Мишень-специфичная доставка генов с помощью рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, способных эффективно связываться с наноантителами Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 578.233.22

Мишень-специфичная доставка генов с помощью рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, способных эффективно связываться с наноантителами

М. Н. Гарас1*, С. В. Тиллиб2, О. В. Зубкова1, В. Н. Рогожин1,3, Т. И. Иванова2, Л. А. Васильев2, Д. Ю. Логунов1, М. М. Шмаров1, И. Л. Тутыхина1, И. Б. Есмагамбетов1, И. Ю. Грибова1,

А. С. Банделюк1, Б. С. Народицкий1, А. Л. Гинцбург1

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи

Министерства здравоохранения РФ, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

2Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5

3Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии

им. К.И. Скрябина, 109472, Москва, ул. Акад. Скрябина, 23

*E-mail: [email protected]

Поступила в редакцию 23.10.2013

После доработки 08.04.2014

РЕФЕРАТ Существующие на сегодняшний день подходы по изменению тропизма генетических векторов требуют получения отдельного вектора для каждого целевого рецептора, что создает дополнительные временные и экономические затраты. В связи с этим большой интерес представляет универсальная векторная система, которая позволит специфически связывать на своей поверхности молекулы, обеспечивающие эффективную мишень-специфичную доставку («таргетинг»). В представленном исследовании предложен новый подход к получению таргетных носителей с использованием рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц (РПАН) на основе генома аденовируса человека серотипа 5 с модифицированным геном капсидного белка pIX (Ad5-EGFP-pIX-ER). Такие РПАН способны с высокой аффинностью связывать на своей поверхности соответственно модифицированные химерные наноантитела, специфически узнающие определенный антиген (раковоэмбриональный антиген, РЭА). Эффективное связывание наноантител (аСЕА-RE) с поверхностью капсидов РПАН доказано с помощью иммуноферментного анализа. Способность полученного вектора к таргетной доставке доказана в эксперименте с использованием опухолевых клеточных линий A549 и Lim1215, экспрессирующих РЭА. Показано, что Ad5-EGFP-pIX-ER, несущий на поверхности аСЕА-RE, в 3 раза более эффективно проникает в опухолевые клетки линий A549 и Lim1215 независимым от рецепторов коксаки- и аденовируса путем, чем немодифицированные РПАН и препарат Ad5-EGFP-pIX-ER без адсорбции наноантител на поверхности капсида. Полученный нами препарат РПАН Ad5-EGFP-pIX-ER представляет собой универсальную платформу, которая посредством специфического присоединения на поверхности РПАН молекул наноантител против определенного поверхностного антигена может обеспечить доставку целевого гена в заданные клетки.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аденовирус, pIX, лейциновая молния, наноантитела, раковоэмбриональный антиген. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БОЕ - бляшкообразующая единица; РЭА - раковоэмбриональный антиген; Ad -аденовирус человека; Ad5 - Ad серотипа 5; CAR - коксакивирусный и аденовирусный рецептор; а.о. - аминокислотный остаток, при числе.

ВВЕДЕНИЕ ки генетической информации в клетки млекопита-

Препараты рекомбинантных псевдоаденовирусных ющих. РПАН широко используются для разработ-

частиц (РПАН), полученные на основе генома адено- ки рекомбинантных вакцин и генотерапевтических

вируса человека серотипа 5 (Ad5) с делецией обла- средств [1, 2]. Безопасность РПАН подтверждена це-

сти, ответственной за репликацию, рассматриваются лым рядом клинических испытаний различных вак-

как одни из наиболее перспективных средств достав- цинных и терапевтических препаратов на основе ге-

нома Ad5. С 2008 года в одной четверти клинических испытаний по генной терапии исследуются РПАН на основе Ad [3]. Кроме того, в Китае уже разрешены два препарата на основе Ad5. Такая популярность объясняется целым рядом преимуществ: векторы на основе Ad5 способны трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки; ДНК аденовируса не интегрируется в геном клетки-хозяина и остается в экстрахромосомной форме; РПАН могут быть получены в титре более 1010 БОЕ/мл, что может позволить использовать их в качестве живых рекомбинантных вакцин; РПАН обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого гена в клетке-мишени.

Однако следует отметить, что существует ряд ограничений для применения РПАН на основе Ad5. Например, низкая эффективность трансдукции некоторых типов клеток млекопитающих, в частности опухолевых клеток человека. Это связано с тем, что первичный рецептор Ad5 - коксаки- и аденовирусный рецептор (CAR) - экспрессируется не на всех типах клеток [4-6]. Для таргетной доставки генов в CAR-дефицитные и CAR-негативные клетки разработаны технологии модификации белков капсида Ad5 (отростка пентона, гексона, pIX, pIIIa). На сегодняшний день существуют стратегии, которые позволяют направлять РПАН на основе Ad5 в клетки различного типа, например в клетки рака шейки матки, глиомы, почечно-клеточного рака, рака яичника, а также в гладкомышечные клетки сосудов [7-12].

В последнее время в качестве мишени для встраивания белковых лигандов в капсид аденовируса большой интерес вызывает минорный капсидный белок IX (pIX). Преимущества его модификации - возможность встраивания на С-конец относительно крупных пептидных фрагментов; высокая структурная совместимость pIX со встраиваемыми лигандами и широкий спектр возможных направлений использования аденовекторов с модификацией pIX [13].

Недавно было показано, что введение в структуру pIX RGD-мотива (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота) позволяет увеличивать эффективность связывания РПАН на основе Ad5 с клетками, экспрессирующими а Р-интегрины [14]. Получены также РПАН, несущие на С-конце pIX одноцепочечный Т-клеточный рецептор (TCR) против ассоциированного с меланомой антигена в комплексе с HLA I (главный комплекс гистосовместимости), способные эффективно трансдуцировать клетки меланомы человека [15].

