CC BY
25
https://doi.org/10.17116/molgen201937041186
Оптимизированный метод получения рекомбинантных аденовирусных плазмид без использования электропорации
© М.В. ШЕПЕЛЕВ, И.В. КОРОБКО
ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия, 119334
Рекомбинантные аденовирусы широко используются для доставки и экспрессии трансгенов как для терапевтических целей, так и в фундаментальных исследованиях. Система аденовирусных векторов AdEasy™ позволяет быстро и эффективно создавать рекомбинантные репликативно-дефицитные аденовирусы. Получение рекомбинантной аденовирусной плазмиды за счет гомологичной рекомбинации в клетках E. coli BJ5183 между шаттл-вектором, кодирующим трансген, и плазмидой pAdEasy-1, несущей большую часть генома аденовируса человека серотипа 5 (Ad5), является одним из важнейших этапов при создании рекомбинантных аденовирусов. Во многих опубликованных протоколах указывается на необходимость трансформации шаттл-вектора и плазмиды pAdEasy-1 в клетки E. coli путем электропорации, что требует наличия соответствующего оборудования и расходных материалов. В данной работе нами был предложен оптимизированный протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид с использованием только химически компетентных клеток E. coli, без применения электропорации. Показана эффективная трансформация неочищенного линеаризованного шаттл-вектора в химически компетентные клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1, позволяющая идентифицировать клоны с корректными рекомбинантными аденовирусными плазмидами. С использованием оптимизированного протокола были получены четыре функциональных репликативно-дефицитных аденовируса, экспрессирующих целевые белки в клетках HEK293. Предложенный протокол позволяет существенно упростить и удешевить методологию получения рекомбинантных аденовирусов, так как отпадает необходимость использования оборудования и расходных материалов для электропорации.
Ключевые слова: система AdEasy, рекомбинантная аденовирусная плазмила, репликативно-лефицитный аденовирус, pAdEasy-1, pShuttle-CMV.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Шепелев М.В. — e-mail: mshepelev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3639-3048 Коробко И.В. — e-mail: korobko1305@gmail.com
АВТОР, ОТВЕТСТВЕННЫЙ ЗА ПЕРЕПИСКУ: Шепелев М.В. — e-mail: mshepelev@mail.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Шепелев М.В., Коробко И.В. Оптимизированный метод получения рекомбинантных аденовирусных плазмид без использования электропорации. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):186-191. https://doi.org/10.17116/molgen201937041186
Optimized electroporation-free method for generation of recombinant adenoviral plasmids
© M.V. SHEPELEV, I.V. KOROBKO
Institute of gene biology, Russian academy of Sciences, Moscow, Russia, 119334 Abstract
Recombinant adenoviruses are widely used for delivery and expression of transgenes for therapeutic purposes and in fundamental research. AdEasyTM adenoviral vector system allows for rapid and efficient generation of replication-deficient adenoviruses. One of the crucial steps in producing the recombinant adenoviruses is the generation of a recombinant adenoviral plasmid in E. coli BJ5183 cells via homologous recombination between transgene encoding shuttle vector and pAdEasy-1 plasmid, bearing the greater part of human adenovirus serotype 5 (Ad5) genome. In many published protocols the necessity of electroporation for transformation of the shuttle vector and pAdEasy-1 into E. coli cells is emphasized thus demanding the availability of the appropriate instruments and consumables. Here we proposed the optimized protocol for generation of recombinant adenoviruses with the use of chemically competent E. coli cells only, without the use of electroporation. We showed efficient transformation of linearized non-purified shuttle vector into chemically competent E. coli BJ5183-pAdEasy-1 cells allowing for identification of clones with correct recombinant adenoviral plasmids. Using the optimized protocol we generated four functional replication-deficient adenoviruses, expressing target proteins in HEK293 cells. The proposed protocol allows for significantly simplified and cheaper method for generation of recombinant adenoviruses due to lack of requirement to use instruments and consumables for electroporation.
