CC BY
94
УДК 578.226
Эффективный способ доставки гена интерлейкина-2 в гемопоэтические клетки человека с использованием рекомбинантного аденовируса с модифицированным фибером
В. Н. Рогожин1,2*, Д. Ю. Логунов1, Д. В. Щебляков1, М. М. Шмаров1, Е. Е. Ходунова3,
И. В. Гальцева3, Р. В. Белоусова2, Б. С. Народицкий1, А. Л. Гинцбург1
1ФГБУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18
2ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии
им. К.И. Скрябина, 109472, Москва, ул. Ак. Скрябина, 23
3ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, 125167, Москва,
Новый Зыковский пр., 4 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 01.07.2011 г.
РЕФЕРАТ Сконструирован рекомбинантный аденовирус человека серотипа 5 (Ad5/35F-IL2) с модифицированными фиберами, содержащими С-концевой кпоЬ-домен фибера аденовируса человека серотипа 35, и несущий ген рекомбинантного интерлейкина-2 человека. Благодаря модификации фиберов аденовирус способен эффективно доставлять генетическую информацию в клетки лейкоцитарной фракции красного костного мозга человека, а также в линии КО-1А (миелоцитарный лейкоз) и и937 (моноцитарный лейкоз) опухолевых клеток крови, в норме резистентных к инфекции аденовирусом человека серотипа 5. Методом проточной цитофлуориметрии установлено, что модифицированный Ad5/35F эффективно проникает в популяции моноцитов, гранулоцитов и бластных клеток красного костного мозга человека. Показана экспрессия интерлейкина-2 в CAR-негативных костномозговых лейкоцитах (3682.52 ± 134.21 пг/мл) и клетках линий КО-1А (748.3 ± 32.8 пг/мл) и и937 (421.5 ± 59.4 пг/мл), трансдуцированных Ad5/35F-IL2. Аденовирус с модифицированным фибером может использоваться в качестве вектора для эффективной доставки гена интерлейкина-2 человека в нормальные и опухолевые клетки гемопоэтического ряда.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аденовирусный вектор, псевдотипирование, интерлейкин-2, CD46, модификация кап-сида.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Ad - аденовирус человека; Ad5 - Ad серотипа 5; Ad35 - Ad серотипа 35; Ad5/35F - рекомбинантный Ad5 с модифицированными фиберами; УФ - ультрафиолетовое излучение; ККМ - красный костный мозг; ^2 - интерлейкин-2 человека; CAR - рецептор коксакивируса-аденовируса; а.о. - аминокислотный остаток; БОЕ - бляшкообразующая единица.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время векторы на основе аденовируса человека серотипа 5 (Ad5) входят в число наиболее часто используемых для доставки генов в клетки человека и млекопитающих. К преимуществам таких векторов относятся: их способность трансду-цировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки [1, 2]; аденовирусная ДНК не встраивается в геном клетки-хозяина и остается в экстрахромосомной форме; аденовирусы могут быть получены в титре более 1010 БОЕ/мл, что может позволить использовать их в качестве живых рекомбинантных вакцин;
обеспечение высокого уровня экспрессии целевого гена в клетке-мишени. Один из недостатков векторов на основе Ad5 - их низкая трансдуцирующая активность в отношении CAR-дефицитных и CAR-негативных клеток, среди которых важное место принадлежит клеткам гемопоэтического ряда. Эта проблема обусловлена тем, что для первичного взаимодействия Ad5 с клеткой необходимо связывание капсидного аденовирусного белка - фибера -с мембранным клеточным рецептором CAR (cox-sackievirus-adenovirus receptor). Поэтому дефицит или полное отсутствие этих рецепторов на поверхно-
сти клеток является фактором, лимитирующим эффективную доставку генов с помощью аденовекторов на основе Ad5.
Проблема решается с помощью генетической модификации фиберов аденовируса. Стратегия такой модификации заключается в псевдотипировании, т.е. замене фиберов или отдельных их доменов на фибе-ры или аналогичные домены аденовирусов других се-ротипов, использующих для связывания с клеточной поверхностью рецепторы, отличные от CAR. Такой подход впервые применили в 1996 г. Gall J. и соавт., которые получили Ad5, экспрессирующий фибер Ad7, и показали изменение тропизма вектора [3]. Krasnykh V. и соавт. [4] и Stevenson S. и соавт. [5] описали получение химерных Аd5-векторов, содержащих N-концевой и центральный домены фибера Ad5 и С-концевой домен фибера Ad3.
