении сбалансированного и избыточного по квоте жиров и простых углеводов (фруктоза) рациона.
Материал и методы
Исследования проводили на 24 самцах крыс Z в возрасте 8-10 нед, полученных из питомника «Charles River» (Италия), и 32 крысах-самцах W того же возраста, полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» (Россия). Работу с животными выполняли в соответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Дизайн эксперимента был одобрен Комитетом по этике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (протокол № 4 от 20.04.2017).
Животные были разделены на 8 групп равной численности (n=8 для крыс W, группы с 1-й по 4-ю и n=6 для крыс Z, группы с 5-й по 8-ю). В течение 62 дней животные 1-й и 5-й групп (контроль) получали контрольный рацион по AIN93M [10], 2-й и 6-й групп - контрольный рацион с добавкой Q в дозе 50 мг на 1 кг массы тела, 3-й и 7-й групп - высокоуглеводный, высокожировой рацион c повышенным содержанием жира (30% по массе сухих веществ рациона) и с заменой питьевой воды на 20% раствор фруктозы (ВУВЖР), 4-й и 8-й
групп - ВУВЖР и добавку Q. Рацион и питьевую жидкость представляли животным в режиме неограниченного свободного доступа. Крыс содержали по 2 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре воздуха 22±1 °С.
Выведение животных из эксперимента осуществляли на 63-е сутки путем декапитации под эфирной анестезией. Печень извлекали после лапаротомии стерильными хирургическими инструментами, взвешивали с точностью ±0,01 г и хранили до исследования при температуре -80 °C. Кровь собирали в пробирки с антикоагулянтом 1,0% раствором гепарина в 0,15 М NaCl (1:10 по объему), плазму отделяли центрифугированием и проводили исследование показателей липидного профиля [общий холестерин, холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), триглицериды, общая липо-литическая активность] на биохимическом анализаторе «Konelab 20i» (Konelab, Финляндия) по стандартным методикам. Концентрацию лептина в плазме крови определяли методом мультиплексного иммуноанализа на приборе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) с использованием наборов реактивов Plex Reagent Kit, 1x96-well, Pro-Rat 33-Plex Standarts и Rat Diabetes Leptin SET (Bio-Rad Laboratories, Inc., США).
В печени определяли экспрессию генов кетогексо-киназы (Khk), глюкокиназы (Gck), пируваткиназы (Pklr), ацетил-КоА-карбоксилазы (Acaca), синтазы жирных кислот (Fasn), стеарил-КоА-десатуразы (Scd) и их транскрипционных регуляторов SREBP-1c (Srebf1), ChREBP (Mlxipl), PPARa (Ppara), PPARy (Pparg), актина (Actb) и глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (Gapdh) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ) в режиме реального времени. Выделение общей РНК из ткани печени проводили с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», РФ), а синтез комплементарной ДНК (кДНК) - с использованием набора MMLV RT kit («Евроген», РФ) согласно протоколу производителя. Для ПЦР-ОТ в режиме реального времени применяли праймеры и зонды производства
000 «ДНК-Синтез» (Россия). Реакционная смесь для ПЦР общим объемом 25 мкм3 содержала 1 мкм3 кДНК, 2,5 мкм3 10-кратного буфера для TaqPol (c 2 мМ MgCl2),
1 мкм3 (F+R) праймеров (10 мкМ), 0,5 мкм3 зонда FAM (10 мкМ), 0,5 мкм3 смеси dNTPs (10 мМ), 0,5 мкм3 TaqPol (5 ед/мл), 19 мкм3 воды без нуклеаз (Thermo Scientific, США). Амплификацию проводили на приборе CFX 96 (Bio-Rad, США). Реакцию ПЦР для всех изучаемых генов проводили по следующей схеме: активация Taq ДНК-по-лимеразы при 95 °С в течение 3 мин; 45 циклов, каждый из которых состоял из денатурации при 95 °С в течение 15 с и отжига праймеров (60 °С, 1 мин); измерение флуоресценции в канале FAM. Экспрессию генов оценивали по значению порогового цикла (Ct - cycle threshold) и нормализовали относительно условно конститутивных генов сравнения Actb и Gapdh методом 2-AACt [11].
