ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СЭЛВИДЖ СИНТЕЗА НУКЛЕОЗИДФОСФАТОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КОФЕРМЕНТОВ. 2. РОЛЬ ГЛИКОЛИЗА В ФОСФОРИЛЛИРОВАНИИ НУКЛЕОЗИДФОСФАТОВ ДО НУКЛЕОЗИДДИ- И ТРИФОСФАТОВ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ

Цыренов В.Ж., заслуженный деятель науки Российской Федерации, д-р биолог. наук, профессор,

зав. каф. «Биотехнология»

Научное направление: Биохимия низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот

Пинуев И.В., канд. биолог. наук, доцент Санданов А.А., аспирант Восточно-Сибирский государственный технологический университет

УДК 602:577.113.3 (075.8)

ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СЭЛВИДЖ-СИНТЕЗА НУКЛЕОЗИДФОСФАТОВ И НУКЛЕИНОВЫХ

КОФЕРМЕНТОВ 2. РОЛЬ ГЛИКОЛИЗА В ФОСФОРИЛЛИРОВАНИИ НУКЛЕОЗИДФОСФАТОВ ДО НУКЛЕОЗИДДИ- И ТРИФОСФАТОВ

В статье рассмотрены возможности участия гликолиза в фосфориллировании нуклеозидфосфатов.

Ключевые слова: нуклеозидфосфаты, микробиологический синтез, сэлвидж-синтез, гликолиз.

BASIC LAWS OF SALVAGE PATHWAY MICROBIOLOGICAL NUCLOSIDPHOS-PHATES AND NUCLOSIDE COENSYME BYOSYNTHERSIS 2. ROLE OF GLYCOLYSIS IN NUCLEOSIDEPHOPATE PHOSPHORYLLATION TO NUCLESIDEDI- AND TRIPLE PHOSPHATES

Tsirenov V. Zh., Pinuev I.V., Sandanov A.A.

In this article authors observed ability of glycolysis participation in nuclesidephopate phosphoryllation.

Введение

Вещества нуклеотидной природы участвуют в наиболее важных процессах жизнедеятельности живых организмов: функционировании наследственного аппарата и биосинтеза белков, регуляции биохимических процессов и энергетическом обмене. Все более расширяется область практического использования нуклеозидфосфатов, нуклеозидов, нуклеотидных препаратов в качестве лекарств, применения их в производстве реактивов, лекарств, вкусовых добавок и других ценных препаратов для нужд химической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Из методов получения нуклеозидфосфатов наиболее перспективным является микробиологический метод, который на практике осуществляется двумя способами. Первый способ - прямая ферментация с применением ауксотрофных мутантов - основан на использовании de novo путей биосинтеза нуклеозидфосфатов.

Второй способ микробиологического синтеза - сэлвидж (Ба1уа§е)-синтез. Биохимическая основа этого способа - уникальные реакции реутилизации низкомолекулярных продуктов катаболизма нуклеиновых кислот (пурины, пиримидины и их нуклеозиды), протекающие в клетках живых организмов [1-7].

При практическом исполнении микробиологического метода необходимо постоянно решать проблемы увеличения выхода целевых продуктов и их ассортимента, совершенствования технологии на основе результатов многих фундаментальных наук - молекулярной биологии и генетики, микробиологии, биохимии, а также многих технических дисциплин.

Развитие, совершенствование сэлвидж-синтеза и успешное его применение во многом определяется знанием биохимических механизмов синтеза нуклеотидов и системы регуляции у штаммов продуцентов. Особый интерес представляет изучение особенностей биоэнергетики, взаимосвязь фосфорного и углеводного обменов.

Данная статья посвящена исследованию гликолиза в качестве возможного источника при сэлвидж-синтезе нуклеозидфосфатов у штаммов продуцентов из группы коринеформных бактерий.

Материалы и методы

Исследовали микроорганизмы из группы коринеморфных бактерий, осуществляющих сэлвидж синтез нуклеотидов: Corynebacterium flavum ВСТИ 301 (Цыренов и др. Авторское свидетельство 726161, СССР, 1980) и музейный штамм Corynebacterium Ammoniagenes ATCC 6872 (Лукин и др., 1978), который в настоящее время известен как Corynebacterium Ammoniagenes. Исследование механизма биосинтеза нуклеотидов у упомянутых выше микроорганизмов было проведено на примере образования ATP из аденина и GTP из гуанина с использованием бесклеточного экстракта.