Для эффективной трансдукции клеток гемопо-этического ряда предложена замена фибера Ad5 на фибер Ad35 (Ad5/35F) [6]. Модификация обусловлена тем, что Ad5 и Ad35 для связывания с поверхностью клетки используют различные рецепторы. В случае Ad5 это CAR, а у Ad35 - молекула CD46 [7], высокий уровень экспрессии которой зарегистрирован на поверхности гемопоэтических клеток. Такие химерные аденовирусы способны эффективно трансдуцировать гемопоэтические [6], а также дендритные клетки человека [8].
Мы применили описанную модификацию фибера Ad5 для получения вектора, способного эффективно проникать в CAR-дефицитные гемопоэтические клетки с целью доставки в них гена интерлейкина-2 человека. Получение такого вектора расширяет возможности применения векторов на основе капсид-модифицированных аденовирусов человека, в частности в генной терапии лейкозов различной этиологии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Плазмидные векторы
pZ35 - плазмида, содержащая геном Ad5 с knob-доменом фибера Ad35, и pShuttle-CMV-IL2 - челночный вектор, содержащий ген интерлейкина-2 человека под контролем промотора цитомегало-вируса человека, сконструированы ранее в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи [9]; pShuttle-CMV-EGFP («Stratagene», США).
Вирусы и бактериальные штаммы
Рекомбинантный Ad5, экспрессирующий репортер-ный ген зеленого флуоресцирующего белка (Ad5-EGFP), рекомбинантный Ad5, экспрессирующий ген интерлейкина-2 человека (Ad5-IL2), полученные ра-
нее в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи [9, 10], Escherichia coli штаммы DH5a и BJ5183.
Клеточные линии
В работе использовали перевиваемые линии культур клеток человека: HEK-293 (клетки эмбриональной почки, трансформированные областью E1 генома Ad5), KG-1A (клетки миелоцитарного лейкоза), U937 (клетки моноцитарного лейкоза), а также первичную культуру лейкоцитов красного костного мозга (ККМ), полученную от здорового донора.
Получение рекомбинантных аденовирусов
Плазмидные конструкции, несущие полноразмерный геном аденовируса с модифицированным фибером (Ad5/35F) и целевым геном в составе генома, получали с использованием гомологичной рекомбинации в E. coli BJ5183. С этой целью клетки E. coli котранс-формировали парой плазмид: pZ35 и pShuttle-CMV-EGFP - для получения плазмиды с полноразмерным геномом Ad5/35F с репортерным геном зеленого флуоресцирующего белка (pAd5/35F-EGFP), и pZ35 и pShuttle-CMV-IL2 - для получения плазмиды с полноразмерным геномом Ad5/35F с геном интерлейкина-2 человека (pAd5/35F-IL2). Перед трансформацией плазмиды pZ35 и челночные векторы с целевыми генами (pShuttle-CMV-EGFP и pShuttle-CMV-IL2) линеаризовали рестриктазами PacI и PmeI соответственно. В челночных векторах целевые гены (EGFP и IL2) находились под контролем промотора цитомегаловируса человека. Рекомбинантные клоны анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного картирования. Рекомбинантные модифицированные аденовекторы Ad5/35F-EGFP и Ad5/35F-IL2 получали путем липофекции плазмидных конструкций (pAd5/35F-EGFP и pAd5/35F-IL2) в клетки пакующей линии HEK-293 с использованием реагента Metafectene Pro («Biontex», Германия) согласно прилагаемой методике. Рекомбинантные аденовирусы накапливали в клетках линии HEK-293 и детектировали по развитию характерного цитопатического эффекта. Присутствие целевых генов и модификацию фибера подтверждали методами ПЦР и рестрикционного картирования. Рекомбинантные модифицированные аденовирусы очищали и концентрировали ультрацентрифугированием лизатов зараженных клеток в градиенте плотности хлористого цезия. Концентрацию аденовируса в очищенном препарате определяли спектрофотометрически (^ = 260 нм), используя коэффициент пересчета 1 о.е. = 1.12 х 1012 вирусных частиц/мл. Титр аденовирусных препаратов определяли методом бляшкообразования на клетках линии HEK-293.