Образцы ткани печени для морфологического исследования фиксировали в 3,7% растворе формальдегида в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,00±0,05, де-
Pparg 2,5 -,
Ppara 14 12 -10 -8 -6 -4 -2 -0
Г
л
Wistar
Zucker
Wistar
Zucker
Acaca
4,5 1
4,0 -
Fasn 7,0 и 6,0 -
Wistar
Zucker
Wistar
Zucker
Srebfl
1,6 1 1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0,0
r
Л Г
Л
Л
Wistar
Zucker
Scd 3,5 и
r
LxQ
Wistar
Л
Zucker
□ Контроль □ Контроль + Q □ ВУВЖР ■ ВУВЖР + Q Рис. 1. Относительная экспрессия генов липогенеза у крыс Wistar и Zucker-LEPRfa: А - Pparg; Б - Ppara; В - Acaca; Г - Fasn; Д - Srebfl; Е - Scd
По оси абсцисс - линии животных; по оси ординат - экспрессия по отношению к Actb и Gapdh, относительные единицы. Статистически значимые различия (p<0,05): * - от показателя контрольной группы; # - от показателя группы высокоуглеводный, высокожировой рацион; ° - от показателя группы контроль + кверцетин. Скобки - факторный анализ для охватываемого диапазона, ANOVA, p<0,05 по фактору: рацион (R); кверцетин (Q); линия (L). Здесь и на рис. 2, 3: расшифровка аббревиатур дана в тексте.
гидратировали в спиртах восходящей концентрации, пропитывали ксилолом, заливали гомогенизированной парафиновой средой Н1в1от1х на автоматизированной станции заливки блоков. Парафиновые срезы толщиной
3-4 мкм изготавливали на микротоме «Microm HM355s» (Leica, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике и исследовали в микроскопе «AxioImager Zl» (Zeiss, Германия) при увеличении х400.
А
Б
*
В
Г
Д
Е
L
Статистическая обработка результатов включала верные при уровне значимости p<0,05. Расчеты про-
расчет выборочного среднего (M), выборочного стан- водили с использованием пакета программ SPSS 20.0 дартного отклонения (S) и стандартной ошибки (m). (IBM, США). Гипотезу о равенстве выборочных средних в группах проверяли с использованием двустороннего t-теста
Стьюдента с поправкой Levine на неравенство диспер- Результаты сий; гипотезу о совпадении распределений величин
в группах - с помощью двустороннего рангового U-теста Как следует из данных рис. 1А, уровень мРНК гена Манна-Уитни. Факторный анализ выполняли согласно Pparg, кодирующего рецептор у, связанный с пер-
критерию 3-way ANOVA. Различия принимали за досто- оксисомным пролифератором (PPARy), был понижен
Mlxipl (ChREBP)
5,0 и
4,5 -4,0 -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 -0,0 -
Г
г
LxRxQ
* * *
Л
Gck 2,50 -,
Wistar
Zucker
Wistar
Zucker
Khk
1,4 1 1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0,0
Pklr
Wistar
Zucker
Wistar
Zucker
□ Контроль □ Контроль + Q
■ ВУВЖР
ВУВЖР + Q
Рис. 2. Относительная экспрессия генов углеводного обмена у крыс Wistar и Zucker-LEPRfa: А - Mlxipl (ChREBPj; Б - Gck; В - Khk; Г - Pklr
По оси абсцисс - линии животных; ось ординат - экспрессия по отношению к Gapdh и Actb, относительные единицы. Статистически значимые различия (p<0,05): * - от показателя контрольной группы; # - от показателя группы высокоуглеводный, высокожировой рацион; п - от показателя группы контроль + кверцетин. Скобки - факторный анализ для охватываемого диапазона, ANOVA, p<0,05 по фактору: рацион (R); кверцетин (Q); линия (L)