Следует отметить, что существующие на сегодняшний день подходы по модификации pIX требуют получения отдельного препарата РПАН для каждого целевого рецептора, что создает дополнительные временные и экономические затраты. В связи с этим

большой интерес представляет получение универсальной технологической платформы на основе РПАН, которая позволит специфически связывать на поверхности капсида аденовируса молекулы, обеспечивающие эффективную мишень-специфичную доставку (таргетинг).

Для разработки такой универсальной платформы были получены РПАН, несущие на С-конце р1Х особый синтетический домен EE12RR345L (ER-домен), способный с высокой эффективностью гетеродиме-ризоваться с доменом-партнером - RR12EE345L (RE-домен) с образованием стабильной структуры (лей-циновой молнии). Эти синтетические домены были получены ранее генно-инженерным путем на основе соответствующего домена из белка, связывающегося с геном вителлогенина (VBP) [16, 17]. Каждый из двух указанных 43-аминокислотных доменов не способен гомодимеризоваться даже при низких температурах (от 6°С и выше), но при этом способен к эффективной гетеродимеризации при физиологических условиях с образованием стабильной структуры лейциновой молнии EE12RR345L/RR12EE345L (или ER/RE), которая имеет температуру плавления 73°С и константу диссоциации Kd = 1.3 х 10-11 M [17].

Следует отметить, что подход к модификации РПАН на основе Ad, весьма сходный с использованным в нашей работе, недавно уже был описан [18]. Однако в представляемой нами работе есть существенные отличия, касающиеся как модификации иного капсидного белка, так и использования другого формата антитела, а также способа получения комбинированного вектора.

Мы предлагаем использовать в качестве носителя ER-домена белок IX, так как количество мономеров pIX на капсиде Ad5 в 6 раз больше, чем мономеров отростка пентона, следовательно, и антител с РПАН будет связываться больше, что обеспечит более эффективное проникновение р1Х-модифицированных РПАН в целевые клетки.

В качестве молекулы, обеспечивающей таргетинг модифицированных РПАН к определенным клеткам, в данной работе применяли однодоменные антитела (наноантитела) к раковоэмбриональному антигену (РЭА, или CEA, cancinoembryonic antigen) (аCEA-RE). Выбор наноантител был обусловлен рядом их преимуществ, к которым, в частности, относятся простота всевозможных генно-инженерных модификаций, сниженный иммунный ответ, лучшая фармакокинетика, хорошая растворимость, устойчивость к изменениям рН-среды и высокая термостабильность. Выбор наноантител к РЭА обусловлен высокой частотой встречаемости данного рецептора на опухолевых клетках. Важным фактором выбора именно наноантител стал имеющийся у нас опыт по их получению и использо-

ванию, в том числе с введением в их состав гомотриме-ризующегося домена изолейциновой молнии [19, 20], а также по использованию РПАН для экспрессии наноантител in vivo [21, 22].

Использованные аCEA-RE способны эффективно узнавать антиген РЭА, в повышенном количестве представленный на поверхности опухолевых клеточных линий A549 и Lim1215. В данной работе показано, что pIX-модифицированные РПАН ^d5-EGFP-pIX-ER), несущие на своей поверхности наноантитела аCEA-RE, в 3 раза более эффективно проникают в опухолевые клетки линий A549 и Lim1215 CAR-независимым путем, чем немодифицированный РПАН ^d5-EGFP) и препарат Ad5-EGFP-pIX-ER (без присоединения наноантител на поверхности капсида). Полученная нами векторная система Ad5-EGFP-pIX-ER представляет собой универсальную платформу, которая посредством специфического присоединения на поверхности РПАН молекул наноантител против определенного (опухолеспецифического) поверхностного антигена может обеспечить доставку нужного гена в заданные (опухолевые) клетки.

эКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Плазмидные векторы

В работе использовали плазмидный вектор pBluescript II SK (+) (Fermentas MBI, Литва), плаз-мидную систему pGEM-T-Easy (Promega, США); челночный вектор pShuttle-CMV-EGFP, содержащий промотор цитомегаловируса (CMV), репортерный ген зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и фрагменты генома Ad5, плазмиду pAdEasy-1 (Stratagene, США).

Препараты РПАН и бактериальные штаммы

РПАН Ad5-EGFP, содержащие полноразмерный геном аденовируса Ad5 и кассету экспрессии с репортерным геном зеленого флуоресцентного белка под контролем промотора цитомегаловируса, получены ранее в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи [23].

В работе использовали клетки Escherichia coli штаммов DH5a и BJ5183.

Клеточные линии

В работе использовали следующие линии клеток: HEK293 (клетки почки эмбриона человека, несущие Е1-область Ad5), А549 (аденокарцинома легкого человека), H1299 (немелкоклеточный рак легкого человека), H460 (рак легкого человека), H292 (мукоэпи-телиоидная карцинома легкого человека), Lim1215 (аденокарцинома толстой кишки человека), SW480 (аденокарцинома толстой кишки человека), HCT-116

(рак толстой кишки человека). Клетки культивировали в среде DMEM (минимальная среда Игла, модифицированная Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят производства Hyclone (США), глутамина, пенициллина и стрептомицина.

Ферменты

Специфические эндодезоксирибонуклеазы рестрикции, ДНК-лигаза фага Т4 и другие ферменты получены от фирм Promega (США), New England BioLabs (США), Fermentas MBI (Литва).