Fiber Ad5
371 381 391 401 411
...KAMVPKLGTG LSFDSTGAIT VGNKNNDKL TLWT TPAPSPN CRLNAEKDAK... shaft-домен knob-домен
Fiber Ad35
101 111 121 131 141
...NGLETQNNKL CAKLGNGLKF NNGDICIKDS IN TLWT GINP PPNCQIVENT...
shaft-домен knob-домен
Рис. 1. Аминокислотные последовательности С-концевых областей фиберов аденовирусов человека серотипов 5 и 35.
Определение физической стабильности модифицированных аденовирионов
Физическую стабильность модифицированных аденовирусов оценивали на модели Аd5/35F-EGFP, определяя его термостабильность, как описано ранее [11].
Трансдукция рекомбинантными аденовирусами линий KG-1A и Ш37 опухолевых клеток крови человека
Линии клеток KG-1A и и937 рассевали в 48-луноч-ные планшеты в концентрации 5 х 104 клеток на лунку. Клетки лейкоцитарной фракции ККМ человека, полученные от здорового донора, выделяли путем двойного центрифугирования в градиенте плотности коммерческого препарата Histopaque-1083 («Sigma-АЫпсЬ», Германия) согласно прилагаемой методике и рассевали в 48-луночные планшеты по 5 х 104 клеток на лунку. На следующий день клетки инфицировали рекомбинантными модифицированными аденовирусами Аd5/35F-EGFP и Аd5/35F-IL2, а также контрольными аденовирусами с фиберами вируса дикого типа и с аналогичными целевыми генами - Аd5-EGFP и Аd5-IL2, в дозе 5 х 103, 104 и 5 х 104 вирусных частиц на клетку.
Анализ эффективности проникновения аденовирусов в клетки и уровня экспрессии целевого гена
Эффективность проникновения рекомбинантных аденовирусов Аd5-EGFP и Аd5/35F-EGFP в клетки оценивали через 48 ч после заражения с помощью флуоресцентной микроскопии зараженных клеток по интенсивности флуоресценции EGFP.
Уровень экспрессии гена ^2 человека в клетках, инфицированных Аd5-IL2 и Аd5/35F-IL2, оценивали через 48 ч после заражения, определяя концентрацию IL2 в культуральной среде инфицированных клеток методом проточной цитофлуориметрии с использованием набора «FlowCytomix BenderMedsys-
tems» (Австрия) согласно прилагаемой методике. Концентрацию IL2 в образцах рассчитывали, используя программу Flowcytomix Pro 2.2.
Определение популяций лейкоцитов ККМ человека, эффективно трансдуцируемых модифицированным аденовирусом
Для определения популяций лейкоцитов ККМ человека, в которые способен проникать модифицированный аденовирус, клетки инфицировали Ad5/35F-EGFP в дозе 104 вирусных частиц на клетку. Через 24 ч после заражения методом проточной цитофлуо-риметрии с использованием флуоресцентно меченных антител против cD45 (общего лейкоцитарного антигена) определяли популяции лейкоцитов ККМ: моноциты, гранулоциты, Т- и В-лимфоциты, а также бластные клетки. Зараженные вирусом клетки детектировали по флуоресценции EGFP и соотносили с соответствующей популяцией лейкоцитов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5 с модифицированными фиберами
Первая технология получения рекомбинантного аденовируса Ad5/35F, описанная Shayakhmetov D.M. и соавт. [6], заключалась в замене центрального (shaft) и С-концевого (knob) доменов фибера Ad5 на аналогичные домены фибера Ad35. Для создания такого модифицированного вируса мы использовали новую технологию, основанную на замене лишь С-концевого knob-домена фибера Ad5 на knob-домен фибера Ad35, так как известно, что сайт связывания Ad35 с молекулой CD46 находится внутри knob-домена фибера [7]. С-Концевой knob- и центральный shaft-домены фиберов аденовирусов соединены короткой аминокислотной последовательностью, обеспечивающей относительную подвижность наиболее удаленного
Ad5
Ad5 shaft
pTLWT
knob Ad5 (178 a.o.)
Ad35 shaft
-tlwt -
О
knob Ad35 (187 a.o.)
Ad5 shaft i i. A( .|35
U (,8? a.o.)