А
Б
L
*
В
Г
Показатели липидного профиля плазмы крови крыс, M±m
Группа животных п Концентрация, ммоль/дм3 Активность липазы, МЕ/см3
триглицериды холестерин холестерин ЛПВП холестерин ЛПНП (расчет) лептин, пг/см3
1. W+К 8 1,23±0,25 2,08±0,133 0,62±0,03 0,90±0,143 1,05±0,02 7,8±3,83
2. W+K+Q 8 1,06±0,13 1,78±0,064 0,58±0,02 0,71 ±0,074 0,79±0,084 0,0±0,04
3. W+ВУВЖР 8 1,93±0,48 1,62±0,111 0,53±0,03 0,36±0,141 1,86±0,45 47,1±16,21
4. W+ ВУВЖР+Q 8 1,50±0,26 1,45±0,062 0,50±0,03 0,30±0,072 1,29±0,152 47,9±12,12
5. Z+K 6 8,19±1,457 8,78±0,40 1,85±0,08 3,21±0,817 20,7±4,37,8 4,4±1,4
6. Z+K+Q 6 6,98±1,868 7,39±0,36 1,74±0,05 2,02±0,828 16,7±0,088 0,8±0,8
7. Z+ВУВЖР 6 25,0±4,55 10,3±1,1 1,87±0,07 0,20±0,205 92,5±45,25 0,0±0,0
8. Z+ВУВЖР+Q 6 34,2±6,36 9,65±1,18 1,61 ±0,09 0,00±0,006 317±985,6 10,6±6,8
ANOVA по фактору: Р
линия <0,001 <0,001 <0,001 <0,005 <0,001 <0,002
рацион <0,001 н/д <0,05 <0,001 <0,001 <0,002
кверцетин н/д <0,005 <0,1 н/д <0,05 н/д
линияхрацион <0,001 н/д <0,005 <0,001 <0,001 <0,005
П р и м е ч а н и е. Надстрочные индексы - номера групп, различия с которыми статистически значимы (р<0,05) согласно Ь-критерию Стьюдента и/или непараметрическому критерию Манна-Уитни.
у крыс Z, получавших ВУВЖР (U-тест p5, 7<0,05). Экспрессия Ppara (рис. 1Б), гена рецептора а, связанного с пероксисомным пролифератором (PPARa), понижалась в сравнении с контролем у крыс W, получавших ВУВЖР и ВУВЖР с добавкой Q и, напротив, возрастала у соответствующих групп крыс Z (ANOVA p<0,05 по факторам «линия» и «линияхрацион»). Экспрессия генов ключевых ферментов de novo синтеза насыщенных жирных кислот Acaca (ацетил-КоА-карбоксилаза, рис. 1В) и Fasn (синтаза жирных кислот, рис. 1Г) была также систематически повышена у крыс Z по сравнению с соответствующими группами крыс W (ANOVA p<0,05 по фактору «линия»). Примечательно, что Q вызывал статистически значимое (U-тест p1r 4<0,05) снижение экспрессии Fasn только у крыс W, получавших ВУВЖР.
В обеих группах крыс W, получавших ВУВЖР, отмечалось достоверное снижение мРНК гена Srebfl (рис. 1Д), кодирующего белок SREBP, отвечающий за экспрессию генов липогенеза (ANOVA p<0,05 по фактору «рацион»). Потребление Q приводило у крыс W к дальнейшему снижению экспрессии Srebfl (ANOVA p<0,05 по фактору «Q»). В отличие от этого у крыс Z подобный эффект отсутствовал, и, более того, в группе животных, получавших ВУВЖР с Q, уровень мРНК этого гена был статистически значимо повышен (ANOVA p<0,05 по фактору «Q»). В целом по всем группам крыс факторный анализ показал различное влияние как рациона, так и включения в него Q на Srebfl у двух линий (ANOVA p<0,05 по фактору «линияхрацион» и «линияхQ»). Ген Scd, кодирующий стеароил-КоА-десатуразу (рис. 1Е), был более выраженно экспрессирован в группах крыс Z в сравнении с W (ANOVA p<0,05 по фактору «линия»), за исключением группы крыс, получавшей ВУВЖР. Q значительно подавлял экспрессию этого гена у крыс W, получавших ВУВЖР (U-тест p3- 4<0,05, ANOVA p<0,05
по фактору «Q»); ничего подобного у крыс Z отмечено не было, и, напротив, экспрессия этого гена в группах, получавших Q, возрастала, хотя и недостоверно.