Р-5-Ф, мкМ

Р-5-Ф, мкМ

Рис. 1. Влияние концентрации Р-5-Ф на образование нуклеозидфосфатов бесклеточным экстрактом. Условия: Использована реакционная смесь № 4. Концентрация Р-5-Ф указана на рисунке, аденин 0,6 мкМ, С14-аденин 12х105 имп/мин, MgSO4 5 мкМ, трис-HCl -буфер (рН 8,0) 10 мкМ и экстракт 1,2 мг по белку в конечном объеме 1 мл. А - Corynebacterium flavum ВСТИ 301.

Б - Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872. Е - удельная активность экстракта.

1 - AMP; 2 - ADP; 3 - ATP

Проведение ферментаций. С одно- двухсуточного косячка микроорганизмы переносили в посевную среду состава: глюкоза - 2%, пептон - 1,5%, FeS04-7H20, K2HP04-0,1%, NaCl -0,25%, биотин - 30 мкг, pH - 7,3. Культивирование микроорганизмов осуществляли в колбах Эрленмейера на круговой качалке при 280°С. 10% (по объему) посевного материала переносили в ферментационную среду состава: глюкоза - 10%, MgS04-7H20 - 1%, CaCl2-2H20 -

0,01%, К2НР04-1%, биотин - 30мкг/л, пептон - 0,5%, рН 7,6. При подборе оптимальных условий ферментаций варьировали составы сред. Для осуществления сэлвидж синтеза в определенные сроки культивирования вносили предшественник. Контроль уровня марганца и цинка проводили атомно-адсорбционным спектрофотометром "Спектр-1". Биомассу определяли турбидиметрическим методом.

о 3

□ 2 1

мкМ

Аденин

Рис.2. Влияние концентрации аденина на выход нуклеозидфосфатов. Использовалась реакционная смесь №4 с Р-5-Ф, 10 мкМ. Е - удельная активность экстракта. 1 - AMP; 2 - ADP; 3 - ATP

Для получения бесклеточного экстракта использовали двухсуточную культуру. Клетки отделяли центрифугированием при 5000xg, в течение 15 минут, трижды промывали 0,9% №С1. Взвесь клеток в трис-НС1-буфере, рН 7,5; 0,05 М (0,6-0,7 г клеток по сухому весу в 15 мл буфера) подвергали дезинтеграции в прессе типа Хьюза посредством экструзии из твердого состояния под давлением 3500 кг/см2 при температуре -35° С. Полученную смесь центрифугировали при 20000 xg в течение 30 минут. Супернатант использовали в качестве бесклеточного экстракта. Белок определяли по Лоури.

E 120 -

100 -

80 -

60 -

40

20 -

-о 1

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

pH

Рис.3. Влияние рН трис-HCl -буфера на образование AMP из ФРПФ (1) и ATP из Р-5-Ф (2). Использовалась смесь №1 (концентрация ФРПФ 0,5 мкМ) и смесь №4 (см.рис.1, концентрация Р-5-Ф 1 мкМ)

Для изучения энзиматических реакций, участвующих в биосинтезе ATP из аденина и гуанина, использовалось 6 составов реакционной смеси. Для исследования аденин-фосфорибозилтрансферазной активности применяли смесь № I: ФРПФ 0,5 мкМ, аденин 0,6

E

0

0

2

3

2

0

мкМ, С14-аденин (гуанин) 12х105 имп/мин, MgCl2 5 мкМ, трис-нс1-буфер (рН 8,0) 10 мкМ и экстракт энзимов 0,5 мг по белку в конечном объеме 1 мл. При испытании рибозо-5-фосфата (Р-5-Ф) в качестве рибозильного компонента ATP использовали смесь № 2: Р-5-Ф I мкМ, аде-нин 0,6 мкМ, С14-аденин 12х105 имп/мин, ATP 0,5 мкМ, MgCl2 5 мкМ, трис-буфер (pH 8.0) 10 мкМ и экстракт 1,2 мг белку в конечном объеме 1 мл.; смесь № 3 - смесь №2 без Р-5-Ф; смесь №4 - смесь №2 без ATP и смесь №5 и смесь №2 без MgCl2 (рис. 1, 2, 3, 4). Для исследования фосфориллирования AMP до ATP составляли смесь № 6: Р-5-Ф 0-15 мкМ, Mgcl2 5 мкМ, трис-HCl -буфер (рН 8,0) 10 мкМ, AMP - 0,3 мкМ, C14-AMP 12,5х105 имп/мин и экстракт 1,2 мг по белку в конечном объеме 1 мл. Инкубацию проводили при 30°С, без встряхивания. Реакция останавливалась добавлением 0,1 мл 60%-ной трихлоруксусной кислоты.