Конструирование плазмид, кодирующих последовательности ER- или RE-доменов лейциновой молнии

Гетеродимеризующиеся последовательности ER-или RE-доменов [17, 18] клонировали с помощью ПЦР (рис. 1) с использованием праймеров, представленных в таблице. При амплификации с парой праймеров ER1F и ER1R (для ER-домена) или RE1F и RE1R (для RE-домена) был получен ПЦР1-продукт размером 97 п.н. (ПЦР1). При амплификации с праймерами ER2F и NotI-Cend-Zipper-rev (для ER-домена) или RE2F и NotI-Cend-Zipper-rev (для RE-домена) получен ПЦР2-продукт из 71 п.н. (ПЦР2). В следующей ПЦР в качестве праймеров использовали ПЦР1- и ПЦР2-продукты и получили ПЦРЗ-продукт из 154 п.н., содержащий последовательность ER-или RE-доменов лейциновой молнии. Этот фрагмент затем встроили по сайтам XhoI и NotI в плазмидный вектор pBluescript II SK (+) и получили соответственно плазмиды рER и рRE, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные гетеродимеризующиеся домены. Правильность полученных последовательностей проверяли секве-нированием. Для удобства клонирования (введения на 5'-конец последовательности XhoI-сайта) третий нуклеотидный остаток G исходной последовательности заменяли на C, аминокислотная последовательность при этом полностью сохранялась.

Конструирование плазмиды, несущей геном Ad5 с делецией Е1-области, кассету с геном EGFP и гетеродимеризующуюся последовательность лейциновой молнии на С-конце pIX

Для введения ER-домена на С-конец pIX была синтезирована последовательность (ЗАО «Евроген»), содержащая ген pIX с делетированным стоп-кодоном, спейсер (последовательность длиннейшей а-спирали аполипопротеина человека Е4 (33 а.о.)) [18], полилинкер с рестрикционными сайтами BamHI, Kpn2I, NotI, HindIII, AscI и SwaI для встраивания целевых лигандов и ген pIVa2 (от 1 до 832 п.н.). Эта последовательность была клонирована в плазмидный век-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Праймеры, использованные для ПЦР-клонирования ER- и RE-последовательностей

Название праймера Последовательность праймера

ER1F 5'-ccagaactegagatcgaggcagctttcctggaacgggagaacactgcactgg-3'

ER2F 5'-ccagcgtctgcggaaccgagtctcacagtatcgaactcgttacggacctctg-3'

ER1R 5'-tccgcagacgctggactcgctgccgcagttcagctacacgagtctccagtgcagtgttc-3'

RE1F 5'-ccagaactegagatccgtgcagctttcctgcgtcaacggaacactgcactgc-3'

RE2F 5'-ccagcgtctggagaacgaagtctcacagtatgaaactcgttacggacctctg-3'

RE1R 5'-tctccagacgctggacctcctgctccagttcagctacctcagtacgcagtgcagtgttc-3'

NotI-Cend-Zipper-rev 5'-cgtacgggtagcggccgctcagaggtccgtaacgag-3'

XhoI 1F

ПЦР-клонирование последовательности ER- (или RE-) домена ПЦР1

1R

|J | ПЦР2 2F NotI 1

ПЦР1-продукт

1 NotI-Cend-Zipper-rev

ПЦР2-продукт

ПЦР3 ПЦР1-продукт ПЦР2-продукт

, XhoI 1 1 NotI і

ПЦР3-продукт 1

XhoI NotI

Рис. 1. Схема последовательных стадий клонирования (ПЦР1, ПЦР2 и ПЦР3).

Для удобства клонирования (введения в 5'-конец последовательности XhoI-сайта) третий нуклеотидный остаток исходной последовательности заменяли с G на С, аминокислотная последовательность при этом полностью сохранялась

Последовательность ER- (или RE-) домена

тор pBluescript II SK. В результате была получена плазмида pBssk-pIX-mod, несущая ген pIX с сайтами для модификаций.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую ЕИ-домен, амплифицировали с помощью пары праймеров BamHI-zipp-forw (5'-gga-tcc-ctc-gag-atc-gag-gca-gct-ttc-c-3') и SwaI-zipp-rev (5'-аМЧаа-аМ-tac-aga-ggt-ccg-taa-cga-gtt-cg-3'), которые фланкировали 5'- и 3'-концевые участки лейциновой молнии и содержали сайты рестрикции ВатНІ и SwaI соответственно. В качестве матрицы использовали описанную выше плазмиду рЕИ. ПЦР-продукт размером 146 п.н. клонировали в плазмидный вектор pGЕM-T-Еasy. Плазмиду pGЕM-T-ЕR гидролизовали рестрик-

тазами ВатНІ и SwaI, последовательность, кодирующую лейциновую молнию, клонировали в плазмиду pBssk-pIX-mod по аналогичным сайтам рестрикции. Затем из плазмиды pBssk-pIX-ЕR по сайтам рестрикции АраІ и НраІ вырезали фрагмент аденовирусного генома, содержащий модифицированный ген pIX, и клонировали в вектор pShCMV-ЕGFP по аналогичным сайтам. В результате был получен челночный вектор pShCMV-ЕGFP-pIX-ЕR, кодирующий модифицированную последовательность рІХ с лейциновой молнией на С-конце и несущий кассету с репортерным геном EGFP. Данную плазмиду линеаризовали по РтеІ и котрансформировали вместе с плазмидой pAdЕasy-1 в клетки E. BJ5183

как описано в AdEasy Adenoviral Vector System (Stratagene, США). В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида pAd5-EGFP-pIX-ER, в состав которой вошли полноразмерный геном Ad5 с делецией Е1-области, экспрессионная кассета с репортерным геном EGFP и фрагмент, кодирующий лейциновую молнию на С-конце pIX.

Получение, накопление и очистка pIX-модифицированных РПАН

РПАН были получены в результате трансфекции клеток линии HEK293 плазмидой pAd5-EGFP-pIX-ER, предварительно линеаризованной по сайту рестрикции PacI. Трансфекцию проводили с помощью реагента Metafectene Pro (Biontex, Германия). Ad5-EGFP-pIX-ER накапливали в культуре клеток линии HEK293. Препарат РПАН очищали и концентрировали ультрацентрифугированием лизатов зараженных клеток в градиенте плотности хлористого цезия. Количество РПАН в очищенном препарате определяли спектрофотометрически (X = 260 нм), используя коэффициент пересчета 1 о.е. = 1.12 x 1012 вирусных частиц/мл. Титр препарата Ad5-EGFP-pIX-ER определяли методом бляшкообразования на культуре клеток HEK293.