Keywords: AdEasy system, recombinant adenoviral plasmid, replication-deficient adenovirus, pAdEasy-1, pShuttle-CMV. INFORMATION ABOUT AUTHORS:
Shepelev M.V. — e-mail: mshepelev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3639-3048 Korobko I.V. — e-mail: korobko1305@gmail.com
CORRESPONDING AUTHOR: Shepelev M.V. — e-mail: mshepelev@mail.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Shepelev MV, Korobko IV. Optimized electroporation-free method for generation of recombinant adenoviral plasmids. Molekulyamaya Genetika, Mikro-biologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2019;37(4): 186-191 (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen201937041186
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ: т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов КОЕ — колониеобразующие единицы
В настоящее время аденовирусы широко применяются для доставки и экспрессии трансгенов для терапевтических целей и в фундаментальных исследованиях [1]. Система аденовирусных векторов AdEasy™ является одной из наиболее часто используемых для быстрого и эффективного создания ре-комбинантных репликативно-дефицитных аденовирусов. В системе AdEasy рекомбинантная аденовирусная плазмида создается посредствам гомологичной рекомбинации в клетках E. coli BJ5183 между шаттл-вектором, кодирующим ген интереса, и плазмидой pAdEasy-1, несущей большую часть генома аденовируса человека серотипа 5 (Ad5). Далее полученная рекомбинантная аденовирусная плазмида трансфи-цируется в упаковочную клеточную линию (например, HEK293), в которой происходит сборка вирусных частиц и репликация вируса [2, 3].
Создание рекомбинантной аденовирусной плаз-миды является одним из важнейших этапов получения рекомбинантных аденовирусов. В исходном варианте системы AdEasy в клетки штамма BJ5183 котрансфор-мируют шаттл-вектор и плазмиду pAdEasy-1, отбирая канамицин-устойчивых рекомбинантов [2]. Повысить эффективность получения рекомбинантной аденовирусной плазмиды можно за счет создания штамма клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, который получают путем трансформации клеток BJ5183 плазмидой pAdEasy-1. Далее в клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 трансформируют шаттл-вектор, что существенно увеличивает эффективность гомологичной рекомбинации по сравнению с котрансформацией двух плазмид в штамм BJ5183 [4].
Согласно приведенным выше протоколам [2, 4], для получения рекомбинантной аденовирусной плазмиды в системе AdEasy необходимо проведение элек-тропорации плазмидной ДНК, что требует наличия дорогостоящего оборудования и расходников (кюветы), а также приготовления в лаборатории или приобретения высокоэффективных электрокомпетентных клеток E. coli. Однако в ряде работ для получения рекомбинатной аденовирусной плазмиды использовали химически компетентные клетки E. coli [5, 6].
Задачей данной работы была оптимизация протокола получения рекомбинатной аденовирусной плаз-миды в системе AdEasy с использованием химически компетентных клеток, приготовленных в лаборатор-
ных условиях по одной из самых простых методик. В результате с использованием химически компетентных клеток нами были успешно созданы рекомбинант-ные аденовирусные плазмиды и получены реплика-тивно-дефицитные аденовирусы, экспрессирующие целевые белки. Описанный нами протокол позволяет быстро и эффективно получать рекомбинантные аденовирусные плазмиды с помощью системы AdEasy без проведения электропорации, а также без дополнительной очистки линеаризованного шаттл-вектора.
Материал и методы