A

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

t, Время, часы

E

600 -

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

t, Время, часы

Рис. 4. Влияние времени инкубирования на образование нуклеозидфосфатов в реакционной смеси

№4 (Р-5-Ф - 5 мкМ). А - Corynebacterium flavum ВСТИ 301. Б - Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872. Е - удельная активность экстракта: нМ нуклеотидов на мг белка за время инкубации,

указанное на рисунке. 1 - AMP; 2 - ADP; 3 - ATP

Образующиеся в реакционной смеси нуклеотиды определяли с помощью восходящей бумажной хроматографии в системе изомасляная кислота - 1 н NH4OH - уксусная кислота в отношении 10:5:1 (об/об). Нуклеотиды экстрагировали 2 мл дистиллированной воды в кипящей водяной бане в течение 30 минут. Экстракт доводили до 2 мл, из него брали I мл, наносили на фильтр и высушивали. Радиоактивность измеряли жидкостным сцинтилляционным счетчиком SL-30 ("Intertecnique").

Удельную активность бесклеточного экстракта выражали как нМ нуклеотида (AMP, GMP, ADP, GDP, или ATP, GTP) в расчете на 1 мг белка, который образовался за соответствующее время инкубации (обычно 30 минут). Количество нуклеотидов в нМ рассчитывали,

исходя из распределения в них радиоактивности. При этом в случае использования Реакционных смесей №1 - №5 учитывали количество основания, в случае смеси №3 - количество AMP до начала реакции.

Результаты и обсуждение

Ранее было показано (Санданов и др., 1981), что в клетке и в культуральной жидкости штаммов продуцентов накапливается большое количество (до 4 мг/мл) пентозофосфатов (Р-5-Ф, ФРПФ) (рис. 1). Также было показано, что ФРПФ используется в аденинфосфорибозил-трансферазной реакции с образованием AMP. При этом была использована реакционная смесь №1, состоящая из С14-аденина, ФРПФ, MgCl2-буфера и экстракта энзимов

Было сделано наблюдение о том, что если в реакционной смеси №1 заменить Р-5-Ф и ATP (создавая таким образом реакционную смесь № 2), то в этих измененных условиях также интенсивно происходило образование AMP. Образование данного нуклеозидмонофосфата можно объяснить ФРПФ-синтетазной реакцией, которая активно протекает в клетках иссле-

ФН у

дуемых микроорганизмов по схеме: Р-5-Ф + ATP Mg2+ AMP + ФРПФ. Далее: аденин + ФРПФ ® AMP + пирофосфат. Однако наряду с AMP происходит синтез значительных количеств ADP и ATP, который трудно было объяснить.

Таблица 1

Испытание Р-5-Ф в качестве источника рибозильной части ATP

Реакционная смесь Основные компо- Удельная активность экстракта, нМ/мг

ненты реакционной СМ-ATP СМ-ADP СИ-AMP

смеси

Р-5-Ф, ATP. 28,6 (±2,9) 67,4(±3,8) 108 (±9,9)

Смесь без Р-5-Ф Следы Следы Следы

Смесь №2 без ATP 135 (±) 76,9 (±6,1) 24,3 (±1,8)

Смесь №2 без аде- Следы Следы Следы

нина

Исходя из этого наблюдения, мы попытались определить роль отдельных компонентов реакционной смеси №2, ставили опыт с бесклеточным экстрактом, в вариантах которого последовательно исключали из состава реакционной смеси тот или иной компонент. Для получения бесклеточного экстракта использовали двухсуточные культуры Corynebacterium flavum ВСТИ 301, Corynebacterium ammoniagenes.

Как видно из таблицы 1, в реакционной смеси №3 (которая, в отличие от смеси №2, не содержала Р-5-Ф) обнаруживаются следовые количества различных нуклеозидфосфатов. Это, по-видимому, объясняется дефицитом или отсутствием ФРПФ, который образуется в реакции пирофосфориллирования Р-5-Ф за счет энергии ATP (ФРПФ-синтетазная реакция).

В реакционной смеси № 4 (которая, в отличие от смеси №2, не содержала ATP) наблюдался синтез нуклеозидфосфатов, в том числе значительных количеств ATP.

В состав реакционной смеси № 4, кроме аденина, входили только Р-5-Ф, ионы магния и бесклеточный экстракт. Поскольку, в данном случае, происходит сэлвидж-синтез нуклеозидфосфатов, это свидетельствует о том, что в данной смеси, содержащей бесклеточный экстракт, происходят определенные процессы, которые обусловливают образование из Р-5-Ф ATP, необходимого для синтеза ФРПФ в ФРПФ-синтетазной реакции. Таким образом, ATP не является необходимым компонентом реакционной смеси, когда используется бесклеточный экстракт.

