ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ДИЗЕНТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИЙ В МОЛОКЕ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ

ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ДИЗЕНТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИЙ В МОЛОКЕ

Кандидат медицинских нзук С. И. Дьяков, Р. В. Касаткина,

кандидат медицинских наук В. М. Никитин, 3. В. Пестрякова

Из кафедры микробиологии Военно-медицинской ордена Ленина академии

имени С. М. Кирова и- санитарно-эпидемиологической станции (Ленинград)

Существующие методы обнаружения патогенных и санитарно-по-казательных микроорганизмов в молоке, как и во многих других скоропортящихся продуктах, длительны, поэтому разработка быстрых и надежных способов индикации патогенных микробов в пищевых продуктах представляет важную задачу санитарной бактериологии. В настоящем сообщении приводятся данные по применению иммунно-флуо-ресцентного метода для быстрого обнаружения возбудителей дизентерии в молоке.

Готовили по возможности тонкие мазки из молока. После высуши-шивания препараты фиксировали смесью Никифорова в течение 10—15 минут. Для устранения фоновой флуоресценции мазки подвергали дополнительной обработке бензином в течение 2—5 минут.

В работе были использованы флуоресцирующие конъюгаты адсорбированной дизентерийной сыворотки Флекснера и ее у-глобулиновой фракции, меченные флуоресцеин-изоцианатом и флуоресцеин-изотиоци-анатом1. Для контрольного окрашивания применяли флуоресцирующие конъюгаты как нормальных, так и гетерологичных (туляремийная и тифозная) кроличьих сывороток и их у-глобулиновых фракций. Дополнительным контролем служила обработка дизентерийными конъюга-тами препаратов, приготовленных из проб молока, которые заведомо не содержали дизентерийных бактерий. Препараты окрашивались в течение 10—20 минут при 37° во влажной камере. Мазки отмывали струей водопроводной воды в 2—3 минуты и после высушивания исследовали под люминесцентным микроскопом МЛ-1 с использованием светофильтров СЗС-7, ФС-1, БС-8 и Т-2Н. Для изучения общей микрофлоры молока и ее количественной оценки мазки окрашивали раствором аурамина 1 : 1000 в течение 1—2 минут. После окраски их опускали в 70° спирт на несколько секунд и тщательно промывали водой.

Использование метода флуоресцирующих антител для ускоренного обнаружения дизентерийных бактерий в молоке может удовлетворить запросы практики при 3 основных условиях: быстрота получения ответа, высокая чувствительность и специфичность. Для приготовления, окрашивания и микроскопического исследования препаратов, как правило, было достаточно 30—45 минут. Для определения чувствительности метода 5—10 мл фляжного молока инфицировали различными дозами дизентерийных бактерий Флекснера (тип «С»). После 30-минутного контакта пробы тщательно перемешивали и из них готовили мазки, которые окрашивали флуоресцирующими конъюгатами и раствором аурамина. В мазках, окрашенных аурамином, обнаруживалось большое количество ярко флуоресцирующих дрожжевых клеток, клеток бактерий палочковидной и шаровидной формы и т. д. В противоположность этому в препаратах, обработанных дизентерийными флуоресцирующими конъюгатами, в зависимости от концентрации внесенных в пробу дизентерийных бактерий обнаруживали присутствие различных

1 Флюорохромы были любезно предоставлены нам Г. И. Михайловым, которому «мы приносим глубокую благодарность.

Я , 5

о 1 н 4» о2о5

5 >»н =

5® 3

п и * О. О о 5 5

6 с я Ь о 5 >> зг о 3-е

си

О со з*

см со

о.

о

3е

сс о са ¡г

сч

СО

а> а.

а;

3е

г

5

О см

СО

а>

о. у

о <

со о О

• г—

Я К о

и я о

° = *

- ^

а*

о

о

а ^

оз _

н 2

о с^з

2 Я и

* Й

х о *

к 5 =

о О- с

со * и

н =

О 2

^ са

I

, ** О

; = о 1 * 8

к

•-С

н

к

&

О О СО

I

о см

Ю ьо

О О О о

СМ — — со со

со —

ю о

— о

3 X

Н л

к о

<и

2 со см

сч —

I I

£ о о

Х СМ СО СМ

£ * о II

с*

2 о

х —I 1Л — см

I I I

а о —

с*

О!