Плазмиды. Плазмиды pShuttle-CMV и pAdEasy-1 были приобретены у компании «Agilent Technologies» (США). Для создания шаттл-векторов, кодирующих кДНК слитого белка Egfp-Pdcd4 с мутациями в кДНК Pdcd4 RBM12 S457A или RBM12 D235A D418A, NheI (обработан фрагментом Кленова) — Sali фрагменты кДНК клонировали из соответствующих векторов pEgfp-C2-Pdcd4 RBM12 S457A или pEgfp-C2-Pd-cd4 RBM12 D235A D418A в вектор pShuttle-CMV по сайтам Bglll (обработан фрагментом Кленова) и Sali. Мутантная форма Pdcd4 RBM12, несущая аминокислотные замены K60A, R61A, R62A, R64A, K65A, R102A и R103A, была описана ранее [7]. Точечные мутации вводили с помощью сайт-направленного мутагенеза с помощью метода с двумя комплементарными оли-гонуклеотидными праймерами на основе протокола QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit («Agilent Technologies»). В качестве матрицы в ПЦР использовали плазмиду pCR-Blunt («invitrogen», США), несущую кДНК белка Pdcd4 человека, фланкированную сайтами рестрикции EcoRI-Sali. ПЦР проводили с использованием ДНК полимеразы AccuPrime Pfx («Invitrogen») в реакции объемом 50 мкл, включавшей 1-кратный реакционный буфер, 300 нМ прямого и обратного праймеров, 100 нг плазмидной матрицы и 2,5 ед. ДНК-полимеразы при следующих условиях: 94 °С — 3 мин (94 °С — 40 с, 55 °C — 1 мин, 68 °С — 5 мин) — 15 циклов, 68 °С — 3 мин. Продукт ПЦР обрабатывали рестриктазой Dpni в течение 2 ч для расщепления плазмидной матрицы и трансформировали 10 мкл в химически компетентные клетки E. coli XL-1 Blue MRF'. Мутации в различных участках кДНК Pdcd4 вводили последовательно. Далее
кДНК белка Pdcd4 с нужными мутациями субклониро-вали в вектор pEGFP-C2 («Clontech», США) по сайтам EcoRI-SalI. Для мутагенеза использовали следующие олигонуклеотидные праймеры: S457A (5'-gcagaaagcgt tttgtagccgaaggagatggaggtc-3' и 5'-gacctccatctccttcggctaca aaacgctttctgc-3'); D235A (5'-gggacagtaatgagcacaactgctgtg gaaaaatcatttgataaa-3' и 5'-tttatcaaatgatttttccacagcagttgtgct cattactgtccc-3'); D418A (5'-ttccggacattaatctggctgtcccacatt catactc-3' и 5'-gagtatgaatgtgggacagccagattaatgtccggaa-3'); K60A, R61A, R62A, R64A, K65A (5'-atcgcctctgccagagtc ccgggatgagtttgccgctagtgccgctgctgccttggcattaattctagcttcgtta atg-3' и 5'-cattaacgaagctagaattaatgccaaggcagcagcggcactag cggcaaactcatcccgggactctggcagaggcgat-3'); R102A, R103A (5'-caaagggaaggttgctggatgcggcatccagatctgggaaagg-3' и 5'-cc tttcccagatctggatgccgcatccagcaaccttccctttg-3'). Для создания шаттл-вектора, кодирующего внутриклеточный домен белка Notch1 крысы (аминокислотные остатки 1749 — 2531) c c-myc эпитопом на C-конце (NICD-myc), EcoRI (обработан фрагментом Кленова) — NotI фрагмент кДНК NICD-myc клонировали из вектора pEgfp-N2-NICD-myc в вектор pShuttle-CMV по сайтам BglII (обработан фрагментом Кленова) и NotI. Вектор для продукции белков с C-концевым c-myc эпитопом (pEGFP-N2-myc) создавали на основе вектора pEGFP-N2 («Clontech») путем клонирования по сайтам BamHI-NotI двухцепочечных олигонуклеотидов, полученных путем гибридизации одноцепочечных олигонуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность c-myc эпитопа (5'-gatccgtcgacgagcaga agctgatctccgaggaggacctgtaagc-3' и 5'-ggccgcttacaggtcctcct cggagatcagcttctgctcgtcgacg-3'). кДНК NICD амплифи-цировали в ПЦР с праймерами 5'-gaattcgccaccatgaagcg caggcggcagcat-3' и 5'-gtcgaccttaaatgcctctggaatg-3' и клонировали в вектор pEGFP-N2-myc по сайтам EcoRI-SalI, получая вектор pEgfp-N2-NICD-myc. Для создания шаттл-вектора, кодирующего протеинкиназу Pak5 человека, слитую с Egfp, NheI (обработан фрагментом Кленова) — SmaI фрагмент кДНК Egfp-Pak5 клонировали из вектора pEgfp-C1-Pak5, описанного ранее [8], в вектор pShuttle-CMV по сайту BglII (обработан фрагментом Кленова). Для генно-инженерных манипуляций с плазмидами и получения плаз-мидной ДНК в препаративных количествах использовали штамм E. coli XL-1 Blue MRF' («Stratagene», США). Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli проводили с использованием набора GenElute Plasmid MiniPrep Kit («Sigma», США) в соответствии с протоколом производителя. Нуклеотидные последовательности всех амплифицированных в ПЦР кДНК верифицировали путем секвенирования ДНК с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в ЦКП «Геном» Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Россия.