Рис. 2. Схема модификации фиберов аденовируса человека серотипа 5 путем замены его С-концевого кпоЬ-домена на аналогичный домен фибера аденовируса человека серотипа 35.
от основания пентона кпоЬ-домена фибера. Большинство аденовирусов человека содержат в подвижной области между этими доменами консервативную последовательность - треонин-лейцин-триптофан-треонин (TLWT) [12]. На П-конце кпоЬ-домена фиберов Аd5 и Ad35 также находится эта последовательность (рис. 1).
Таким образом, для корректного соединения shaft-и кпоЬ-доменов фибера мы заменили кпоЬ-домен фибера Ad5 (178 а.о.) на кпоЬ-домен фибера Ad35 (187 а.о.) после последовательности TLWT (рис. 2), чтобы расширить тропизм вируса в отношении CD46-позитивных клеток.
Характеристика рекомбинантных модифицированных аденовирусов Ad5/35F
Рекомбинантные модифицированные аденовирусы Аd5/35F-EGFP и Аd5/35F-IL2 были охарактеризо-
Концентрация и титр рекомбинантных аденовирусов
ваны по следующим параметрам: концентрации вирусных частиц в препарате, титру аденовирусного препарата (таблица) и физической стабильности аденовирионов при нагревании (рис. 3). В качестве контроля использовали препараты немодифициро-ванных Ad5, содержащих экспрессирующие кассеты с генами EGFP (Ad5-EGFP) и ^2 человека (Аd5-IL2). Как видно из таблицы, концентрации и титры препаратов модифицированных аденовирусов сопоставимы с аналогичными показателями контрольных препаратов немодифицированных аденовирусов. Таким образом, модификация фибера аденовируса Ad5/35F не повлияла существенно на его репродукцию.
Так как введенная нами модификация фиберов аденовирусов могла каким-либо образом отразиться на физической стабильности аденовирионов, мы оценили устойчивость Аd5/35F-EGFP к нагреванию до +37 и +42°С в течение различного времени в сравнении с устойчивостью немодифицированного Аd5-EGFP. Показано, что термостабильность вирионов Аd5/35F-EGFP соизмерима с термостабильностью немодифицированных аденовирионов Аd5-EGFP. Прогревание образцов аденовирусов в течение 30 мин при +37°С не приводило к значимому снижению их инфекционности (рис. 3А). Инкубация аденовирусов при +42°С приводила к инактивации аденовирионов в обоих образцах - на 11-19% через 15 мин и на 2345% через 30 мин прогревания (рис. 3Б).
Данные о термостабильности аденовируса Аd5/35F-EGFP свидетельствуют о том, что представленная модификация фиберов аденовируса не влияет значительно на его физическую стабильность.
Вирус Концентрация, вирусные частицы/мл Титр, БОЕ/мл
Ad5-EGFP (4.82 ± 0.17) х 1012 (3.80 ± 0.83) х 1010
Ad5/35F-EGFP (2.54 ± 0.21) х 1012 (1.22 ± 0.34) х 1010
Ad5-IL2 (6.97 ± 0.19) х 1012 (5.85 ± 0.76) х 1010
Ad5/35F-IL2 (4.23 ± 0.17) х 1012 (2.12 ± 0.26) х 1010
Рис. 3. Термостабильность аденовирионов с модифицированными фиберами (Аd5/35F-EGFP) в сравнении с немодифицированными аденовирионами (Аd5-EGFP). А - Прогревание образцов аденовирусов при +37°С в течение 5, 15 и 30 мин. Б - Прогревание образцов аденовирусов при +42°С в течение 5, 15 и 30 мин. По оси абсцисс - условия прогревания, по оси ординат - относительная эффективность проникновения аденовируса в клетки НЕК-293, оцененная по флуоресценции EGFP, %.