Существенные различия между линиями W и Z имелись и в уровнях экспрессии генов углеводного обмена (рис. 2). Так, ген Mlxipl (рис. 2А), кодирующий транскрипционный фактор ChREBP, был достоверно сильнее экспрессирован во всех группах крыс Z в сравнении с W (ANOVA p<0,05 по фактору «линия»). При этом у крыс W потребление ВУВЖР, Q и их сочетания снижали экспрессию этого гена (ANOVA p<0,05 по факторам «рацион», «Q» и «рационxQ»), а у крыс Z, получавших ВУВЖР, она, напротив, возрастала (U-тест p5, 7<0,05), а влияние Q было недостоверным. На экспрессию Gck (глюкокиназа, рис. 2Б) Q оказывал у крыс W и Z прямо противоположное действие (ANOVA p<0,05 по фактору «линияЧQ»): если у первых экспрессия снижалась, независимо от состава основного рациона (U-тест p1r 2<0,05; ANOVA p<0,05 по фактору «Q»), то у вторых на фоне потребления ВУВЖР потребление Q усиливало экспрессию (U-тест p7:8 <0,05; ANOVA p<0,05 по фактору «рационxQ»). Аналогично Q достоверно подавлял у крыс W экспрессию Khk (фруктокиназа, рис. 2В), причем, по-видимому, более эффективно на контрольном рационе (U-тест p1: 2; 2, 4; з, 4<0,05; ANOVA p<0,05 по факторам «рацион» и «Q»), а у крыс Z всех групп уровень мРНК этого гена не различался. Экспрессия Pklr (пируваткиназа, рис. 2Г) статистически значимо не различалась у всех групп крыс W, а у крыс Z потребление Q вызывало усиление экспрессии (p5, 6<0,05; ANOVA p<0,05 по фактору «Q»).
Как следует из данных таблицы, крысы Z по сравнению с W имели многократно повышенные уровни триглицеридов, общего и ЛПВП-холестерина и лептина в плазме крови. Потребление ВУВЖР приводило к повышению уровня триглицеридов у животных обеих линий, однако у крыс Z этот эффект был намного более выра-
женным. Расчетное содержание холестерина липопро-теинов низкой плотности (ЛПНП), напротив, снижалось у получавших ВУВЖР крыс и, по-видимому, также в большей степени у животных линии Z. Если крысы W, получавшие ВУВЖР, отвечали на него компенсаторным усилением липолитической активности, то у крыс Z подобный эффект, по-видимому, отсутствовал. Влияние потребления Q на рассмотренные показатели липидного профиля плазмы крови проявлялись снижением общего холестерина у обеих групп животных (ANOVA, p<0,005 по фактору «Q»). Аналогичные изменения для холестерина ЛПНП проявлялись на уровне тенденции (p<0,1). На фоне кормления контрольным рационом Q вызывал небольшое снижение уровня лептина у крыс обеих линий, тогда как в случае приема ВУВЖР эффект Q у крыс W и Z был противоположным: снижение у крыс W и многократное повышение у крыс Z (ANOVA, p<0,05 по факторам «линия», «рацион», «Q» и «линияхрацион»).
Светооптическое морфологическое исследование показало (рис. 3), что потребление Q не вызывает существенных изменений в печени крыс W, получавших контрольный рацион (рис. 3А, Б). У животных этой линии, получавших ВУВЖР, отмечаются признаки накопления жира в гепатоцитах без изменения их общей архитектуры (ядра остаются в середине клеток); Q видимым образом не влияет на этот процесс (рис. 3В, Г). У крыс Z как на контрольном рационе, так и у получавших ВУВЖР, наблюдается массивная баллонная дистрофия гепатоцитов, с оттеснением ядер на периферию клеток и образованием крупных округлых вакуолей (рис. 3Д, Ж), причем добавка Q, по-видимому, только усиливает эти проявления (рис. 3Е, З).
Обсуждение
В основе различий в метаболизме двух изученных линий крыс лежит врожденное нарушение рецепции лептина в нейронах гипоталамуса у крыс Z, приводящее у них к нарушению центрального гомеостатического механизма регуляции потребления пищи, гиперфагии, висцеральному ожирению и стеатозу печени [9]. Одновременно у них многократно возрастает уровень лептина, циркулирующего в крови. Вследствие этого лептин начинает проявлять иммунотропные эффекты, обусловленные сходством его третичной структуры с цитокинами IL-2, IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF и онкостати-ном M (OSM) [12-14]. В результате этого у крыс Z развивается хроническое воспаление печени и жировой ткани, одним из проявлений которого является развитие инсулиновой резистентности, опосредуемое активацией JNK-сигнального пути и инактивацией инсулинового рецептора IRS1/2 [15].