Культивирование клеток E. coli. Клетки E. coli культивировали в жидкой среде Miller's LB broth (0,171 М
NaCl, 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт) («BD Bioscience», США) при +37 °С. Для заливки чашек Петри к среде LB добавляли бактериальный агар («BD Bioscience») до концентрации 1.5%. Клетки штамма E. coli BJ5183 («Agilent Technologies») культивировали в присутствии 30 мкг/мл стрептомицина, клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 — в присутствии 30 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл ампициллина, клетки штамма E. coli XL-1 Blue MRF' — в присутствии 12,5 мкг/мл тетрациклина. В работе использовали следующие реагенты: ампициллин натрия (ОАО «Синтез», Россия), канамицин сульфат (ОАО «Биохимик», Россия), тетрациклин гидрохлорид («Sigma»,США), стрептомицин (ОАО «Биохимик»).
Приготовление и трансформация химически компетентных клеток E. coli. Химически компетентные клетки штаммов E. coli BJ5183, E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и E. coli XL-1 Blue MRF' готовили в соответствии с протоколом, описанным в [9]. В частности, клетки соответствующих штаммов высевали на селективную чашку и растили в течение ночи. На следующий день ино-кулировали 10 мл ночной культуры среды LB без антибиотиков и растили в течение ночи. С утра переносили 2 мл ночной культуры в 200 мл среды LB без антибиотиков и растили в течение 3—4 ч до достижения оптической плотности 0,45—0,55 при длине волны 600 нм. Клетки охлаждали на льду в течение 2 ч и центрифугировали при 2500 g в течение 15 мин при +4 °С. Осадок ресушендировали в ледяном буфере (40 мМ натрия ацетат pH=5,5, 100 мМ CaClj, 70 мМ MgCl2) и инкубировали на льду в течение 45 мин. Далее клетки осаждали центрифугированием при 1800 g в течение 10 мин при +4 °С, осадок ресуспендирова-ли в буфере (40 мМ натрия ацетат pH=5,5, 100 мМ CaCl2, 70 мМ MgClj, 15% глицерин), суспензию клеток разливали в аликвоты по 100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при —80,°С. Трансформацию химически компетентных клеток E. coli проводили, как описано в [9]. В частности, к аликвоте компетентных клеток добавляли 3 мкл диметилсульфокси-да, перемешивали, добавляли плазмидную ДНК, перемешивали и инкубировали на льду в течение 30 мин. Для проведения теплового шока клетки помещали на 50 с в водяную баню (+42 °С), потом быстро переносили в лед и инкубировали на льду 1 мин. Далее суспензию клеток переносили в 1 мл среды LB без антибиотиков и инкубировали клетки при интенсивном перемешивании при +37 °С в течение 1 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием (30 с, 16 000 g), отбирали часть супернатанта и высевали клетки на предварительно прогретые до +37 °С чашки с LB агаром, содержавшим соответствующие антибиотики.
Культуры клеток. Клетки линии HEK293 (European Collection of Cell Cultures, #85120602) культивировали в среде DMEM («HyClone», США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («HyClone»), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина («Gibco»,
США). Для трансфекции клеток линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмидой использовали реагент EcoTransfect («OZ Bioscience», Франция).
Получение рекомбинантных аденовирусов. Ре-комбинантные аденовирусные плазмиды, выделенные из клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, трансформировали в клетки E. coli XL-1 Blue MRF' и выделяли плазмиды в препаративных количествах. Далее, начиная с этапа линеаризации рекомбинантной аденовирусной плазмиды и трансфекции упаковочной клеточной линии HEK293, аденовирусы получали в соответствии с опубликованным протоколом [3]. В частности, 5 мкг рекомбинантной аденовирусной плазмиды линеаризовали с использованием 5 ед. эндонуклеазы рестрикции PacI («ThermoFisher Scientific», #ER1342) в течение 3 ч в реакции объемом 100 мкл при +37 °С, после чего добавляли 10 мкл 3М ацетата натрия pH=5,2 и 275 мкл этанола, перемешивали, инкубировали 20 мин при —20 °С, центрифугировали 10 мин при 14 000 g, промывали осадок два раза 70% этанолом, ресуспендировали в 40 мкл стерильной воды и использовали для трансфекции. Далее клетки линии HEK293 рассевали в количестве 1,4'106 клеток на 60-мм культуральную чашку и на следующий день трансфицировали, используя 4 мкг линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмиды. Клетки культивировали в течение 15 (аденовирус NICD-myc), 17 (Egfp-Pdcd4) или 22 дней (Egfp-Pak5), каждые 2—3 дня добавляя к клеткам по 1 мл свежей среды. Далее собирали первичный вирусный сток, для выхода вируса клетки разрушали за счет двух циклов замораживания-оттаивания, после чего проводили три раунда амплификации аденовирусов и инфицирование клеток линии HEK293 вирусным стоком с предыдущего этапа (1 раунд: 3-106 клеток на 60-мм культу-ральной чашке; 2 раунд: 7-106 клеток на 100-мм куль-туральной чашке; 3 раунд: 7106 клеток на пяти 100-мм культуральных чашках). После последнего раунда амплификации аденовирус разливали в аликвоты и хранили при —70 °С.