Оценка эффективности доставки генетической информации аденовирусами Ad5/35F-EGFP и Ad5/35F-IL2 в гемопоэтические опухолевые клетки человека линий KG-1A и U937
Для оценки эффективности проникновения аденовирусов Ad5/35F-EGFP и Ad5/35F-IL2 в опухолевые клетки крови человека in vitro и определения уровня экспрессии целевых генов в трансдуцированных вирусом клетках были выбраны линии KG-1A (клетки миелоцитарного лейкоза) и U937 (клетки моноцитар-ного лейкоза), характеризующиеся низким уровнем экспрессии первичного аденовирусного рецептора CAR [13], но высоким уровнем экспрессии CD46 [14]. Множественность инфекции составляла 5 х 103, 104
и 5 х 104 вирусных частиц на клетку. Эффективность проникновения Аd5/35F-EGFP в клетки оценивали по количеству клеток, экспрессирующих репортерный ген EGFP и флуоресцирующих при УФ-облучении (X, = 395 нм). Показано, что благодаря модификации фибера модифицированный Аd5/35F-EGFP более эффективно, чем немодифицированный вирус, проникал в линии и937 и KG-1A опухолевых клеток гемопоэтического ряда (рис. 4). Полученные результаты согласуются с данными других авторов, изучавших эффективность проникновения модифицированного вируса Ad5/35F-EGFP в опухолевые клетки крови других линий [6] и в первичные клетки лимфоидного и миелоидного лейкоза [15].
Ad5-EGFP
Ad5/35F-EGFP
KG-1A
U937
Рис. 4. Эффективность проникновения модифицированного вируса Ad5/35F-EGFP в линии К^-1А и и937 опухолевых клеток крови человека через 48 ч после заражения.
800
700
600
500
400
300
200
100
0
1
з Ad5-IL2 Ad5/35F-IL2
KG-1A
U937
Рис. 5. Уровень экспрессии гена интерлейкина-2 человека в линиях К^-1А и и937 опухолевых клеток крови человека, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами, через 48 ч после заражения. По оси ординат - концентрация интерлейкина-2 в культуральной среде зараженных клеток, пг/мл.
Ad5-EGFP
Ad5/35F-EGFP
4000
3000
2000
1000
Рис. 6. Эффективность проникновения модифицированного вируса Ad5/35F-EGFP в лейкоциты ККМ человека через 48 ч после заражения.
Эффективность экспрессии гена интерлейкина-2 человека в использованных клеточных линиях, трансдуцированных рекомбинантным модифицированным аденовирусом Ad5/35F-IL2, оказалась значительно выше, чем в клетках, трансдуцированных немодифицированным Ad5-IL2 (рис. 5). Наибольшая концентрация IL2 отмечена в культуральной среде клеток линии KG-1A (748.3 ± 32.8 пг/мл), инфицированных Ad5/35F-IL2. Клетки линии U937, транс-дуцированные модифицированным аденовирусом, экспрессировали ген IL2 на уровне 421.5 ± 59.4 пг/мл. Клетки, трансдуцированные немодифицированным вирусом Ad5-IL2, экспрессировали следовые количества IL2.
Эти результаты согласуются с данными об уровне молекул CAR и CD46 - первичных рецепторов для адгезии Ad5 и Ad35, на поверхности исследованных клеточных линий. Известно, что клетки гемопо-этического ряда, в том числе клетки линий KG-1A и U937, являются CAR-негативными [13]. Поэтому вполне логично, что немодифицированные Ad5 практически не проникали в эти клетки, а экспрессия целевых генов в них детектировалась в следовых количествах. В то же время, благодаря высокому уровню экспрессии CD46 на поверхности клеток линий KG-1A и U937 [14] модифицированные Ad5/35F обладали повышенной способностью проникать в эти клетки, что обеспечивало высокий уровень экспрессии целевых генов в них.
Оценка эффективности доставки генетической информации в нормальные лейкоциты красного костного мозга (ККМ) человека рекомбинантными модифицированными аденовирусами
Модифицированный аденовирус Ad5/35F эффективно трансдуцирует CAR-негативные опухолевые клетки крови и обеспечивает экспрессию в них целевых генов, введенных в его геном, поэтому мы реши-
0 “ ™
к- Ad5-IL2 Ad5/35F-IL2
Рис. 7. Уровень экспрессии интерлейкина-2 в лейкоцитах ККМ человека, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами, через 48 ч после заражения.