Аналогичный результат был получен при ферментации гуаниновых нуклеозидфосфатов с помощью Corynebacterium flavum. Так, при использовании реакционной смеси №4 были получены следующие данные: ^-GTP-mA ^-GDP^,! и С^-GMP - 53,1 нМ на 1 мг белка.

Для среды № 4 были определены оптимальные концентрации субстратов: для Р-5-Ф -357 мкМ и для аденина - 700 мкМ. Оптимальное значение рН трис-HCl -буфера для образования ATP в этой смеси составляло около 8,0.

Сравнение состава реакционной смеси №1 со смесью № 4 показывает, что единственное их отличие заключается в рибозофосфатах. Если в смеси №1 (содержащей ФРПФ) происходит образование только AMP, то в среде №4 (содержащей Р-5-Ф) - синтез нуклеозидфосфатов, включая ATP. Такой результат (который в определенной мере был неожиданным, поскольку Р-5-Ф является более простым соединением, чем ФРПФ) наводил на мысль, что Р-5-Ф является не только источником рибозильной части нуклеотидов, но и субстратом процессов, обеспечивающих фосфориллирование нуклеозидмонофосфата до нуклеозидтрифосфата (например, AMP до ATP).

Данное предположение было проверено с использованием реакционной смеси №6, состоящей из Р-5-Ф, C14-AMP или c14-gmp, трис-НС1-буфера, MgCl2 и бесклеточного экстракта. В первую очередь было изучено влияние различных концентраций Р-5-Ф на образование ATP у коринеформных бактерий (табл. 2).

Таблица 2

Влияние концентрации Р-5-Ф на образование пуриновых нуклеозидди- b трифосфатов у Corynebacterium flavum ВСТИ 301 и Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872

№ варианта Р-5-Ф мкМ Удельная активность экстракта, нМ/мг, 30мин

c14-adp c14-gdp c14-atp C14-GTP

1 0 25,2 20,8 40,7 21,6

2 5 75,2 36,9 62,0 30,9

3 10 97,8 45,6 74,0 40,6

4 15 72,6 32,4 61,2 31,7

*)Использована реакционная смесь № 6 состава: Р-5-Ф, концентрация указана в таблице, MgCl2 5 мкМ, трис-HCl -буфер (рН 8,0) 10 мкМ, AMP - 0,3 мкМ, C14-AMP 12,5х105 имп/мин и экстракт 1,2 мг по белку в конечном объеме 1 мл. Радиоактивность на единицу веса продукта (ADP, ATP) составляла 4,18х103 имп/мин на 1 нМ. В случае синтеза GTP использовался GMP, C14-GMP.

Обнаружилась достаточно четкая зависимость степени фосфориллирования от концентрации Р-5-Ф. Наряду с этим наблюдался заметный синтез нуклеозидди- и трифосфатов в контрольных образцах, куда не добавляли Р-5-Ф. Это, очевидно, связано с наличием в бесклеточном экстракте доноров макроэргических фосфатных групп (например, полифосфатов, пен-тозофосфатов).

Зависимость фосфориллирования нуклеозидмонофосфата от концентрации субстрата указывает на возможную роль гликолиза, которая обнаруживается при использовании бесклеточного экстракта. Известно, что фосфоглюконатный путь, одним из промежуточных продуктов которого является Р-5-Ф, на одном из этапов может перейти в гликолитический, т.е. Р-5-Ф может стать субстратом гликолиза, энергетический эффект которого в данном случае обеспечивает фосфориллирование нуклеозидмонофосфата. Для проверки этого предположения был поставлен опыт с реакционной смесью №4, в которой вместо Р-5-Ф была взята глюкоза (табл. 3).

Таблица 3

Влияние концентрации глюкозы на образование нуклеозидфосфатов пуринового ряда бесклеточным

экстрактом C.flavum ВСТИ 301

№ варианта Глюкоза, мкМ Удельная активность экстракта, нМ/мг, 30 мин

AMP GMP ADP GDP ATP GTP

1 0 1,2 1,3 3,1 2,8 14,6 12,1

2 2 3,2 1,7 5,2 4,1 26,0 14,2

3 4 7,1 3,7 10,1 6,4 44,0 26,4

4 6 8,2 4,5 11,0 5,9 50,2 28,7

5 8 7,4 3,4 9,8 4,3 42,1 22,6

6 10 2,1 1,5 4,8 4,2 26,5 14,8

Как видно из таблицы 3, наблюдалось заметное образование нуклеозидфосфатов в случае замены Р-5-Ф глюкозой. Наиболее высокий уровень синтеза ATP и GTP обнаруживается при концентрации глюкозы 6 мкМ.