Антитела

В работе использовали коммерческие анти-CAR-поликлональные антитела (R&D systems, США, cat. #AF3336), мышиные сыворотки, содержащие анти-Ad-антитела, полученные в результате иммунизации мышей препаратом РПАН, вторичные лошадиные антитела (GE Healthcare, Великобритания), анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США).

Получение аСЕА с дополнительным концевым RE-доменом

Получение однодоменных мини-антител (наноантител), узнающих раковый эмбриональный антиген ^CEA), проводили как описано ранее [24-28].

Двугорбого верблюда Camelus bactrianus иммунизировали последовательно (5 раз) путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фрейнда. В качестве антигена использовали белок РЭА человека (кат. номер R224) «Хема Медика» (Россия). Брали 0.26 мг белка для каждой инъекции. Вторую инъекцию (стадию иммунизации) проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в 2 недели проводили еще три иммунизации. Кровь (150 мл) забирали через 5 дней после последней инъекции. Далее из В-лимфоцитов вы-

деляли РНК, проводили синтез кДНК, двухступенчатую ПЦР и клонирование амплифицированных последовательностей, кодирующих наноантитела, в фагмидном векторе pHEN4. Процедуру селекции проводили методом фагового дисплея [24-28], в котором в качестве фага-помощника использовали бактериофаг M13KO7 (New England BioLabs, США), а в качестве антигена, иммобилизованного на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета, тот же препарат белка РЭА человека, что и для иммунизации. Отобранные методом фагового дисплея клоны кДНК, кодирующих наноантитела, клонировали в новый экспрессионный вектор, при этом к их З'-концу добавляли дополнительные последовательности-метки (таги), кодирующие НА и (His)6, с целью повышения эффективности детекции и очистки экспрессируемых наноантител. Специфичность и относительную аффинность исходно отбираемых наноантител определяли с помощью иммуноферментного анализа по связыванию с иммобилизованным белком РЭА человека, а затем и с фиксированными культуральными клетками, на поверхности которых должен сверх-экспрессироваться РЭА. В результате тестирования из нескольких вариантов было отобрано одно наиболее эффективно работающее наноантитело, анти-РЭА/аСЕА1. (Последовательность этого антитела, детали его получения и анализа описаны в недавно поданной заявке № 2012113421 на патент РФ: Тил-либ С.В. Однодоменное наноантитело aCEA1, специфически связывающее белок CEA.) Для того чтобы аСЕА1 могло образовывать стабильный комплекс с модифицированным pIX Ad5 (pIX-ER), его модифицировали далее, как описано ранее [20], но вместо гомотримеризующегося домена (ILZ) в данном случае добавляли домен RE, способный эффективно образовывать димер (лейциновую молнию) с ER-доменом. Схема аминокислотных доменов форматированного наноантитела аСЕА-RE показана на рис. 2Б. Наработанное в периплазме бактерий и очищенное, как описано ранее [20], наноантитело выявляется в виде индивидуальной полосы при электрофорезе в 14% SDS-полиакриламидном геле (рис. 3А).

Иммуноферментный анализ связывания лейциновых молний в составе pIX РПАН и в молекулах рекомбинантных наноантител

Поверхность лунок 96-луночного планшета сенсибилизировали раствором аСЕА-RE в 40 мM калий-карбонатном буфере (рН 9.6) из расчета 2 мкг антител на лунку. Сенсибилизацию проводили при +4°С в течение 12 ч. Затем планшет отмывали 3 раза 0.05% Твин-20 и 3 раза дистиллированной водой. Далее вносили раствор Ad5-EGFP-pIX-ER в концентрации 1 мкг/мл в рабочем буфере. В качестве контроля ис-

Л

MSTNS. . . PPNAV EETRARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYR GS LEIEAAFLEREN.

....— ■ у V ....

pIX Спейсер

GGATCC BamHI

...LEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPL*

Гетеродимеризующийся домен EE12RR345L (ER)

QVQLV. . . TVSS EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPE LEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQE.

анти-РЭА-домен Линейный домен («hinge», h)

(первичное наноантитело)

Гетеродимеризующийся домен RR12EE345L (RE)

...VQRLENEVSQYETRYGPL

SGRYPYDVPDYAGRGS НННННН* HA-таг His-таг

ER-домен —лейциновой молнии

___ Спейсер

I А

Гексон | Гексон pIX

— анти-РЭА

к=

Линейный

домен

RE-домен

лейциновой

молнии

»/V 11

Комплекс Ad5-EGFP-pIX-ER/aCEA-RE

Рис. 2. Схематическое изображение строения рекомбинантных наноантител, структуры pIX со спейсером и ER-доменом лейциновой молнии и образование комплекса Ad5-EGFP-pIX-ER/aCEA-RE с измененным тропизмом. Схема аминокислотных доменов рекомбинантного pIX (А) и полученного химерного наноантитела аСЕА-RE (Б). В - конфигурация комплементарных доменов лейциновой молнии, где один пришит к С-концу pIX Ad5 и экспонируется над поверхностью капсида за счет спейсера, а другой - к N-концу aСEA. Г - образование комплекса Ad5-EGFP-pIX-ER/aСEA-RE за счет гетеродимеризации ER- и RE-доменов лейциновых молний

Б

В

Рис. 3. Иммунофер-ментный анализ связывания наноантитела аСЕА^Е с белком РЭА. А - электрофоретический анализ в 14% SDS-полиакриламидном геле очищенного аСЕА^Е.

Б - иммунофермент-ный анализ связывания наноантитела аСЕА^Е с иммобилизованным белком РЭА человека. Наноантитела аСЕА^Е вносили в концентрации 100 и 10 нг/мл.