Современные представления о воздействии Q на метаболические процессы учитывают его влияние на экспрессию генов [16, 17]. В этих эффектах участвует сложный комплекс регуляторных молекул, включающий C/EBP a [18], PPARy [19], SREBP [20] и др. Однако
чувствительность этих регуляторных механизмов к БАВ может, в свою очередь, зависеть от состояния клеток печени и жировой ткани, определяемого текущими уровнями свободных жирных кислот, про- и противовоспалительных цитокинов, адипокинов и др. Следствием этого может быть неоднозначность терапевтических эффектов Q и других флавоноидов у пациентов с ожирением, метаболическим синдромом и сахарным диабетом 2 типа [21, 22].
В проведенном нами исследовании у крыс W потребление Q приводило к статистически значимому снижению экспрессии генов ферментов липогенеза Fasn и Scd, а также ферментов, участвующих в метаболизме углеводов Khk и Gck. Указанные изменения совпадают с ранее наблюдавшимися нами эффектами Q у крыс W, получавших высокофруктозный рацион [23], а также с данными других авторов [19, 20]. В отличие от этого у крыс Z, в особенности при потреблении ВУВЖР, отмечалось повышение экспрессии Gck, Srebf1, Ppara, Pklr, указывающее на возможное усиление процессов липогенеза.
Общей особенностью крыс Z всех групп была наблюдавшаяся гиперэкспрессия у них отвечающих за адипогенез и р-окисление жирных кислот в митохондриях PPARa (ген Ppara) и ChREBP (ген Mlxipl), генов ферментов липогенеза Acaca и Fasn и десатуразы жирных кислот Scd (которая к тому же не отвечала у этих животных снижением на введение Q). Последний факт в свете наблюдаемой у крыс Z резистентности к действию Q представляется особенно важным, так как активность десатуразы жирных кислот и уровень синтезируемого под ее действием олеата может играть ключевую роль в стимуляции липогенеза [24]. С этим согласуются данные о наличии у крыс Z сильно выраженной дисли-пидемии, фактическим отсутствием ответа активности липазы на потребление ВУВЖР, а также развитием жировой дистрофии печени. Направленность изменений в уровнях триглицеридов и лептина у крыс Z вследствие потребления Q в составе ВУВЖР была противоположной по отношению к наблюдаемой у крыс W. При этом следует иметь в виду, что смысл соотношения различных фракций холестерина плазмы крови имеет неодинаковый смысл у человека и в in vivo моделях у грызунов. Ввиду сниженной по сравнению с приматами активности транспортера эфиров холестерина CETP основную роль в транспорте холестерина у крыс играют ЛПВП, что делает этих животных устойчивыми к развитию атеросклероза и одновременно повышает риск избыточного накопления холестерина и его эфиров в липидах печени при повышенных уровнях ЛПВП [25].
Заключение
Таким образом, модулирующий эффект Q на экспрессию ключевых генов липидного и углеводного обмена существенно различается у крыс W «дикого типа» с ненарушенной рецепцией лептина и мутантных крыс Z,
Zucker, контроль Zucker, контроль+Q
Рис. 3. Микрофотографии срезов тканей печени крыс: Wistar (А-Г); Zucker-Leprfe (Д-З)
Контрольный сбалансированный рацион (А, Б, Д, Е), высокоуглеводный, высокожировой рацион (В, Г, Ж, З). Без добавки (А, В, Д, Ж); добавка кверцетина (Б, Г, Е, З). Окраска гематоксилином и эозином, х400.
причем это различие, по-видимому, потенцируется потреблением рациона с избытком жира и легкоусвояемых углеводов. Этот результат следует, вероятно, учитывать при разработке схем назначения Q в ряду других БАВ и диетических факторов при персонализированной диетотерапии пациентов с различными формами ожирения.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 17-16-01043).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности. Авторы благодарят доктора медицинских наук Николая Александровича Ригера за предоставленные результаты определения лептина.