£сОО

I I

о

с^юсч

з:

В -

а> О

I I

5 о о

* см — см — —

я I О I I I

о

<М Ю —■

11111 о — о о

X 2

л о о о о л о о о о о о о —

о о о — о о —• о —

количеств интенсивно флуоресцирующих желто-зеленым цветом микробных клеток палочковидной формы с более интенсивно флуоресцирующими ободками. Полученные результаты представлены в таблице.

С целью повышения чувствительности метода флуоресцирующих антител были применены методы концентрации бактерий в молоке: центрифугирование, флотация, непродолжительное подращивание на питательных средах и др. Центрифугированию подвергали инфицированные пробы молока в объеме 5—10 мл при 2500—3500 об/мин, в течение 5—60 минут. Мазки готовили из верхней сметанообразной пленки, просветленной надосадочной жидкости и беловатого осадка. При флотации на 9 мл исследуемой пробы молока вносили 0,3— 0,5 мл ксилола, после чего пробирки с резиновыми пробками 10—15 минут встряхивали в ап-, паратуре для встряхивания. Мазки готовили из пленки через 20 минут, 2 и 24 часа после нахождения пробирок в покое, а также после 10—30-минутного центрифугирования. Для подращивания образцы молока в объеме от 0,2 до 1 мл засевали в полужидкую среду Плоскирева и мартеновский бульон с манни-том (0,5%). Были также испытаны среды Мюллера и Кесслера— Свенартона. Оставшееся молоко в количестве 5 мл помещали в термостат при 37°. Мазки готовили после 2, 4, б, 12 и 24 часов инкубации в термостате. Суммарные показатели испытанных способов повышения чувствительности представлены в таблице.

Полученные показатели свидетельствуют о том, что применение дополнительных приемов, позволяющих концентрировать микробные клетки, доводит чувствительность метода флуоресцирующих антител до получения положительных ответов при наличии 1 мл исследуемого молока от 1000 до 10 000 микробных клеток дизентерийных бактерий.

Вопрос о специфичности любого метода диагностики по сути дела определяет в конечном итоге его практическую ценность. Прежде всего мы изучили интенсивность специфического окрашивания дизентерийных бактерий в зависимости от их пребывания в искусственно зараженном молоке. С этой целью пробы фляжного сырого молока инфицировали 50 млн. микробных тел в 1 мл и хранили в течение 10 дней при 2, 4, 18—22 и 37°. Мазки готовили ежедневно. Одновременно производили высевы на дифференциально-диагностические и элективные среды Эндо и Плоскирева. Результаты проведенных исследований показали, что клетки дизентерийных бактерий в течение всего срока наблюдения не теряли способности специфически окрашиваться флуоресцирующими антителами, однако интенсивность свечения клеток и количество флуоресцирующих клеток в поле зрения микроскопа несколько снижались. Интересно отметить, что, начиная с 3-го дня инкубации образцов инфицированного молока в термостате при 37° и при комнатной температуре, количество колоний дизентерийных бактерий, вырастающих на чашках, постепенно уменьшалось, а начиная с 8-го дня, дизентерийные микробы вообще не высевались. Положительные находки в указанных пробах флуоресцирующих клеток указывают на то, что флуоресцентно-иммунологический метод выявлял нежизнеспособные клетки дизентерийных бактерий.

Основное внимание при изучении специфичности метода флуоресцирующих антител было обращено на обследование молока, полученного на производстве. Всего была обследована 181 проба такого молока. В лаборатории по получении проб немедленно готовили мазки непосредственно из молока, сметанообразной пленки (после 5—10-минутного центрифугирования 5—10 мл молока при 3000 об/мин), а также из осадка после 6-часового подращивания на мартеновском бульоне и центрифугирования посевов. При флуоресцентной микроскопии каждый препарат тщательно просматривали в течение 3 минут. При регистрации обращали внимание на морфологию флуоресцирующих образований, интенсивность и цвет их флуоресценции, характер окрашивания, количество флуоресцирующих клеток в поле зрения или в препарате. При оценке флуоресцентных изображений результаты сопоставляли с данными обследования контрольных препаратов, обработанных нормальными и гетерогенными флуоресцирующими сыворотками. Параллельно с этим каждую пробу молока исследовали бактериологически на коли-титр, микробное число, а также на присутствие дизентерийных и тифо-паратифозных бактерий. Кроме того, выросшие на плотных средах колонии испытывали на обнаружение кишечной палочки, положительно агглютинирующейся дизентерийной сывороткой Флекснера.