В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином. В - имму-ноферментный анализ связывания наноантитела аСЕА^Е с РЭА на поверхности опухолевых клеток

Л

М

кДа

35

25

5

I

un

0 -ч-ф у

1 ф 3

о

с

!_

о

С

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

aCEA-RE

i

un

о

■ч

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Иммобилизованы РЭА РЭА БСА

100

нг/мл

10 Контроль, нг/мл 100 нг/мл

aCEA-RE

SW480 Lim1215 A549 H1299 H460

H292 HEK293 HCT-116 CHO

(контроль)

Линии клеток

Б

В

0

пользовали Ad-EGFP. Планшет инкубировали в течение 1 ч при +37°С на шейкере, а затем отмывали. Вносили различные разведения мышиных сывороток в рабочем растворе (от 1 : 800 до 1 : 204800), содержащих анти-Ad-антитела. Смесь инкубировали (1 ч, +37°С) на шейкере, затем планшет отмывали и вносили антивидовые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, в рабочем разведении 1 : 10000 в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7.4 с 0.05% Твин-20. Реакцию проявляли TMB-индикаторной смесью. Для остановки реакции использовали 4 М H2SO4. Оптическую плотность окрашенного продукта пероксидазной реакции определяли на приборе iEMS Reader MF (Termo labsystems) при длине волны 450 нм.

Иммуногистохимический анализ связывания наноантител aCEA-RE с антигеном (РЭА) как очищенным, так и на поверхности клеток

Способность наноантитела аСЕА-RE связываться с иммобилизованным в лунках иммунологической

плашки белком РЭА человека проверяли с использованием стандартного протокола иммунофермент-ного анализа. Контролем служили лунки с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином (БСА). В качестве вторичных антител к НА-тагу на С-конце проверяемого наноантитела использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела. Активность перок-сидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованным БСА) не содержали антиген, далее они были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном).

Возможность применения полученного наноантитела для детекции РЭА, экспрессирующегося на поверхности опухолевой клетки, проверяли с помощью иммуноферментного анализа на иммобилизованных/

фиксированных клетках. Использовали следующие линии клеток: А549, H1299, H460, H292, Lim1215, SW480, HCT-116. Негативным контролем служили клетки линии HEK293 (происходящей из клеток эмбриональной почки человека), в которых, согласно опубликованным данным, белок РЭА не детектируется. Другим отрицательным контролем были клетки яичников китайского хомячка (СНО). Клетки рассевали на 96-луночный планшет по 104 клеток на лунку. На следующий день клетки 3 раза промывали раствором PBS и фиксировали в 3.7% растворе забуференного формальдегида в течение 1O мин. Фиксацию останавливали, добавляя раствор глицина до концентрации 125 мМ, фиксированные клетки промывали 3 раза раствором PBS, затем блокировали в растворе 1% БСА, 1 х PBS в течение 2 ч, после чего споласкивали 1 х PBS и добавляли раствор (1 х PBS, 0.1% БСА) с наноантителом aCEA-RE в концентрации 100 нг/мл. В качестве вторичных антител к НА-тагу на С-конце проверяемого наноантитела aСEA-RE использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела. Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS. Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованными клетками линии HEK293 и СНО) были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками.

Aнализ термостабильности р1Х-модифицированных PnAH

Культуру клеток HEK293 рассевали на 24-луночный планшет по 105 клеток на лунку. Через 24 ч монослой клеток инфицировали препаратом аденовируса (103 вирусных частиц на клетку в 200 мкл среды). Предварительно образцы инкубировали при +37 и +42°С в течение 5, 15 и 30 мин. Через 24 ч определяли количество флуоресцирующих клеток с помощью проточной цитофлуориметрии (Backman Coulter Cytomix FC-500, США).

Трансдукция препаратом PnAH эукариотических клеток с заблокированными CAR-рецепторами

Культуру клеток A549 и Lim1215 рассевали на 48-лу-ночный планшет по 2 х 104 клеток на лунку, затем добавляли анти-CAR-антитела в концентрации 10 мг/мл. Клетки инкубировали в течение 30 мин при +37°С, раствор антител удаляли, клетки промывали и трансдуцировали препаратами РПАН из расчета 500 вирусных частиц на клетку. Эти препараты предварительно инкубировали при +4°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании с aСEA-RE в соотношении одна вирусная частица на 240 молекул

антител. Не связавшиеся РПАН удаляли, через 24 ч после трансдукции определяли относительное количество флуоресцирующих клеток с помощью проточной цитофлуориметрии (Backman Coulter Cytomix FC-500, США).

результаты и обсуждение

Получение рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц с модифицированным белком IX

В 2009 году J.N. Glasgow и соавт. провели исследование. К С-концу отростка пентона Ad5 они «привязали» лейциновую молнию, с помощью которой капсид Ad5 был способен специфически связываться с одноцепочечными антителами, несущими комплементарную лейциновую молнию, благодаря чему РПАН меняли свой тропизм и обеспечивали целевую доставку гена [18]. Целью нашей работы было получение РПАН на основе Ad5, несущих последовательность лейциновой молнии на С-конце pIX. Мы предположили, что аналогичная модификация pIX позволит получить более эффективный вектор для доставки целевых генов. Это связано с тем, что на поверхности одного капсида Ad5 располагается 240 мономеров pIX и 36 мономеров отростка пентона, поэтому с р1Х-модифицированными РПАН будет связываться значительно больше антител, чем с аденовирусами с модификацией отростка пентона. Однако непосредственное присоединение какого-либо пептида может привести к созданию конформационных помех для сборки РПАН, так как С-конец pIX находится между расположенными рядом гексонами капсида [29]. Поэтому между C-концом pIX и лейциновой молнией в качестве спейсера мы ввели последовательность самой длинной а-спирали аполипопротеина человека Е4, которая, как показали J. Vellinga и соавт. [30], наиболее эффективна и при этом несущественно влияет на сборку Ad. Такой спейсер позволяет экспонировать лейциновую молнию над поверхностью капсида и таким образом повышать эффективность ее взаимодействия с рекомбинантными наноантителами (рис. 2) [30].