ли определить эффективность доставки генетической информации аденовекторами - Ad5/35F-EGFP и Ad5/35F-IL2, в клетки лейкоцитарной фракции ККМ, полученного от здорового донора. Этот интерес объясняется возможностью использования модифицированного аденовируса в качестве вектора для эффективной селективной доставки генетической информации в гемопоэтические и иммунокомпетентные клетки человека ex vivo. Для этого лейкоциты, выделенные из образца ККМ здорового донора, транс-дуцировали модифицированными (Ad5/35F-EGFP и Ad5/35F-IL2) и немодифицированными (Ad5-EGFP и Ad5-IL2) аденовекторами в различных дозах. В результате было показано, что модифицированный вектор Ad5/35F-EGFP более эффективно, чем Ad5-EGFP, проникал в лейкоциты ККМ, о чем свидетельствует интенсивная флуоресценция 80% всех клеток, обусловленная экспрессией EGFP (рис. 6). При трансдукции клеток векторами с целевым геном IL2 в культуральной среде клеток, инфицированных модифицированным Ad5/35F-IL2, концентрация IL2 составила 3682.52 ± 134.21 пг/мл, что приблизительно в 30 раз превысило концентрацию IL2 в культуральной среде лейкоцитов, трансдуцированных немоди-фицированным Ad5-IL2 (рис. 7).
Учитывая, что клетки лейкоцитарной фракции ККМ содержат множество разнородных популяций клеток, мы решили определить популяции лейкоцитов, в которые эффективно проникает модифицированный аденовирус.
Лейкоциты ККМ были инфицированы модифицированным Ad5/35F-EGFP в дозе 5 х 104 вирусных частиц на клетку. Спустя 24 ч после заражения методом проточной цитофлуориметрии с использованием флуоресцентно меченных антител против общего
лейкоцитарного антигена - CD45, по распределению популяций лейкоцитов по размеру клеток и по уровню экспрессии антигена CD45, а также по флуоресценции инфицированных клеток, обусловленной экспрессией репортерного гена EGFP, были выявлены популяции клеток, эффективно трансду-цируемые модифицированным аденовирусом (рис. 8). Как и ожидалось, Ad5/35F-EGFP хорошо проникал в моноциты ККМ (32.66% EGFP-положительных клеток), что подтверждает ранее полученные данные [16], а также трансдуцировал гранулоциты (42.86% EGFP-положительных клеток) и бластные клетки (27.24% EGFP-положительных клеток), что показано впервые. В то же время эффективность проникновения модифицированного аденовируса Ad5/35F-EGFP в субпопуляции Т- и В-лимфоцитов ККМ человека была низкой (0.71% EGFP-положительных клеток). Данные об эффективной трансдукции модифицированным аденовирусом Ad5/35F-EGFP популяций моноцитов, гранулоцитов и бластных клеток согласуются с сообщениями о высоком уровне экспрессии CD46 в популяциях этих клеток [17]. Однако, несмотря на данные об уровне транскрипции гена CD46 в Т- и В-лимфоцитах, сравнимом с уровнем в клетках миелоцитарной ветви дифференцировки [17, 18], модифицированный аденовирус не проникал эффективно в лимфоциты. Возможно, этот факт может быть обусловлен специфической регуляцией экспрессии CD46 на уровне белка.
ВЫВОДЫ
С использованием оригинальной модификации, заключающейся в замене С-концевого кпоЬ-домена фибера Ad5 на аналогичный домен фибера Ad35, получен рекомбинантный Ad5, содержащий модифицированный фибер и несущий ген ^2 человека. На культурах линий KG-1A и и937 опухолевых клеток крови человека показано многократное увеличение эффективности проникновения этого вектора в клетки по сравнению с немодифицирован-ным вектором. В опытах по трансдукции первичной культуры лейкоцитов ККМ здорового донора впервые показано 30-кратное увеличение эффективности проникновения модифицированного вектора в сравнении с немодифицированным, что обеспечивает в них экспрессию гена интерлейкина-2 челове-
m
гм
о
00
00
Сй45-Су7
Рис. 8. Определение популяций лейкоцитов ККМ человека, эффективно трансдуцируемых рекомбинантным модифицированным аденовирусом Ad5/35F-EGFP. Зеленым отмечены инфицированные аденовирусом клетки (флуоресцирующие). А - Бластные клетки;
Б - гранулоциты; В - моноциты; Г - лимфоциты.
ка. Наряду с эффективной трансдукцией моноцитов ККМ [16] впервые показано, что модифицированный Ad5/35F эффективно трансдуцирует грануло-циты и бластные клетки ККМ человека, в то время как в субпопуляции Т- и В-лимфоцитов этот вектор не проникает.