Вестерн-блот анализ. Вестерн-блот анализ образцов проводили, как описано в [10], с использованием следующих антител: мышиные моноклональные к c-myc эпитопу, клон 9E10 («Sigma», #M5546, разведение 1:2000); мышиные моноклональные к а-тубули-ну, клон DM1a, («Sigma», #T9026, разведение 1:5000), мышиные моноклональные к Egfp, клон 3A9, («Про-теинсинтез», Россия #PSM001, разведение 1:2000).
Результаты и обсуждение
В опубликованных протоколах создания рекомбинантных аденовирусов на основе системы AdEasy для трансформации клеток E. coli штаммов BJ5183 или E. coli BJ5183-pAdEasy-1 используется электропора-ция плазмидной ДНК, что обеспечивает высокую эффективность трансформации, до 1107 КОЕ/мкг плаз-
мидной ДНК при использовании коммерчески доступных электрокомпетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [2—4]. В ряде других работ сообщалось об использовании химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183 для получения рекомбинантных аденовирусных плазмид путем котрансформации линеаризованных шаттл-вектора и аденовирусной плазмиды [5, 6], без использования штамма, аналогичного штамму E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [4]. При этом проводили очистку шаттл-вектора из агарозного геля и переосаждение линеаризованной аденовирусной плазмиды перед котрансформацией [6] или оптимизацию соотношения количества шаттл-вектора и аденовирусной плазмиды [5]. Мы предположили, что протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид можно оптимизировать и упростить за счет использования химически компетентных клеток E. coli, приготовленных по одной из простейших методик, создания клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 для повышения эффективности гомологичной рекомбинации и отказа от очистки линеаризованного шаттл-вектора из агарозного геля перед трансформацией.
Сначала готовили химически компетентные клетки E. coli BJ5183 и трансформировали их плазмидой pAdEasy-1. Эффективность трансформации химически компетентных клеток E. coli BJ5183 составляла 3105 КОЕ/мкг плазмидной ДНК при использовании плазмиды pAdEasy-1 (33.4 т.п.н.). Обычно подобная эффективность считается недостаточной для использования компетентных клеток для генно-инженерных манипуляций, однако при трансформации очищенной плазмидной ДНК, и, учитывая большой размер плазмиды pAdEasy-1, подобная эффективность трансформации позволяет получить достаточное количество колоний на чашке для дальнейшего отбора и анализа корректных клонов. Далее, из нескольких колоний выделяли плазмиду pAdEasy-1 и анализировали ее с помощью эндонуклеаз рестрикции Bglli и Hindill. Клетки одного из клонов с корректным паттерном рестрикции плазмиды pAdEasy-1 (данные не показаны) использовали для приготовления глицеринового стока клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и далее готовили химически компетентные клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1.
Для получения рекомбинантных аденовирусных плазмид были созданы четыре шаттл-вектора, кодирующие слитые белки Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A, Egfp-Pdcd4 RBM12 D235A D418A, Egfp-Pak5 и NICD-myc. В ряде протоколов, включая протокол для коммерчески доступной системы AdEasy от компании «Agilent Technologies» («AdEasy XL Adenoviral Vector System Instruction Manual», Revision C1), указывается на необходимость очистки из агарозного геля шаттл-вектора после линеаризации [5, 6]. Однако было показано использование неочищенного линеаризованного шаттл-вектора для электропорации клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [4]. Мы решили использовать для
1 2
1 2
1 2 3
c-myc а-тубулин
Egfp
а-тубулин Egfp
а-тубулин
а
б
в
Рис. 1. Электрофоретический анализ потенциальных реком-бинантных аденовирусных плазмид, выделенных из клеток BJ5183-pAdEasy-1 после трансформации шаттл-вектором.