Сведения об авторах
Мжельская Кристина Владимировна (Mzhelskaya Kristina V.) - лаборант-исследователь лаборатории энзимологии питания ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия) E-mail: kristik13@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-0723-5860
Трусов Никита Вячеславович (TrusovNikita V.) - научный сотрудник лаборатории энзимологии питания ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия) E-mail: nikkitosu@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-1919-9297
Апрятин Сергей Алексеевич (Apryatin Sergey A.) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия) E-mail: apryatin@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6543-7495
Сото Селада Хорхе (Soto Celada Jorge) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия) E-mail: jsotoc@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-6622-5251
Гмошинский Иван Всеволодович (Gmoshinski Ivan V.) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия) E-mail: gmosh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Тутельян Виктор Александрович (Tutelyan Viktor A.) - академик РАН, профессор, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией энзимологии питания, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», заведующий кафедрой гигиены и токсикологии Института профессионального образования ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет) (Москва, Россия) E-mail: tutelyan@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-2706-6689
Литература
Жминченко В.М., Гаппаров М.М.Г. Современные тенденции исследований в нутрициологии и гигиене питания // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 1. С. 4-14.
Новиков П.В. Нутригенетика и нутригеномика — новые направления в нутрициологии в постгеномный период // Вопр. дет. диетологии. 2012. Т.10, № 1. С. 44—52. Тутельян В.А., Киселева Т.Л., Кочеткова А.А., Смирнова Е.А., Киселева М.А., Саркисян В.А. Перспективные источники фитонутриентов для специализированных пищевых продуктов с модифицированным углеводным профилем: опыт традиционной медицины // Вопр. питания. 2016. Т. 84, № 4. С. 46—60.
Zhao Y., Chen B., Shen J., Wan L., Zhu Y., Yi T. et al. The beneficial effects of quercetin, curcumin, and resveratrol in obesity // Oxid. Med. Cell. Longev. 2017. Vol. 2017. Article ID 1459497. Kobori M., Masumoto S., Akimoto Y., Oike H. Chronic dietary intake of quercetin alleviates hepatic fat accumulation associated with consumption of a Western-style diet in C57/BL6J mice // Mol. Nutr. Food Res. 2011. Vol. 55. P. 530—540.
Panchal S.K., Poudyal H., Brown L. Quercetin ameliorates cardiovascular, hepatic, and metabolic changes in diet-induced
10.
11.
12.
metabolic syndrome in rats // J. Nutr. 2012. Vol. 142, N 6. P. 1026-1032.
Edwards R.L., Lyon T., Litwin S.E., Rabovsky A., Symons J.D., Jalili T. Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects // J. Nutr. 2007. Vol. 137. P. 2405-2411. Rivera L., Moryn R., Sönchez M., Zarzuelo A., Galisteo M. Quercetin ameliorates metabolic syndrome and improves the inflammatory status in obese Zucker rats // Obesity (Silver Spring). 2008. Vol. 16, N 9. P. 2081-2087.
Kava R., Greenwood M.R.C., Johnson P.R. Zucker (fa/fa) rat // ILAR J. 1990. Vol. 32, N 3. P. 4-8.
Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements metabolism in rodents // Trace Elements in Laboratory Rodents / ed. R.R. Watson. New York, etc : CRC Press, 2000. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method // Methods. 2001. Vol. 25, N 4. P. 402408.
Lypez-Jaramillo P., Gymez-Arbelöez D., Lypez-Lypez J., Lypez-Lypez C., MartHnez-Ortega J., Gymez-RodrHguez A. et al. The role of leptin/adiponectin ratio in metabolic syndrome and
1.
7.
2.
8.
3
9
4
6.
diabetes // Horm. Mol. Biol. Clin. Invest. 2014. Vol. 18, N 1. P. 37—45.
13. Lee B.C., Lee J. Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation in the development of obesity induced insulin resistance // Biochim. Biophys. Acta. 2014. Vol. 1842, N 3. P. 446—462.
14. Baumann H., Morella K.K., White D.W. et al. The full-length leptin receptor has signaling capabilities of interleukin 6-type cytokine receptors // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 8374—8378.
15. Solinas G., Becattini B. JNK at the crossroad of obesity, insulin resistance, and cell stress response // Mol. Metab. 2017. Vol. 6. P. 174—184.