Рекомбинантный вектор Ad5-EGFP-pIX-ER, кодирующий pIX, содержащий на С-конце последовательность спейсера и ER-домен лейциновой молнии, получен с помощью гомологичной рекомбинации в E. coli.

Характеристика препарата РПАН Ad5-EGFP-pIX-ER

Полученный препарат РПАН Ad5-EGFP-pIX-ER был охарактеризован по следующим параметрам: концентрация вирусных частиц в препарате, кон-

центрация бляшкообразующих частиц в препарате, термостабильность.

Концентрация препарата Ad5-EGFP-pIX-ЕИ составила 6.5 х 1012 вирусных частиц/мл и 4.0 х 1010 БОЕ/мл. Концентрация контрольного вектора Ad5-EGFP - 6.3 х 1012 вирусных частиц/мл и 6.0 х 1010 БОЕ/мл. Полученные данные свидетельствуют о том, что внесенная в капсид аденовируса модификация не повлияла на эффективность сборки вирионов и на качество препарата, определяемое соотношением вирусных частиц и бляшкообразующих единиц (162.5 и 105 для Ad5-EGFP-pIX-ER и Ad5-EGFP соответственно).

Одна из проблем, связанная с модификацией кап-сидных белков Ad, - изменение стабильности получаемых РПАН. Основная функция р1Х заключается в стабилизации взаимодействий между соседними гексонами [31], а внесение модификаций в р1Х приводит к дестабилизации структуры капсида [32]. Поэтому мы проверили, влияет ли введение в структуру р1Х ER-домена лейциновой молнии на целостность структуры вирионов, сравнивая термостабильность модифицированного Ad5-EGFP-pIX-ER вектора с немодифицированным Аd5-EGFP.

Препараты РПАН Ad5-EGFP-pIX-ER и Ad5-EGFP инкубировали при 37 и 42°С в течение 5, 15 и 30 мин, затем определяли количество инфицированных клеток (рис. 4).

Инфекционность Аd5-EGFP-pIX-ER и Аd5-EGFP сохраняется при нагревании до +37°С в течение 5, 15 и 30 мин. При этом при нагревании до +42°С через 5 мин эффективность трансдукции Аd5-EGFP-pIX-ER снижается на 32%, а через 15 мин и более приближается к 0%, в то время как инфекционность Аd5-EGFP при тех же условиях через 5 мин полностью сохранилась, а через 15 и 30 мин снизилась на 20 и 43% соответственно. Полученные нами данные показывают, что введение ER-домена лейциновой молнии в структуру р1Х снижает термостабильность Аd5-EGFP-pIX-ER по сравнению с препаратом РПАН, содержащим р1Х дикого типа, однако они согласуются с опубликованными данными [33, 34].

Ф

-fr

I

чО

А

100

80

60

40

20

0

j t і і і

1 -

25

10 15 20

Время, мин Ad5-EGFP -^Ad5-EGFP-pIX-EP

Б

30

д,|5-Е^Р' лd;.-EGFP-pIл•-EP

Рис. 4. Термостабильность Ad5-EGFP-pIX-EP. Препараты Ad5-EGFP-pIX-EP и Ad5-EGFP инкубировали при 37°С (А) и при 42°С (Б) в течение 5, 15 и 30 мин. Затем клетки линии НЕК293инфицировали вирусами в количестве 103 вирусных частиц/клетку. Через 24 ч определяли количество флуоресцирующих клеток с помощью проточной цитофлуориметрии

Несвязавшиеся с наноантителами РПАН отмывали, образование комплекса Ad5-EGFP-pIX-ER/аСЕА-RE определяли с помощью анти-Ad-антител (рис. 5).

Таким образом, мы показали, что присутствие лей-циновых молний в составе Ad5-EGFP-pIX-ER и наноантител позволяет специфически адсорбировать рекомбинантные наноантитела на РПАН за счет взаимодействия гидрофобных сторон ER- и RE-доменов лейциновых молний.

0

5

Эффективность связывания ER-домена лейциновой молнии в составе р1Х РПАН с комплементарным RE-доменом лейциновой молнии на рекомбинантных наноантителах

Способность ER-лейциновой молнии в составе р1Х связываться с комплементарной ей последовательностью RE-лейциновой молнии на рекомбинантных анти-РЭА определяли с помощью ИФА. Лунки 96-луночного планшета высокой сорбции сенсибилизировали аСЕА-RE. После инкубации несвязавшиеся антитела отмывали и вносили Ad5-EGFP-pIX-ER.

Выбор линий клеток, на поверхности которых экспонирован РЭА, с которым может эффективно связываться полученное наноантитело аСЕА^Е

На следующем этапе работы мы определили способность наноантител аСЕА-ИЕ специфически связываться с РЭА - не только с выделенным, но и с экспонированным на клеточной поверхности.

На рис. 3Б представлен результат иммунофер-ментного анализа, из которого следует, что наноантитело аСЕА-ИЕ специфически связывается с иммобилизованным белком РЭА человека в концентрации

1.2

5

I

0 un ■ч ф у

1 ф 3

о

с

!_

о

С

Ad5-EGFP-pIX-ER + aCEA-RE Ad5-EGFP-pIX-ER

Ad5-EGFP + aCEA-RE Ad5-EGFP

Рис. 5. Имму-ноферментный анализ связывания Ad5-EGFP-pIX-ER с наноантителами аСЕА^Е

1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 1/204800

Разведения анти-Аd5-антитела

100 и 10 нг/мл. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином. Интенсивность сигнала (величина поглощения к = 405 нм) отражает эффективность связывания наноантитела.