Показаны результаты гель-электрофореза в 0,9% ТАЕ-агарозном геле суперскрученной (а) и обработанной эндонуклеазой рестрикции PacI (б) плазмидной ДНК, выделенной из маленьких канами-цин-резистентных колоний (дорожки 1 — 10 на панелях а и б, на каждую дорожку нанесено 140—200 нг плазмидной ДНК). Панель а: дорожка 11 — плазмида pAdEasy-1 (250 нг), дорожка 12 — вектор pShuttle-CMV-Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A (250 нг). Положение фрагментов ДНК размером 3 и 4.5 т.п.н. указано стрелками. Слева указаны размеры фрагментов ДНК-маркера O'GeneRuler 1kb DNA Ladder («Thermo Fisher Scientific», США) (в т.п.н.).
Рис. 2. Вестерн-блот анализ лизатов клеток линии НЕК293, инфицированных рекомбинантными аденовирусами.
Клетки НЕК293 рассевали в количестве 1-105 в лунку 24-луночно-го планшета, на следующий день инфицировали аденовирусами, через 48 ч после инфекции получали клеточные лизаты и проводили Вестерн-блот анализ с использованием указанных антител. Клетки инфицировали аденовирусами для продукции белков (а) NICD-myc (дорожка 2), (б) Egfp-Pak5 (дорожка 2) и (в) Egfp-Pd-cd4 ЯВМ12 S457A и Egfp-Pdcd4 ЯВМ12 D235A D418A, дорожки 2 и 3 соответственно. Дорожка 1 во всех панелях — неинфициро-ванные клетки.
трансформации химически компетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1 неочищенный шаттл-вектор, обработанный фосфатазой для минимизации ре-циркуляризации шаттл-вектора в клетках E. coli. 1 мкг соответствующих шаттл-векторов линеаризовали с использованием 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MssI («ThermoFisher Scientific», #ER1342) в течение 2 ч в реакции объемом 50 мкл при +37 °С, после чего добавляли 1 ед. щелочной фосфатазы CIAP («Fermentas», #EF0341) и инкубировали еще 30 мин при +37 °С. Затем 5 мкл рестрикционной смеси (эквивалентно 100 нг плазмидной ДНК) трансформировали в химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и отбирали трансформантов на чашках, содержащих 50 мкг/мл канамицина. В результате трансформации на чашках ожидается формирование колоний двух типов: больших, выросших из клеток, трансформированных недорезанным или восстановленным в результате лигирования в клетках E. coli шаттл-вектором, и маленьких, вырастающих из клеток, в которых произошла рекомбинация между шаттл-вектором и плазмидой pAdEasy-1. Для оценки эффективности гомологичной рекомбина-
ции в клетках штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 при использовании предложенного нами протокола был проведен подсчет колоний двух типов. При этом было установлено, что при проведении реакций трансформации с использованием четырех созданных нами шаттл-векторов на чашках выросло в среднем 144±31 большая колония и 89±27 маленьких колоний. По 10 маленьких колоний с каждой из чашек были проанализированы на предмет наличия корректной рекомбинантной аденовирусной плазмиды с помощью анализа электрофоретической подвижности суперскрученной плазмидной ДНК (рис. 1, а) и с помощью эндонуклеазы рестрикции Pací (см. рис. 1, б). Как видно из рис. 1, а, 9 из 10 проанализированных клонов (кроме клона #7) с одной из чашек содержали рекомбинантную аденовирусную плазмиду. Анализ с помощью рестриктазы Pací выявил корректный паттерн рестрикции (наличие вырезаемых фрагментов ДНК размером 3 или 4.5 т.п.н.) для семи из девяти обнаруженных рекомбинантных плазмид (кроме клонов #2 и #4). Также был выявлен корректный паттерн рестрикции при анализе с помощью рестриктазы Hindíll (данные не показаны).
Таким образом, нами было установлено, что эффективность трансформации химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 неочищенным линеаризованным шаттл-вектором позволяет получить число маленьких колоний (890+270 в пересчете на 1 мкг линеаризованного шаттл-вектора), достаточное для идентификации корректной рекомбинантной аденовирусной плазмиды. Более того, нами было установлено, что химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 после года хранения при —80 °С сохраняют эффективность трансформации, достаточную для идентификации клонов, содержащих аденовирусную плазмиду с корректной рекомбинацией (данные не показаны).