16. Балакина А.С., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В., Авреньева Л.И., Кравченко Л.В. и др. Влияние куркумина и кверцетина на показатели защитного потенциала крыс при их раздельном и совместном действии // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 2. С. 14—22.
17. Amiot M.J., Riva C., Vinet A. Effects of dietary polyphenols on metabolic syndrome features in humans: a systematic review // Obes. Rev. 2016. Vol. 17. P. 573—586.
18. Moon J., Do H.J., Kim O.Y., Shin M.J. Antiobesity effects of quercetin-rich onion peel extract on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and the adipogenesis in high fat-fed rats // Food Chem. Toxicol. 2013. Vol. 58. P. 347—354.
19. Jung C.H., Cho I., Ahn J., Jeon T.I., Ha T.Y. Quercetin reduces high-fat diet-induced fat accumulation in the liver by regulating lipid metabolism genes // Phytother. Res. 2013. Vol. 27, N 1. P. 139—143.
20. Wang L.L., Zhang Z.C., Hassan W., Li Y., Liu J., Shang J. Amelioration of free fatty acid-induced fatty liver by quercetin-3-O-p-D-glucuronide through modulation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha/sterol regulatory element-binding protein-lc signaling // Hepatol. Res. 2015. Vol. 46. P. 225— 238.
21. Egert S., Boesch-Saadatmandi C., Wolffram S., Rimbach G., Müller M.J. Serum lipid and blood pressure responses to quercetin vary in overweight patients by apolipoprotein E genotype // J. Nutr. 2010. Vol. 140. P. 278-284.
22. Edwards R.L., Lyon T., Litwin S.E., Rabovsky A., Symons J. D., Jalili T. Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects // J. Nutr. 2007. Vol. 137. P. 2405-2411.
23. Мжельская К.В., Трусов Н.В., Гусева Г.Н., Аксенов И.В., Кравченко Л.В., Тутельян В.А. Изучение влияния квер-цетина на экспрессию генов ферментов углеводного и липидного обмена в печени крыс, получавших высокофрук-тозный рацион // Бюл. экспер. биол. 2019. Т. 167, № 2. С. 218— 222.
24. Miyazaki M., DobrzynA., ManW.C., Chu K., Sampath H., Kim H.-J. et al. Stearoyl-CoA desaturase 1 gene expression is necessary for fructose-mediated induction of lipogenic gene expression by sterol regulatory element-binding protein-1c-dependent and
-independent mechanisms // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, N 2. P. 25 164-25 171.
25. Tran L.T., Yuen V.G., McNeill J.H. The fructose-fed rat: a review on the mechanisms of fructose-induced insulin resistance and hypertension // Mol. Cell. Biochem. 2009. Vol. 332. P. 145159.
References
10.
Zhminchenko V.M., Gapparov M.M.G.. Modern trends ofresearch 11. in nutritiology and nutrition hygiene. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (1): 4-14. (in Russian).
Novikov P.V. Nutrigenetics and nutrigenomics: new trends in nutri- 12. tion science in the postgenomic period. Voprosy detskoy dietologii [Problems of Pediatric Nutrition]. 2012; 10 (1): 44-52. (in Russian).
Tutelyan V.A., Kiseleva, T.L. Kochetkova А.А., Smirnova Е.А., 13. Kiseleva M.A., Sarkisyan V.A. Promising source of micronutrients for specialized foods with modified carbohydrate profile: traditional medicine experience. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 14. 2016; 84 (4): 46-60. (in Russian).
ZhaoY., Chen B., Shen J., Wan L., Zhu Y., Yi T., et al. The beneficial effects of quercetin, curcumin, and resveratrol in obesity. Oxid 15. Med Cell Longev. 2017; 2017: 1459497.
Kobori M., Masumoto S., Akimoto Y., Oike H. Chronic dietary intake of quercetin alleviates hepatic fat accumulation associated 16. with consumption of a Western-style diet in C57/BL6J mice. Mol Nutr Food Res. 2011; 55: 530-40.
Panchal S.K., Poudyal H., Brown L. Quercetin ameliorates cardiovascular, hepatic, and metabolic changes in diet-induced metabolic syndrome in rats. J Nutr. 2012; 142 (6): 1026-32. 17.