Основываясь на результатах нашей работы, можно полагать, что полученный нами модифицированный аденовирус Ad5/35F-IL2 может использоваться в качестве вектора для эффективной доставки гена интерлейкина-2 человека и применения его в генной терапии лейкозов различного типа, а также для создания генно-инженерных вакцин, которые способны эффективно доставлять гены антигенов различных патогенов непосредственно в иммунокомпетентные клетки, в том числе и дендритные, являющиеся профессиональными антиген-презентирующими клетками [19]. •
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (ГК № 02.512.11.2320).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Tang D.C., Jennelle R.S., Shi Z., Garver R.I., Carbone D.P., Loya F., chang C.H., Curiel D.T. // Hum. Gene Ther. 1997. V. 8. № 17. P. 2117-2124.
2. Tang D.C., Johnston S.A., Carbone D.P. // Cancer Gene Ther. 1994. V. 1. № 1. P. 15-20.
3. Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L., Falck-Pedersen E. // J. Virol. І996. V. 70. № 4. P. 2116-2123.
4. Krasnykh V.N., Mikheeva G.V., Douglas J.T., Curiel D.T. // J. Virol. 1996. V. 70. P. 6В39-6В46.
5. Stevenson S.C., Rollence M., Marshall-Neff J., McClelland A. // J. Virol. 1997. V. 71. № 6. P. 47В2-4790.
6. Shayakhmetov D.M., Papayannopoulou Т., Stamatoyannopo-ulos G., Lieber A. // J. Virol. 2000. V. 74. P. 2567-2583.
7. Zhang Y., Bergelson J.M. // J. Virol. 2005. V. 79. № 19. P. 1212512131.
8. Melief C.J., Offringa R. // J. Immunol. 2001. V. 166. P. 5236-5244.
9. Shmarov M.M., Cherenova L.V., Shashkova E.V., Logunov D.Iu., Verkhovskaia L.V., Kapitonov A.V., Neugodova G.L., Doronin K.K., Naroditskii B.S. // Mol. Gen. Mikrobiol. Viru-sol. 2002. V. 2. P. 30-35.
10. Logunov D.Y., Zubkova O.V., Karyagina-Zhulina A.S., Shuvalova E.A., Karpov A.P., Shmarov M.M., Tutykhina I.L., Alyapkina Y.S., Grezina N.M., Zinovieva N.A., Ernst L.K., Gintsburg A.L., Naroditsky B.S. // J. Virol. 2007. V. 81. № 18. P. 9641-9652.
11. Рогожин В.Н., Белоусова Р.В., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Лунин В.Г., Народицкий Б.С. // Вет. медицина. 2011. № 2.
С. 10-13.
12. Guardado-Calvo P., Llamas-Saiz A.L., Fox G.C., Langlois P., van Raaij M.J. // J. Gen. Virol. 2007. № 88. Pt 9. P. 2407-2416.
13. Sakurai F., Mizuguchi H., Yamaguchi T., Hayakawa T. // Mol. Ther. 2003. V. 8. № 5. P. 813-821.
14. Gaggar A., Shayakhmetov D.M., Liszewski M.K., Atkinson J.P., Lieber A. // J. Virol. 2005. V. 79. № 12. P. 7503-7513.
15. Nilsson M., Ljungberg J., Richter J., Kiefer T., Magnusson M., Lieber A., Widegren B., Karlsson S., Fan X. // J. Gene Med. 2004. V. 6. № 6. P. 631-641.
16. Segerman A., Lindman K., Mei Y.F., Allard A., Wadell G. // Virology. 2006. V. 349. № 1. P. 96-111.
17. Christmas S.E., de la Mata Espinosa C.T., Halliday D., Buxton C.A., Cummerson J.A., Johnson P.M. // Immunology. 2006.
V. 119. № 4. P. 522-528.
18. Wang G., Liszewski M.K., Chan A.C., Atkinson J.P. // J. Immunol. 2000. V. 164. № 4. P. 1839-1846.
19. Wang H., Liu Y., Li Z., Tuve S., Stone D., Kalyushniy O., Shayakhmetov D., Verlinde C.L., Stehle T., McVey J., et al. // J. Virol. 2008. V. 82. № 21. P. 10567-10579.