Далее для проверки функциональности рекомбинантных плазмид получали аденовирусы в соответствии с опубликованным протоколом [3]. Проводили 3 раунда амплификации вирусных стоков, после чего инфицировали клетки HEK293 для проверки продукции соответствующих белков. На рис. 2 показаны результаты вестерн-блот анализа ли-затов клеток, инфицированных стоками аденовирусов для продукции белков Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A, Egfp-Pdcd4 RBM12 D235A D418A, Egfp-Pak5 и NICD-myc. Как видно, все полученные аденовирусы экс-прессируют кодируемые шаттл-векторами кДНК.
Таким образом, нами был предложен оптимизированный протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид на основе системы AdEasy, который не требует проведения электропорации и очистки линеаризованного шаттл-вектора. Нами было продемонстрировано эффективное получение рекомбинантных аденовирусных плазмид в результате трансформации химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1, приготовленных в лаборатории с помощью простой и доступной методики. Химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 сохраняют высокую эффективность трансформации на протяжении как минимум одного года, что позволяет быстро и эффек-
тивно создавать рекомбинантные аденовирусные плазмиды, используя единожды приготовленный запас компетентных клеток. Предложенный нами оптимизированный метод получения рекомбинантных аденовирусных плазмид основан на использовании химически компетентных клеток, создание которых доступно для практически любой молекулярно-биологической лаборатории и не требует дорогостоящих реактивов, специальных навыков или оборудования. Кроме того, показанная нами эффективность трансформации компетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, в отличие от ранее опубликованных протоколов [3, 5, 6], позволяет отказаться от проведения очистки из геля или переосаждения линеаризованного шаттл-вектора, что также существенно упрощает процедуру получения рекомбинантных плазмид. Оптимизированный нами протокол подтверждает возможность отказа от проведения электропорации, что делает создание рекомбинантных аденовирусов более доступным для широкого круга пользователей за счет отсутствия необходимости использования оборудования и расходных материалов для электропорации или приобретения высокоэффективных электрокомпетентных клеток. Валидность предложенного нами подхода была подтверждена успешным получением функциональных аденовирусов, экспрес-сирующих соответствующие рекомбинантные белки в клетках HEK293.
В работе была использована инфраструктура Центра коллективного пользования Института биологии гена Российской академии наук «Биология живой клетки и биомедицинские нанотранспортеры лекарств».
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты №16-04-00686 и №1604-00376).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
AMTEPATYPA/REFERENCES
1. Wold WS, Toth K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 2013;13:421-433.
2. He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J, Kinzler KW, Vogelstein B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:2509-2514.
3. Luo J, Deng ZL, Luo X, Tang N, Song WX, Chen J, et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2007;2:1236-1247.
4. Zeng M, Smith SK, Siegel F, Shi Z, Van Kampen KR, Elmets CA, et al. AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologous recombination. Biotechniques. 2001;31:260-262.
5. Miravet S, Ontiveros M, Piedra J, Penalva C, Monfar M, Chillon M. Construction, production, and purification of recombinant adenovirus vectors. Methods Mol Biol. 2014;1089:159-173.
6. Reddy PS, Ganesh S, Hawkins L, Idamakanti N. Generation of recombinant adenovirus using the Escherichia coli BJ5183 recombination system. Methods Mol Med. 2007;130:61-68.
7. Wedeken L, Ohnheiser J, Hirschi B, Wethkamp N, Klempnauer KH. Association of Tumor Suppressor Protein Pdcd4 With Ribosomes Is Mediated by Protein-Protein and Protein-RNA Interactions. Genes Cancer. 2010;1:293-301.
8. Cotteret S, Chernoff J. Nucleocytoplasmic shuttling of Pak5 regulates its an-tiapoptotic properties. Mol Cell Biol. 2006;26:3215-3230.
9. Titus DE. Promega Protocols and Applications Guide. USA. 1991.
10. Shepelev MV, Chernoff J, Korobko IV. Rho family GTPase Chp/RhoV induces PC12 apoptotic cell death via JNK activation. Small GTPases. 2011;2:17-26.
Поступила в редакцию 25.10.18 Received 25.10.18 После доработки 15.11.18 Revised 15.11.18 Принята к публикации 26.11.18 Accepted 26.11.18