Edwards R.L., Lyon T., Litwin S.E., Rabovsky A., Symons J.D., Jalili T. Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects. J Nutr. 2007; 137: 2405-11. 18.
Rivera L., Moryn R., S6nchez M., Zarzuelo A., Galisteo M. Quercetin ameliorates metabolic syndrome and improves the inflammatory status in obese Zucker rats. Obesity (Silver Spring). 2008; 16 (9): 2081-87. 19.
Kava R., Greenwood M.R.C., Johnson P.R. Zucker (fa/fa) rat. ILAR J. 1990; 32 (3): 4-8.
Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements 20. metabolism in rodents. In: R.R. Watson (ed.). Trace Elements in Laboratory Rodents. New York, etc: CRC Press, 2000.
Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001; 25 (4): 402-8. Lypez-Jaramillo P., Gymez-Arbel6ez D., Lypez-Lypez J., Lypez-Lypez C., MartHnez-Ortega J., Gymez-RodrHguez A., et al. The role of leptin/adiponectin ratio in metabolic syndrome and diabetes. Horm Mol Biol Clin Invest. 2014; 18 (1): 37-45. Lee B.C., Lee J. Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation in the development of obesity induced insulin resistance. Biochim Biophys Acta. 2014; 1842 (3): 446-62. Baumann H., Morella K.K., White D.W., et al. The full-length leptin receptor has signaling capabilities of interleukin 6-type cytokine receptors. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 8374-8. Solinas G., Becattini B. JNK at the crossroad of obesity, insulin resistance, and cell stress response. Mol Metab. 2017; 6: 174-84.
Balakina A.S., Aksenov I.V., Trusov N.V., Guseva G.V., Avrenye-va L.I., Kravchenko L.V., Tutelyan V.A. The influence of separate and combined supplementation with curcumin and quercetin on the protective capacity in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (2): 14-22. (in Russian)
Amiot M.J., Riva C., Vinet A. Effects of dietary polyphenols on metabolic syndrome features in humans: a systematic review. Obes Rev. 2016; 17: 573-86.
Moon J., Do H.J., Kim O.Y., Shin M.J. Antiobesity effects of quercetin-rich onion peel extract on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and the adipogenesis in high fat-fed rats. Food Chem Toxicol. 2013; 58: 347-54.
Jung C.H., Cho I., Ahn J., Jeon T.I., Ha T.Y. Quercetin reduces high-fat diet-induced fat accumulation in the liver by regulating lipid metabolism genes. Phytother Res. 2013; 27 (1): 139-43. Wang L.L., Zhang Z.C., Hassan W., Li Y., Liu J., Shang J. Amelioration of free fatty acid-induced fatty liver by quercetin-3-O-ß-D-glucuronide through modulation of peroxisome proliferator-acti-
1.
2
4
6.
7
8
9
vated receptor-alpha/sterol regulatory element-binding protein-1c signaling. Hepatol Res. 2015; 46: 225-38.
21. Egert S., Boesch-Saadatmandi C., Wolffram S., Rimbach G., Müller M.J. Serum lipid and blood pressure responses to quercetin vary in overweight patients by apolipoprotein E genotype. J Nutr. 2010; 140: 278-84.
22. Edwards R.L., Lyon T., Litwin S.E., Rabovsky A., Symons J. D., Jalili T. Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects. J Nutr. 2007; 137: 2405-11.
23. Mzhelskaya K.V., Trusov N.V., Guseva G.N., Aksenov I.V., Kravchenko L.V., Tutelyan V.A. Effects of quercetin on liver carbohydrate and lipid metabolism enzyme gene expression in rats
fed a high-fructose diet. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2019; 167 (2): 218-22. (in Russian)
24. Miyazaki M., Dobrzyn A., Man W.C., Chu K., Sampath H., Kim H.-J., et al. Stearoyl-CoA desaturase 1 gene expression is necessary for fructose-mediated induction of lipogenic gene expression by sterol regulatory element-binding protein-1c-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 2004; 279 (2): 25 164-71.
25. Tran L.T., Yuen V.G., McNeill J.H. The fructose-fed rat: a review on the mechanisms of fructose-induced insulin resistance and hypertension. Mol Cell Biochem. 2009; 332: 145-59.