Узнавание наноантителами изолированного РЭА еще не означает, что узнаваемый эпитоп этого белка будет доступен, когда этот белок локализуется на поверхности клетки. Возможность использования полученного наноантитела для детекции РЭА, сверхэкспрессированного на поверхности опухолевой клетки, проверяли с помощью сравнительного имму-ноферментного анализа на культурах клеток линий SW480, Lim1215, А549, Н1299, Н460, Н292, НСТ-116. В качестве негативного контроля использовали клетки линий НЕК293 и СНО. На рис. 3В представлены результаты иммуноферментного анализа.

Как и в случае изолированного белка РЭА, наноантитело аСЕА-ИЕ эффективно работает в концентрации 100 нг/мл. Специфическое узнавание клеток А549 и Lim1215 связано с повышенной экспрессией РЭА, который располагается на поверхности этих клеток. Напротив, в контрольных клетках НЕК293 белок РЭА практически не экспрессируется, и этому соответствует фоновое значение оптической плотности в соответствующих ячейках. Аналогично фоновый сигнал наблюдается и в случае контрольных клеток линии яичников китайского хомячка (СНО).

В результате анализа было показано, что рекомбинантное наноантитело аСЕА-ИЕ способно специфически взаимодействовать с двумя клеточными линиями - А549 и Lim1215. Эти линии клеток использовали

в дальнейших экспериментах по изучению эффективности трансдукции. На данный момент мы можем только предполагать, почему из семи проверенных клеточных линий только две специфически связывались с наноантителом. Это может быть обусловлено, например, с разной доступностью узнаваемого наноантителом эпитопа белка РЭА на поверхности клеток исследуемых линий, а также с потенциально возможной утратой РЭА на поверхности некоторых линий в результате бесконтрольного продолжительного культивирования.

Ad5-EGFP-pIX-ER, связанный с аСЕА^Е, способен к эффективной трансдукции опухолевых клеток CAR-независимым путем

На данном этапе работы мы оценили эффективность проникновения Ad5-ЕGFP-pIX-ЕR, связанного с аСЕА-ИЕ, в опухолевые клетки. В связи с тем, что на поверхности клеток А549 и Lim1215 содержится большое количество САИ-рецепторов [35], природных рецепторов Ad5, необходимо было их заблокировать. С этой целью клеточные линии А549 и Lim1215 инкубировали с анти-САИ-антителами в концентрации 10 мг/мл, а затем трансдуцировали Ad5-ЕGFP-pIX-ЕR, предварительно «нагруженным» анти-РЭА. В качестве контроля использовали Ad5-ЕGFP-pIX-ЕR (без анти-РЭА), Ad5-ЕGFP, а также Ad5-ЕGFP, «нагруженный» анти-РЭА (рис. 6).

Было показано, что Ad5-ЕGFP-pIX-ЕR, несущий на поверхности капсида аСЕА-ИЕ, в 3 раза более эффективно трансдуцирует клетки А549 и Lim1215 в условиях заблокированных САИ-рецепторов, чем

Рис. 6. Трансдукция опухолевых клеток Ad5-EGFP-pIX-ER. Клетки линий А549 (А) и Ыт1215 (Б) инкубировали с анти-CAR-антителами в концентрации 10 мг/мл в течение 30 мин при +37°С. После инкубации клетки заражали Ad5-EGFP-р!Х^ и Ad5-EGFP в дозе 500 вирусных частиц на клетку, предварительно инкубируемых в течение 30 мин при +4°С с аСЕА^Е в соотношении одна вирусная частица на 240 молекул антител. Количество транс-дуцированных клеток определяли с помощью проточной цитофлуо-риметрии

л

А549

%

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Б

100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0

Ad5-EGFP

Ad5-

EGFP+nAb

Ad5-EGFP-

pIX-ER

Ad5-EGFP-

pIX-ER+nAb

Незаблокированный CAR-рецептор ■ Заблокированный CAR-рецептор

Lim1215

К-

Ad5-EGFP

Ad5-

EGFP+nAb

Ad5-EGFP-

pIX-ER

Ad5-EGFP-

pIX-ER+nAb

■ Незаблокированный CAR-рецептор Заблокированный CAR-рецептор

препараты РПАН, не несущие на своей поверхности наноантител. Стоит отметить, что в культуре А549 только 40-60% клеток экспрессируют РЭА [36], поэтому можно предположить, что эффективность проникновения модифицированных РПАН в опухолевые клетки будет существенно больше при использовании наноантител против других опухолеспецифичных рецепторов либо других линий опухолевых клеток.

заключение

Получены р1Х-модифицированные РПАН на основе генома Ad5, несущие на поверхности капсида лей-циновые молнии. Доказана способность такого Ad5

адсорбировать на своей поверхности наноантитела, несущие комплементарную последовательность лей-циновой молнии. Показано, что РПАН с лейциновы-ми молниями, нагруженный аСЕА-ИЕ, в 3 раза более эффективно проникает в опухолевые клетки линий А549 и Lim1215 САИ-независимым путем, чем немо-дифицированный препарат Ad5-ЕGFP и Ad5-ЕGFP-р1Х-ЕИ без адсорбции наноантител на поверхности капсида.

Таким образом, опираясь на результаты нашей работы, можно полагать, что полученный нами вектор Ad5-ЕGFP-pIX-ЕR можно использовать в качестве универсальной платформы, которая посредством

специфического присоединения к поверхности РПАН молекул наноантител против определенного (опухолеспецифичного) поверхностного антигена может обеспечить доставку целевого гена в заданные (опухолевые) клетки. Вместо наноантител в принципе может быть использован любой другой соответственно адаптированный белок, обладающий свойством специфического узнавания интересующей исследователя мишени. •

Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (соглашение № 8779), а также частично поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН № 24 «Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов» (грант С.В.Т.).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bonnekoh B., Greenhalgh D.A., Chen S.H., Block A., Rich

S.S., Krieg Т., Woo S.L., Roop D.R. //J. Invest. Dermatol. 1998. V. 110. № 6. P. 867-871.