Результаты проведенных наблюдений были следующие. В 99 пробах (54,7%) при люминесцентной микроскопии всех 3 серий препаратов не было обнаружено ни одной флуоресцирующей клетки. Бактериологические исследования на наличие дизентерийных бактерий также дали отрицательные результаты. В 5 пробах были выделены штаммы кишечной палочки, агглютинирующиеся дизентерийной сывороткой Флекснера. В 9 пробах (5%) при микроскопии были обнаружены интенсивно флуоресцирующие клетки с характерным структурным окрашиванием после обработки препаратов нормальным флуоресцирующим конъюгатом.

В 23 образцах молока (12,7%) флуоресценция микробных клеток наблюдалась при обработке мазков как дизентерийными, так и нормальными флуоресцирующими сыворотками. Это указывает на то, что наблюдаемая флуоресценция представляет неспецифическое окрашивание микробных клеток. При бактериологическом исследовании был выделен один ип*амм палочки Моргана и 6 штаммов кишечной палочки, агглютинировавшиеся сывороткой Флекснера. Таким образом, сум-

мируя данные исследования 131 пробы молока (72,4%), можно считать, что все они могут быть отнесены к группе отрицательных. По данным люминесцентной микроскопии, 28 проб молока (15,4%) следует отнести к группе слабо положительных. Все эти пробы характеризовались тем, что при окрашивании дизентерийной сывороткой обнаруживались лишь единичные специфически флуоресцирующие клетки (1—4 на весь мазок). Из данных проб было выделено 7 штаммов кишечной палочки, агглютинировавшихся дизентерийной сывороткой. Дизентерийные бактерии в этих пробах не были обнаружены. При слабо положительном ответе в данной серии проб мы ориентировались на единичный характер находок флуоресцирующих клеток во всем препарате и на отсутствие увеличения числа флуоресцирующих клеток в препаратах, приготовленных из мартеновского бульона после 6-часового подращивания.

Наконец, остальные 22 пробы (12,2%) молока, по данным метода флуоресцирующих антител, можно было отнести к группе с четко положительным ответом. Однако следует подчеркнуть, что ни в одном случае нам не удалось обнаружить в этих пробах дизентерийных бактерий при бактериологическом исследовании. В 21 образце молока из 22 были выделены штаммы кишечной палочки, содержащие антигены, общие с дизентерийными бактериями Флекснера.

Таким образом, несмотря на отрицательные результаты бактериологического исследования 181 пробы производственного молока, 22 пробы из них, по данным люминесцентного анализа, оказались положительными. Очевидно, для правильной оценки положительных результатов флуоресцентного метода требуются дальнейшие исследования.

Определенный интерес представляют материалы детального изучения 62 параштаммов/ выделенных нами из молока.. После выделении чистых культур и их непродолжительного лабораторного хранения отмечалось резкое снижение как способности культур агглютинироваться дизентерийной сывороткой Флекснера, так и интенсивности свечения микробных клеток, окрашенных флуоресцирующими дизентерийными конъюгатами. Так, уже через 2—3 пересева микробные клетки 46 пара-штаммов флуоресцировали на + + и лишь отдельные клетки некоторых из этих штаммов давали более яркую флуоресценцию—до + + +. Только 4 штамма флуоресцировали достаточно ярко (+ + + ), а-отдельные

12 штаммов вообще утратили способность флуо-

клетки — до

ресцировать. Большинство штаммов характеризовалось диффузным свечением всего тела микробной клетки слабой или средней интенсивности (4- и ++). Ярко флуоресцирующий ободок у всех параштаммов, за исключением 4, как правило, отсутствовал. На поверхности микробных клеток более ярко флуоресцировали лишь небольшие участки в виде зерен, за счет которых иногда создавалось впечатление как бы биполярного свечения. Особенно резко проявлялось в препаратах неравномерное окрашивание клеток.

Отмеченные особенности флуоресцентного окрашивания клеток параштаммов в чистых культурах позволили достаточно надежно дифференцировать подавляющее большинство их с дизентерийными бактериями Флекснера.

ЛИТЕРАТУРА

Ефимова К. В. Лабор. дело, 1959, № 3, стр. 45.—К а у ф м а н Ф. Семейство кишечных бактерий. М., 1959.

Поступила 29/1 1962 г.

* * Ъ