Образование нуклеотидов при добавлении глюкозы, особенно характерная зависимость синтеза от концентрации гексозы, однозначно свидетельствуют об участии гликолиза в фос-фориллировании нуклеозидмонофосфатов в нуклеозидди- и трифосфаты.

Проведенные нами опыты показали, что в реакционной смеси №4 образование ATP происходит через AMP. Так, в опыте по исследованию влияния продолжительности инкубирования на образование нуклеозидфосфатов было показано возрастание количества AMP по мере увеличения времени инкубирования. Очевидно, это обусловлено ингибированием с помощью ATP киназных реакций, происходящих по схеме: AMP ^ ADP ATP.

Количество AMP также возрастало в присутствии NaF, являющегося ингибитором гликолиза. Ингибирующий эффект NaF на фосфориллирование AMP до ATP усиливался в присутствии фосфатов (табл. 4).

Таблица 4

Влияние фторида натрия и фосфатов на образование нуклеозидфосфатов бесклеточным экстрактом C.flavum ВСТИ 301

Буфер NaF, 100мкМ Удельная активность экстракта, нМ/мг белка, 30 мин

c14-atp c14-adp c14-amp

Трис-Иа-буфер, pH 8,0 - 96 102 29

Трис-Иа-буфер, pH 8,0 + 21,0 36,1 42,8

Трис-Иа-буфер, pH 9,0 + 30,2 61,2 71,5

Na-фосфатный буфер, 10мкМ, pH 7,4 - 22,7 58,6 174,1

Na-фосфатный буфер, 10мкМ, pH 7,4 + 9,1 25,7 98,7

Заключение

В работе показана взаимосвязь энергетического обеспечения сэлвидж-синтеза нуклеозидфосфатов у коринеформных бактерий с процессом гликолиза.

Библиография

1. Цыренов В.Ж. Основные закономерности микробиологического сэлвидж-синтеза нуклезид-фосфатов и нуклеотидных коферментов: 1.Выделение из природных источников штаммов-продуцентов нуклеозидфосфатов и НАД, их свойства, механизм образования нуклеозидмонофосфа-тов// Вестник ВСГТУ. - 2007. - №2. - С. 68.

2. Лукин Н.С., Казаринова Л.А., Ерохина Л.И. Влияние компонентов среды на метаболизм культуры Corynebacterium ammoniagenes - продуцента 5-инозиновой кислоты// Прикл. биохим. и мик-робиол. - 1978. - №14. - С. 565-572.

3. Цыренов В.Ж. Микробиологический синтез нуклеозидфосфатов. -М.: Наука, 1990. - 200 с.

4. Tsirenov V.Zh., Tulo^nova L.V., Podlepa E.M., Butuhanov V.D. andBazdyreva N.M. Concerning peculiarities of NAD byosinthesis regulation by producer strains of microorganisms. In: Biotechnology and industry Editor G.E. Saikov. p. 55-74, 2004, Nova Science Publishers. Inc.

5. Санданов Ч.М., Ерошина И.В., Цыренов В.Ж. Изучение метаболического механизма синтеза адениновых нуклеотидов из экзогенного аденина у коринеморфных бактерий//Микробиология. -1981. Т. 50. - Вып.6. - С. 1053-1056.

1. Tsirenov V.Zh. The basic mechanism of the microbiological salvage synthesis of nucleoside phosphates and nucleotide co ferments: 1. Extraction of strain producers of nucleoside phosphates and NAD from the natural materials, their properties, total mechanism of nucleoside mono phosphates. - Ulan-Ude: East Siberia State University of Technology Press, 2007, №2 - P.68.

2. Lukin N.S., Kazarinova L.A., Erokhina L.I. Medium components influence on culture metabolism of Corynebacterium ammoniagenes - producer 5- inosine acid // Applied biochemistry and microbiology, 1978, №14, p.565-572.

3. Tsirenov V.Zh. Microbiological synthesis of nucleoside phosphates. -M.: Science, 1990, - 200p.

4. Tsirenov V.Zh., Tulohanova L.V. Podlepa E.M., Butuhanov V.D.,and Bazdyreva N.M. Concerning peculiarities of NAD byosinthesis regulation by producer strains of microorganisms. In: Biotechnology and industry Editor G.E. Saikov. p. 55-74, 2004, Nova Science Publishers. Inc.

5. Sandanov Ch.M., Eroshina I.V., Tsirenov V.Zh. Extraction of the metabolic mechanism of synthesis adenine nucleotide from exogenous adenine of coryneformic bacterium // Microbiology. - 1981. vol.50. -6th issue. - p.1053-1056.