2. Benihoud K., Yeh P., Perricaudet M. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V. 10. № 5. P. 440-447.

3. The Journal of Gene Medicine. Clinical Trials Database. http://www.abedia.com/wiley/vectors.php

4. Zhang Y., Bergelson J.M. // J. Virol. 2005. V. 79. № 19.

P. 12125-12131.

5. Vindrieux D., Le Corre L., Hsieh T.J., Metivier R., Escobar P., Caicedo A., Brigitte M., Lazennec G. // Endocr. Relat. Cancer. 2011. V. 18. № 3. P. 311-321.

6. Sakurai F., Mizuguchi H., Yamaguchi Т., Hayakawa T. // Mol. Ther. 2003. V. 8. № 5. P. 813-821.

7. Breidenbach M., Rein D.T., Everts M., Glasgow J.N., Wang M., Passineau M.J. // Gene Therapy. 2005. V. 12. № 5. P. 187-193.

8. Korokhov N., Mikheeva G., Krendelshchikov A., Belousova N., Simonenko V., Krendelshchikova V., Pereboev A., Kotov A., Kotova O., et al. // J. Virol. 2003. V. 77. № 24. P. 12931-12940.

9. Terao S., Acharya B., Suzuki T., Aoi T., Naoe M., Hamada K., Mizuguchi H., Gotoh A. // Anticancer Res. 2009. V. 29. № 8.

P. 2997-3001.

10. Hiwasa K., Nagaya H., Terao S., Acharya B., Hamada K., Mizuguchi H., Gotoh A. // Anticancer Res. 2012. V. 32. № 8.

P. 3137-3140.

11. Hongju W., Han T., Belousova N., Krasnykh V., Kashentseva E., Dmitriev I., Kataram M., Mahasreshti P.J., Curiel D.T. // J. Virol. 2005. V. 79. № 6. P. 3382-3390.

12. Vigne E., Mahfouz I., Dedieu J.F., Brie A., Perricaudet M.,

Yeh P. // J. Virol. 1999. V. 73. № 6. P. 5156-5161.

13. Dmitriev I.P., Kashentseva E.A., Curiel D.T. // J. Virol. 2002. V. 76. № 14. P. 6893-6899.

14. Vellinga J., van der Heijdt S., Hoeben R.C. // J. Gen. Virol. 2005. V. 86. № 6. P. 1581-1588.

15. Davison E., Diaz R.M., Hart I.R., Santis G., Marshall J.F. // J. Virol. 1997. V. 71. № 80. P. 6204-6207.

16. Iyer S.V., Davis D.L., Seal S.N., Burch J.B. // Mol. Cell. Biol. 1991. V. 11. № 10. P. 4863-4875.

17. Moll J.R., Ruviniv S.B., Pastan I., Vinson C. // Protein Sci.

2001. V. 10. P. 649-655.

18. Glasgow J.N., Mikheeva G., Krasnykh V., Curiel D.T. // PLoS One. 2009. V. 4. № 12. P. 8355.

19. Тиллиб С. В. // Молекуляр. биология. 2011. Т. 45. № 1. С. 77-85.

20. Tillib S., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V.,

Saakyan S.A., Gribova I.Y., Tutykhina I.L., Sedova E.S., Ly-

senko A.A., Shmarov M.M., et al. // Antiviral Res. 2013. V. 97.

Р. 245-254.

21. Грибова И.Ю., Тиллиб С.В., Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. // Acta Naturae. 2011. Т. 3. № 3(10). С. бб-72.

22. Tutykhina I., Sedova E., Gribova I., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Lysenko A., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., et al. // Antiviral Res. 2013. V. 97. № 3.

Р. 318-328.

23. Shmarov M.M., Cherenova L.V., Shashkova E.V., Logunov D.U., Verkhovskaia L.V., Kapitonov A.V., Neugodova G.L., Doronin K.K., Naroditskii B.S. // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol.

2002. V. 2. P. 30-35.

24. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans

5., Robinson G., Hamers C., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. // Nature. 1993. V. 3б3. P. 44б-448.

25. Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. // Adv. Immunol. 2001. V. 79. P 2б1-29б.

26. Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans

5., Conrath K. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P 519б5-51972.

27. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermel-leh L., Gahl A., Backmann N., Conrath K., Muyldermans

5., Cardoso M.C., et al. // Nat. Methods. 200б. V. 3. № 11.

P. 887-889.

28. Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. Фингерпринт-ный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. // Acta Naturae. 2010. T. 2. № 3(б). C. 100-108.

29. Ghosh-Choudhury G., Haj-Ahmad Y., Graham F.L. // EMBO J. 1987. V. б. № б. P. 1733-1739.

30. Vellinga J., Rabelink M.J., Cramer S.J., van den Wollenberg D.J., van der Meulen H., Leppard K.N., Fallaux F.J., Hoeben R.C. // J. Virol. 2004. V. 78. № 7. P. 3470-3479.

31. Boulanger P., Lemay P., Blair G.E., Russell W.C. // J. Gen. Virol. 1979. V. 44. № 3. P. 783-800.

32. Mathis J.M., Bhatia S., Khandelwal A., Kovesdi I., Lokitz S.J., Odaka Y., Takalkar A.M., Terry T., Curiel D.T. // PLoS One. 2011. V. б. № 2. P. 1б792.

33. Campos S.K., Parrott M.B., Barry M.A. // Mol. Ther. 2004.

V. 9. № б. P 942-954.

34. Tang Y., Le L.P, Matthews Q.L., Han T., Wu H., Curiel D.T. // Virology. 2008. V. 377. № 2. P 391-400.

35. Davison E., Kirby I., Whitehouse J., Hart I., Marshall J.F., Santis G. // J. Gene Med. 2001. V. 3. № б. P 550-559.

36. Simpson H.D., Barras F. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 15.

P. 4б11-4б1б.